一、LCMV重组蛋白抗原应用研究（论文文献综述）
高明春[1]（2021）在《IL10在牛副流感病毒3型感染中的作用及其调控机制》文中进行了进一步梳理牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza 3 virus,BPIV3）是引起犊牛呼吸道感染的重要病原体之一,世界各国的牛群感染BPIV3的抗体阳性率通常在50%到90%之间。BPIV3可感染肺上皮细胞与肺泡巨噬细胞,发生组织损伤和免疫抑制,随后继发细菌感染导致严重的支气管肺炎。IL10（Interleukin10,IL10）是极少数具有强大的负调节功能的抗炎性细胞因子,上皮细胞、单核巨噬细胞等都是IL10发挥抑制性作用的靶细胞。许多病毒感染后依靠多种途径诱导宿主IL10表达来负调控宿主免疫应答,IL10负调控免疫应答的相关机制在HIV（Human immunodeficiency virus）、FMDV（Foot-and-Mouth disease virus）、LCMV（Lymphocytic choroid meningitis virus）、PCV2（Porcine circovirus type 2）、PRRSV（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus）等病毒的致病机制中发挥重要作用,BPIV3感染中IL10是否及如何调控免疫应答尚未清楚。本研究分离BPIV3流行毒株并分析其致病特征,证实BPIV3流行株能够感染牛与鼠的上皮细胞与单核巨噬细胞。建立小鼠呼吸道感染模型与鼠原代巨噬细胞感染模型。以小鼠与原代巨噬细胞的高通量转录组数据证实BPIV3可能利用IL10及其重要的下游产物SOCS3（Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3）下调宿主的抗感染免疫应答。随后开展了牛IL10、IL10R1、SOCS3的生物学活性与作用机制研究,证实牛IL10与IL10受体结合转导信号,激活JAK-STAT3通路来迅速高表达SOCS3,在小鼠与牛细胞上都具有类似的生物学活性。最终探索了BPIV3主要依赖My D88、p38 MAPK以及NF-κB信号通路来表达IL10,负调控宿主抗病毒应答并提高BPIV3复制能力的相关机制。本研究为阐明IL10/STAT3/SOCS3信号轴在BPIV3感染中的致病作用和抑制IL10通路防制牛呼吸道传染病奠定了理论基础。首先对2017年黑龙江省、河北省等地的群发犊牛肺炎1793份血清进行了BPIV3的抗体调查,结果表明近70%的犊牛呼吸道疾病可部分归因于BPIV3所参与的感染。随后自病牛鼻拭子中分离到了一株BPIV3,其具有感染MDBK、BHK21、BBEC、BL、BTB、BT、ML、PBMC、BMDM等牛与小鼠多种上皮细胞与单核巨噬细胞的能力。分离株经呼吸道感染小鼠肺脏并对其进行了致病性的分析,感染鼠肺脏发生病理变化,并且肺内病毒在12 d内不能够被完全清除,感染肺脏发生了多种炎性因子的表达,检测到重要的调节性抑炎性因子IL10在感染后的12 d之内,大多数检测时间点的转录均显着高于对照。通过高通量转录组测序、差异表达分析与基因富集及蛋白质相互作用网络分析,在小鼠与原代巨噬细胞感染BPIV3前后重要宿主免疫与调控分子的变化模式。BPIV3感染小鼠与感染巨噬细胞后,在感染早期显着上调了IL10与SOCS3表达,SOCS3几乎在所有分组中都得到了显着的转录激活。大多数组别中Tyk2、STAT1、STAT2、IRF7、ISG15、Mx1、RSAD2、PML等关键抗感染免疫基因被显着下调,IL10与SOCS3参与了BPIV3感染后抑制宿主抗病毒应答。为进一步研究牛IL10的信号转导以及其是否能发挥免疫负调控作用,克隆了牛IL10、牛IL10R1与SOCS3基因并分析其生物信息与进化保守性。对IL10、IL10R1胞外区与SOCS3进行了蛋白表达与纯化,并制备了相应的高效价抗体。采用腺病毒系统表达了牛IL10、IL10R1胞外区,然后在牛与鼠细胞上证实重组IL10可快速并强烈诱导SOCS3的表达,这种作用可以被IL10R1胞外区所抑制。IL10与SOCS3都具有抑制Ⅰ型干扰素及其下游分子表达的功能,即牛IL10与SOCS3可用于牛与鼠细胞的负免疫调控研究,而IL10R1胞外区可作为IL10通路的阻断剂。进一步探讨BPIV3感染中IL10参与负调控的相关机制,研究表明BPIV3以时间与剂量依赖性的方式诱导原代巨噬细胞与肺上皮细胞在感染极早期迅速上调IL10的m RNA并大量分泌IL10蛋白,同时TNF-α与Ⅰ型干扰素及其下游蛋白Mx1的表达受到了显着的抑制。IL10在原代巨噬细胞中的产量远高于上皮细胞,外源与内源性的IL10都可提高BPIV3的滴度。IL10R1胞外区作为游离的受体竞争掉IL10或抑制剂阻断IL10产生的通路都能降低病毒的复制能力。在My D88（Myeloid differentiation factor,MYD88）缺失与My D88抑制剂处理的BMDM细胞上,IL10/SOCS3的表达大幅降低,表明依赖My D88分子转导信号的通路在BPIV3感染过程中诱导IL10的表达起到了重要作用。此外,应用通路抑制剂证实NF-κB和p38 MAPK在BPIV3诱导IL10表达中为关键通路。JAK-STAT通路中的多种JAK与STAT分子均参与IL10与BPIV3之间复杂的调控作用。综上所述,BPIV3是我国犊牛传染性肺炎的主要病原之一,感染后可显着上调IL10与SOCS3的表达并引起宿主免疫抑制,主要下调以Ⅰ型干扰素及其下游分子介导的抗病毒应答,这种由IL10介导的负调控依赖于My D88、NF-κB和p38 MAPK信号通路。本研究可为进一步阐明BPIV3的分子致病机制与开发以调控IL10为靶标的免疫防控提供理论基础。
陈小燕[2]（2021）在《ETEC K99-SIgA复合物制备及其增强肠道黏膜免疫应答的研究》文中研究表明产肠毒素大肠杆菌（ETEC）是引起新生仔猪和断奶仔猪高发病率和高死亡率的重要病原之一,其中ETEC K99是已发现的新生仔猪病例最多的一种。黏膜免疫为机体免受病原菌ETEC攻击及保持肠道稳态发挥着重要作用。SIgA作为黏膜免疫的核心免疫球蛋白,具有阻止病原微生物黏附及免疫清除等作用。据文献报道,免疫复合物能够有效增强免疫应答,因此,本研究通过体外制备ETEC K99-SIgA免疫复合物,探究免疫复合物是否增强肠道黏膜免疫,从而更全面地认识SIgA在黏膜免疫应答中的复杂作用,为口服免疫复合物疫苗的设计奠定理论基础。本实验构建了pET-32a-K99/BL21原核表达载体,经1.2 m M的IPTG诱导6 h后,以Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化制备了重组蛋白K99;K99蛋白经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,制备鼠源K99多克隆抗体;以ETEC K99菌液口服感染BALB/c小鼠,获得含有特异性SIgA抗体的粪便上清,采用His pull-down方法制备ETEC K99-SIgA复合物,利用还原剂β巯基乙醇和SDS还原复合物后,Western blot鉴定制备的ETEC K99-SIgA复合物。结果表明重组蛋白K99在E.coli BL21中高效表达,纯化蛋白浓度约4.5 mg/m L;腹腔免疫后的小鼠血清能有效地与ETEC K99进行反应;ETEC K99菌液口服感染小鼠后,特异性SIgA抗体水平在感染后42 d达到高峰;鉴定正确的ETEC K99-SIgA复合物浓度约为2 mg/m L,为后续免疫学相关实验奠定物质基础。为了揭示ETEC K99-SIgA免疫复合物对激发黏膜免疫应答的影响,首先利用小肠袢试验检测K99-SIgA免疫复合物被肠道上皮细胞的什么细胞所摄取。然后建立M细胞体外培养模型,进一步揭示M细胞对K99-SIgA免疫复合物的摄取方式。最后以K99-SIgA复合物刺激DC细胞,探究其对DC成熟的影响;用ETEC K99-SIgA复合物刺激ETEC K99口服感染的小鼠脾淋巴细胞,采用ELISPOT检测细胞因子,CCK-8法检测脾T淋巴细胞增殖以及效应T细胞CTLL-2活性。小肠袢试验表明K99-SIgA免疫复合物主要由PP结M细胞摄取。采用抑制剂封闭相应的摄取通路,检测体外培养模型的M细胞摄取ETEC K99-SIgA复合物能力,结果表明K99-SIgA复合物主要以网格蛋白介导的方式被M细胞所摄取。K99-SIgA复合物能有效促进DC细胞成熟,从而增强其抗原呈递能力。ETEC K99-SIgA复合物刺激感染后的脾淋巴细胞,相比K99单独抗原组,能更有效地上调TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-5细胞因子分泌水平,促进小鼠脾T淋巴细胞及小鼠效应T细胞CTLL-2的增殖活化,揭示了ETEC K99-SIgA免疫复合物能有效地增强小鼠的黏膜免疫应答。本研究为免疫复合物口服疫苗的研制及应用提供了参考依据。
闫虎[3]（2020）在《鞭毛素蛋白调节肝内T细胞免疫应答的机制及应用》文中研究指明肝脏是人体内重要的代谢器官,也是一个独特的免疫器官。肝脏长期受到来自胃肠道食物抗原和多种细菌成分的刺激,倾向于诱导免疫耐受,以维持内稳态。这种免疫耐受主要由肝内实质细胞和非实质细胞通过多种分子机制共同介导。寄生虫、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）等嗜肝病原可能利用了肝脏这一特殊的免疫微环境形成慢性感染。肝脏慢性感染常常造成抗原特异性CD8+T细胞数量低下、功能耗竭。有研究表明,病原相关分子模式（PAMPs）能刺激和调节肝血窦内皮细胞（LSECs）、Kupffer细胞（KCs）,增强肝内CD8+T细胞应答从而帮助控制感染。鞭毛素蛋白是一种细菌来源PAMPs,能够识别并激活细胞表面的Toll-like receptor 5（TLR5）和细胞内的NLRC4炎症小体两条信号通路。我们推测鞭毛素蛋白可能作用于表达TLR5或炎症小体受体的肝内细胞,从而调节肝内免疫应答。本论文利用重组鼠伤寒沙门氏菌鞭毛素蛋白（Salmonella-derived recombinant flagellin,SF）测定了鞭毛素蛋白对肝细胞、LSECs或KCs等肝内多种细胞的影响,分析了鞭毛素蛋白对肝内CD8+T细胞的调节作用及其相关机制,并初步探究了鞭毛素蛋白在慢性HBV复制模型中潜在的抗病毒效应。一,肝内细胞与淋巴细胞体外共培养实验,测定SF对各种肝内细胞和CD8+T细胞的调节。我们发现SF能够以剂量依赖方式调节肝细胞,减弱肝细胞对T细胞功能的抑制,而不能通过调节LSECs和KCs发挥类似作用。这种调节作用依赖于肝细胞TLR5信号通路而不是NLRC4炎症通路的激活。TLR5通路激活的肝细胞能够促进CD8+T细胞CD25、CD44、CD69的表达和T-bet、Eomes转录因子的表达以及功能性细胞因子IFN-γ、TNF-α的分泌。进一步实验发现TLR5激活的肝细胞可直接调节多克隆CD8+T细胞的活化和细胞因子分泌,而不依赖于抗原提呈细胞（APCs）或CD4+T细胞的辅助,且对抗原特异性CD8+T细胞具有相同调节作用。总之,SF可激活肝细胞的TLR5信号通路,影响其免疫调节能力,进而促进CD8+T细胞的活化和功能。二,SF对小鼠肝内细胞的激活,对CD8+T细胞的调节,及其对急性HBV复制的影响。多次腹腔注射SF能够减弱肝细胞对T细胞功能的抑制效应,提高肝内CD8+T细胞的能量代谢相关蛋白表达,但对急性HBV复制和特异性T细胞应答没有明显影响。高压水动力（Hydrodynamic injection,HDI）尾静脉注射一次SF后第5-7天可测到小鼠肝内CD8+T细胞的活化改变和功能增强,且其功能增强与SF诱导的肝细胞免疫调节功能改变相关。此外,HDI注射SF能够一定程度抑制急性HBV复制,增强肝内病毒特异性CD8+T细胞应答。综上:SF体内注射可调节肝细胞免疫状态和肝内CD8+T细胞的活化与功能,并提高肝内病毒特异性CD8+T细胞的应答。三,利用慢性HBV复制小鼠模型评估SF在慢性HBV治疗方面的潜在作用。HDI注射SF仅短暂抑制HBV DNA,对病毒复制整体进程没有影响。进一步在慢性HBV复制小鼠过继CD8+T细胞发现:多次腹腔预注射SF能够抑制病毒复制并加快病毒清除;HDI预注射SF也能够抑制病毒复制并增加肝内抗原特异性CD8+T细胞的比例,但未能观察到对病毒清除速率的影响。上述结果提示:SF可通过调节肝内免疫微环境增强肝内抗原特异性CD8+T细胞的抗病毒功能,有利于慢性病毒感染的免疫控制。而给药方式、剂量及与免疫应答的配合有待进一步研究优化。综上所述,本论文通过体内外实验证明了鞭毛素蛋白能够调节肝细胞的免疫状态,进而调节肝内CD8+T细胞的应答,并且增强CD8+T细胞在慢性HBV治疗的效果。本研究初步阐明了鞭毛素蛋白调节肝内CD8+T细胞的效应及其细胞和分子机制,对于治疗慢性HBV感染具有一定的潜在应用价值。
马骏[4]（2020）在《基于金黄色葡萄球菌FnBPA和停乳链球菌GapC1-150的多表位疫苗免疫原性研究》文中研究表明金黄色葡萄球菌和链球菌是奶牛乳腺炎的重要致病菌,抗生素已经无法有效的防治金黄色葡萄球菌和链球菌感染。疫苗免疫接种已经成为防治金黄色葡萄球菌和链球菌感染的有效措施。研究表明,在金黄色葡萄球菌和链球菌感染过程中,细胞免疫应答和体液免疫应答均发挥重要作用。因此,有必要研究能够同时预防金黄色葡萄球菌和链球菌感染,且诱导细胞和体液免疫应答的多表位疫苗。金黄色葡萄球菌FnBPA和链球菌GapC高度保守,具有良好的免疫原性,本实验构建包含FnBPA和GapC1-150的CD4+T细胞表位和B细胞表位的多表位疫苗,并对其免疫原性进行了研究。用FnBPA CD4+T细胞表位FT(FnBPA488-505)和B细胞表位FB1(FnBPA352-364)、FB2(FnBPA763-772)构建表位疫苗FTB2、FB1B2和FTB1B2。免疫接种BALB/c小鼠,评价其免疫效力。结果,FTB1B2诱导的细胞因子水平显着高于其他表位疫苗,但低于FnBPA;诱导的IgG水平除低于FB1B2和FnBPA外、显着高于其他表位疫苗。FTB1B2免疫小鼠器官中的细菌定殖数显着低于其他表位疫苗、但高于FnBPA免疫小鼠。表明,多表位疫苗FTB1B2可以诱导较强的细胞和体液免疫应答,并有效地抑制金黄色葡萄球菌的定殖。用GapC1-150的CD4+T细胞表位GT(GapC63-77)和B细胞表位GB1(GapC30-36)、GB2(GapC97-103),构建表位疫苗GTB1、GB1B2和GTB1B2。免疫接种BALB/c小鼠后分析其免疫原性。结果,GTB1B2诱导的细胞因子水平及IgG水平显着高于其他表位疫苗免疫组,但显着低于GapC1-150免疫组。GTB1B2免疫组小鼠脏器中的停乳链球菌定殖数显着低于其他免疫组,但显着高于GapC1-150免疫组。表明,多表位疫苗GTB1B2可以诱导强烈的细胞和体液免疫应答及良好的抗停乳链球菌感染的免疫保护作用。串联FTB1B2与GTB1B2、FT与GT,构建表位疫苗FG和FGT,免疫BALB/c小鼠,评价其免疫效果。结果,FGT仅能诱导细胞免疫应答,免疫小鼠不能显着抑制金黄色葡萄球菌和停乳链球菌在器官中定殖;FG诱导的细胞因子水平及IgG水平虽然显着高于其他免疫组,但显着低于FTB1B2和GTB1B2;其免疫小鼠各器官细菌定殖数显着低于其他免疫组,显着高于FTB1B2和GTB1B2,但能够同时抑制金黄色葡萄球菌和停乳链球菌在各器官的定殖。上述结果表明,表位疫苗中的T细胞表位和B细胞表位共同抵御金黄色葡萄球菌和链球菌感染,本实验构建的FG表位疫苗能够诱导良好的免疫应答,并能同时抑制攻毒小鼠器官中金黄色葡萄球菌和停乳链球菌的定殖。
李志琴[5]（2019）在《LAG3干扰寡核苷酸作为重组蛋白疫苗和灭活流感病毒疫苗佐剂的研究》文中研究说明淋巴细胞活化基因-3（Lymphocyte activation gene-3,LAG3）是表达在T细胞表面的抑制性受体（Inhibitory receptor,IR）。T细胞表达多种IRs,如T淋巴细胞相关抗原4（T-lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4）和程序性死亡蛋白1（programmed cell death protein-1,PD-1）等,来避免由于免疫反应的失控导致的免疫细胞过度活化、调节免疫反应的持续时间和幅度、维持免疫耐受、避免组织损伤和自身免疫病的发生。但是IRs持续性的高表达,可抑制T细胞功能,导致T细胞的无应答,无法发挥免疫作用。靶向封闭IRs,使T细胞恢复活性已被证明可显着增强抗病毒和抗肿瘤的免疫反应,这些IRs也因此被称为免疫检查点（immune checkpoint）。目前,靶向性封闭CTLA-4、PD-1或其配体PD-L1的治疗手段已经应用于临床治疗多种肿瘤,这表明了阻断T细胞抑制性信号用于疾病治疗的可行性。但是仍有很多患者未从这些药物中获益,因此仍然需要更多靶向各种类型免疫检查点的研究。LAG3也是一种免疫检查点,当其与MHCⅡ结合时可直接抑制T细胞活化的第一信号,负性调控T细胞的功能。靶向封闭LAG3可通过抑制LAG3传导的抑制信号,显着增强T细胞活性,进而提高免疫反应。目前,尚未见到靶向LAG3的寡核苷酸类抑制物的报道。在本研究中,设计了靶向LAG3的反义寡核苷酸,并探究了其维持T细胞反应的效应以及作为重组蛋白疫苗和灭活流感病毒疫苗佐剂的可能性。在探究靶向LAG3的反义寡核苷酸是否也能作为肿瘤疫苗佐剂增强抗肿瘤活性的研究中,我们意外的观察到了Lewis肺癌肿瘤裂解物引起的小鼠十二指肠致死性坏死,并探讨了此种坏死发生的可能原因。1.LAG3干扰反义寡核苷酸的设计与筛选为了设计靶向LAG3的反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides,ASOs）,利用NCBI核苷酸数据库分别获得人和小鼠的LAG3 mRNA序列,并通过BLAST网站筛选出可用于设计ASOs的保守区。在对保守区序列进行特异性检测后,筛选出15个可用于设计ASOs的靶向区域。然后,设计出15个与这些靶向区域完全反向互补的ASOs,并利用“sfold”和“mfold”网站以结合位点的二级结构、结合自由能以及是否含有惰性序列作为筛选指标对这些序列进行评估。结果显示,有两个符合要求的LAG3干扰寡核苷酸（LAG3 interfering antisense oligonucleotides,LIOs）,即LIO-1和LIO-2,可用于后续研究。2.LIO进入免疫细胞的情况分析为了探究LIO能否进入免疫细胞尤其是T细胞,将LIO-1和LIO-2分别标记了Cy3荧光信号后,采用流式细胞术观察了na?ve ICR小鼠淋巴结细胞和脾细胞中的总T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞以及DC细胞对LIO-1及LIO-2的摄取情况。然后,利用免疫荧光技术进一步观察了LIO是否能定位于T细胞内部。结果显示,淋巴结细胞及脾细胞中的主要免疫细胞均可摄取LIO-1和LIO-2,并且LIO-1和LIO-2可定位于CD4+T细胞和CD8+T细胞的内部。结果提示:LIO-1和LIO-2均可以进入T细胞内部。3.LIO对T细胞LAG3表达的抑制效应为了探究LIO-1和LIO-2是否可以抑制LAG3的表达,首先利用RT-PCR技术检测了LIO对脾细胞中LAG3 mRNA表达的影响,然后利用流式细胞术分别检测了LIO对脾和引流淋巴结中的T细胞以及人T细胞淋巴瘤细胞系（Jurkat）细胞LAG3蛋白表达的影响。结果显示:1)LIO-1可抑制脾细胞中LAG3 mRNA的表达,LIO-2无明显作用;2)LIO-1可降低脾和引流淋巴结中CD4+T细胞和CD8+T细胞LAG3的表达,LIO-2无此效果;3)LIO-1可减少Jurkat细胞表面LAG3的表达,LIO-2仍然没有显着效果。由此可见,LIO-1可抑制LAG3的表达,但是LIO-2未能发挥抑制作用。4.在recall反应中LIO对抗原特异性T细胞反应的影响为了探究在recall反应中LIO对抗原特异性T细胞反应的影响,分离了LIO联合重组猪圆环病毒2b型（porcine circovirus type 2b,PCV2b）衣壳蛋白（CP）疫苗免疫的小鼠的脾细胞后,在体外使用CP蛋白再次刺激。然后利用T细胞增殖实验检测了抗原特异性CD4+T和CD8+T细胞的增殖情况。此外,还采用实时定量PCR技术检测了上述脾细胞在CP刺激后,细胞因子干扰素-γ（Interferon-gamma,IFN-γ）、白细胞介素-2（interleukin-2,IL-2）、IL-4和IL-6的mRNA表达情况。结果显示:1)LIO-1可以显着提高重组蛋白疫苗诱导的抗原特异性CD4+T细胞的增殖比例,但对抗原特异性CD8+T细胞的增殖比例无明显影响;2)LIO-1可显着提高脾细胞中IFN-γ、IL-2和IL-6的mRNA表达水平。由此可见,在recall反应中,当再次暴露于抗原时,LIO-1可以促进重组蛋白疫苗诱导的抗原特异性CD4+T细胞增殖以及细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-6的产生。5.LIO对维持抗原特异性T细胞活化的影响为了进一步探究在体内LIO对维持抗原特异性T细胞活化的影响,本研究在小鼠第二次免疫LIO联合重组CP蛋白疫苗48h后,利用流式细胞术检测了小鼠引流淋巴结和脾中CD4+T细胞和CD8+T细胞表面T细胞早期活化标志CD69的表达情况。此外,本研究还利用实时定量PCR技术检测了上述引流淋巴结细胞和脾细胞中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6 mRNA的表达水平。结果显示:1)LIO-1可提高重组蛋白疫苗诱导的引流淋巴结细胞中CD4+CD69+T细胞的比例。2)LIO-1可提高重组蛋白疫苗诱导的引流淋巴结细胞中IFN-γ和IL-2的mRNA表达。由此可见,LIO-1在体内可维持引流淋巴结中CD4+T细胞的活化,并可促进细胞因子IFN-γ和IL-2的产生。6.LIO对重组蛋白疫苗和灭活流感病毒疫苗诱导的抗体反应的促进作用由于LIO-1可显着增强CD4+T细胞反应,这提示其有可能可以促进重组蛋白疫苗和灭活流感病毒疫苗诱导的抗体反应。为了验证这一猜想,本研究使用间接ELISA技术检测了LIO-1联合重组CP蛋白疫苗或是联合灭活FM1流感病毒疫苗免疫小鼠时,诱导的抗体反应。结果显示:1)LIO-1可显着提高重组CP蛋白疫苗诱导的抗体水平;2)LIO-1可显着提高灭活FM1流感病毒疫苗诱导的抗体水平。由此可见,LIO-1可作为佐剂,增强重组蛋白疫苗和灭活病毒疫苗诱导的抗体反应。7.CD8+T细胞和IFN-γ与小鼠十二指肠坏死的相关性观察在进一步探究LIO-1是否也能作为肿瘤疫苗佐剂时,我们意外的发现了Lewis肺癌肿瘤裂解物疫苗（LCLV）注射na?ve C57BL/6小鼠可引起广泛的十二指肠致死性坏死。为了探究这一现象发生的原因,na?ve小鼠注射LCLV后,在小鼠濒死时,利用流式细胞术分别检测了小鼠外周血白细胞（peripheral white blood cells,PWBC）、脾细胞及引流淋巴结细胞中CD4+T细胞和CD8+T的比例,并利用实时定量PCR技术检测了小鼠PWBC和脾细胞中IFN-γmRNA的表达情况。注射生理盐水的小鼠作为对照。结果显示:1)注射LCLV的小鼠PWBC中CD8+T细胞比例增高了5倍,达到约50%。2)相比于正常小鼠,注射LCLV的小鼠PWBC中IFN-γ表达水平迅速提高了约12倍。这提示,小鼠外周血中显着的CD8+T和IFN-γ产生的增高可能与十二指肠致死性坏死存在相关性。综上所述,在本研究中,设计了靶向LAG3的反义寡核苷酸药物（LIO-1）,并证明LIO-1能进入T细胞内部;可诱导LAG3 mRNA的降解;抑制CD4+T细胞LAG3的表达;维持抗原特异性CD4+T细胞的增殖;促进CD4+T细胞的活化;促进细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-6的产生;增强重组蛋白疫苗和灭活流感病毒疫苗诱导的抗体反应。因此,LIO-1作为LAG3的核酸类抑制剂,可以增强微生物疫苗诱导的抗体反应,有成为一种新型佐剂的潜能。此外,在本研究中还意外发现了小鼠外周血中显着升高的CD8+T细胞和IFN-γ产生可能与十二指肠致死性坏死存在相关性。这一发现,如果能被进一步证明,可能有助于在临床上通过检测外周血CD8+T细胞和IFN-γ水平来提示患者发生十二指肠广泛坏死的风险和通过降低外周血CD8+T细胞和IFN-γ水平防止十二指肠广泛坏死的发生。
李菲[6]（2019）在《结核分枝杆菌抗原致骨髓造血细胞增殖分化异常实验研究暨烯醇化酶-1单克隆抗体制备与作用初步研究》文中研究说明结核分枝杆菌感染机体后主要激活CD4+T细胞和CD8+T细胞,CD4+T细胞分化为Th1型细胞,分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2等细胞因子,激活巨噬细胞等细胞免疫应答,CD8+T细胞分化为CTL细胞直接杀伤靶细胞,发挥清除结核分枝杆菌的作用。然而耐药结核、痰菌阳性的纤维空洞型肺结核等重症结核病患者体内结核分枝杆菌长期慢性感染会导致机体免疫功能低下。我们实验室前期应用结核分枝杆菌抗原持续刺激模拟临床结核分枝杆菌持续感染的状态,发现结核分枝杆菌抗原持续刺激会导致T细胞耗竭,表现为T细胞受特异性抗原刺激后增殖能力下降、产生细胞因子IFN-γ和IL-2减少。在该结核分枝杆菌抗原持续刺激致T细胞耗竭的动物模型上,进一步对T细胞耗竭进行治疗研究,发现给予IL-2干预可逆转其耗竭状态。在上述研究基础上,我们进而拟研究抗原持续刺激导致T细胞耗竭过程中骨髓造血功能的变化。维持骨髓造血干细胞（HSC）及前体细胞稳态是机体维持正常造血功能及建立有效抗结核免疫应答的基础。骨髓HSC的分化增殖受GM-CSF、IL-2、IFN-γ等细胞因子的调节。研究发现淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）等病毒及细菌感染过程中,细胞因子IFN-γ持续分泌,可引起造血功能障碍。重症结核病出现免疫耗竭及骨髓造血功能障碍的研究较少,相关机制尚不清楚。目的:我们推测结核分枝杆菌抗原持续刺激情况下,刺激产生的细胞因子持续作用于骨髓,造成骨髓HSC及造血前体细胞功能异常。本实验继续应用前期我们实验室建立的结核分枝杆菌抗原持续刺激引起T细胞耗竭的动物模型,研究结核分枝杆菌抗原持续刺激对骨髓造血功能的影响。方法:为了研究结核分枝杆菌抗原持续刺激对骨髓造血及T细胞免疫功能的影响,本课题应用结核分枝杆菌抗原持续刺激小鼠,观察结核分枝杆菌抗原持续刺激过程中骨髓造血细胞增殖能力的变化,并分析与造血细胞分化相关转录因子表达水平的改变,评价结核抗原刺激诱导的免疫应答对骨髓造血功能的影响。在此基础上进一步研究IL-2治疗对骨髓造血功能的影响。（1）抗原刺激及IL-2治疗程序。考虑到生物安全等因素,本课题应用结核分枝杆菌抗原持续刺激模拟临床结核分枝杆菌持续感染对免疫系统和骨髓造血功能的影响。本研究首先用卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin,BCG）免疫C57BL/6小鼠,然后用结核分枝杆菌抗原ESAT-6、CFP-10联合融合蛋白Mtb10.4-HspX（MH）与佐剂DDA和Poly（I:C）持续刺激,每周一次,反复皮下注射。抗原反复刺激12周后检测到骨髓造血细胞（Lin-c-Kit+,LK细胞）增殖能力降低,抗原刺激22次后检测到明显的T细胞功能障碍。采用IL-2对T细胞及骨髓造血细胞增殖分化异常的小鼠进行干预治疗,研究IL-2治疗后骨髓造血细胞增殖及分化能力的改变。研究中,我们设立蛋白抗原强化免疫2次作为抗原短暂刺激组对照。同时设立佐剂对照组排除佐剂对T细胞及造血细胞功能的影响。（2）T细胞功能分析。通过流式细胞术、细胞因子胞内染色法检测脾脏CD4+T淋巴细胞分泌IFN-γ的水平;应用MHC Ⅰ类分子-抗原表位肽五聚体染色技术检测TB 10.4 4-12特异性的记忆性CD8+T细胞的数量。（3）骨髓造血细胞的功能分析。无菌分离骨髓细胞,应用EdU增殖试验检测造血细胞的增殖能力;用ELISA方法检测骨髓造血微环境中IFN-γ和IL-2的水平;磁珠分选造血细胞,并应用实时荧光定量RT-PCR检测造血细胞分化相关转录因子Batf2、IRF8、GATA2和NOTCH1的表达水平,分析抗原刺激对造血细胞分化的影响。（4）IL-2对骨髓造血细胞的治疗作用及机制分析。IL-2干预后,检测上述指标的变化,分析IL-2的治疗效果及机制。结果:（1）结核分枝杆菌抗原持续刺激对T细胞功能的影响。应用结核分枝杆菌蛋白抗原持续刺激小鼠,对细胞因子的检测发现,与抗原短暂刺激组相比,抗原持续刺激12周时,脾脏CD4+T细胞受特异性抗原刺激分泌较高水平的IFN-γ（p<0.05）,但IFN-γ在持续抗原刺激22周后下降;应用MHC抗原表位肽五聚体技术检测发现持续抗原刺激12～22周,脾脏中TB10.4 4-12特异性记忆性CD8+T细胞的数量相比抗原短暂刺激组明显减少（p<0.01）。（2）结核分枝杆菌抗原持续刺激对造血细胞功能的影响。应用结核分枝杆菌蛋白抗原持续刺激小鼠,抗原持续刺激12周时,骨髓造血微环境中IFN-γ的水平明显升高（p<0.05）,但IFN-γ在抗原持续刺激后期下降。EdU增殖试验表明,与抗原短暂刺激组相比,抗原持续刺激12周及22周后LK细胞的增殖能力降低（p<0.05）。骨髓c-Kit+的细胞群中转录因子的表达水平与佐剂对照组相比也发生了明显变化:决定髓系分化的转录因子Batf2和IRF8表达上调,而促进淋巴系细胞分化的转录因子NOTCH1表达下调。（3）IL-2的治疗作用。在给予小鼠结核分枝杆菌蛋白抗原持续刺激的同时,我们应用IL-2进行干预治疗。结果发现,IL-2干预后,骨髓造血微环境中IL-2的水平升高。相比抗原持续刺激组,IL-2处理可下调Batf2和IRF8的表达,上调GATA2和NOTCH1的表达,LK细胞的增殖能力回升（p<0.05）。同时,T细胞耗竭也得到逆转:CD4+T细胞分泌IFN-γ的水平升高（p<0.05）,脾脏TB10.4 4-12特异性记忆性CD8+T细胞的数量显着增加（p<0.05）。（4）JAK3-STAT5信号通路的研究。JAK3-STAT5信号转导通路对造血细胞分化增殖起调控作用。相比佐剂组,抗原持续刺激组中JAK3和STAT5 mRNA表达水平较低。IL-2治疗后,JAK3和STAT5表达明显增强。结论:结核分枝杆菌抗原刺激诱导IFN-γ分泌为主的Th1型免疫应答。结核分枝杆菌抗原持续刺激诱导IFN-γ水平在一定时间内增高造成骨髓LK细胞增殖能力降低,并上调髓系分化相关的转录因子Batf2和IRF8的表达;补充IL-2可增强LK细胞的增殖能力,上调淋巴系分化相关转录因子GATA2、NOTCH1的表达,维持骨髓造血的稳态。此外,IL-2上调JAK3和STAT5的表达,推测IL-2也通过上调JAK3-STAT5途径分子表达调节造血细胞的增殖分化。因此,结核分枝杆菌抗原持续刺激会影响造血作用,导致造血细胞增殖能力降低,髓系分化相关的转录因子表达增高,而IL-2治疗可维持骨髓造血的稳态。本实验首次研究了结核分枝杆菌抗原持续刺激对骨髓造血细胞发育分化的影响,揭示了结核分枝杆菌持续感染状态下结核病患者免疫功能低下的机制及骨髓造血功能的改变,为进一步研究重症肺结核的精准诊治提供了思路。粟粒性肺结核是由于大量结核分枝杆菌在短时间内进入血液循环所引起的急性全身血行播散型结核病。其病情急且凶险、病死率较高。粟粒性肺结核患者由于体内结核分枝杆菌大量感染会导致机体造血功能障碍和免疫功能低下,但相关机制尚不清楚。目的:我们推测粟粒性肺结核是由大量结核分枝杆菌入血后,诱发T细胞过强的免疫反应,产生的细胞因子进一步作用于骨髓造血细胞,影响骨髓造血细胞的发育分化,淋巴细胞生成减少,最终引起机体免疫功能降低。为验证上述假设,本实验应用卡介苗（BCG）入血感染模拟临床粟粒性肺结核感染的免疫病理变化,研究其对骨髓造血系统和免疫系统的影响。方法:首先,调取临床粟粒性肺结核患者的病例资料,分析研究粟粒性肺结核临床病例外周血血细胞数量变化,研究骨髓造血功能的变化特点;其次,应用不同剂量BCG经尾静脉注射或滴鼻的方式感染小鼠,观察T细胞功能和骨髓造血功能的变化,并分析与造血细胞分化相关转录因子表达水平的改变,评价BCG感染对骨髓造血功能的影响和免疫应答特点,建立应用BCG感染模拟粟粒性结核造血功能受损的动物模型。（1）临床病例资料分析。分析2015年至2019年兰州市肺科医院收治入院的肺结核病例28,047例,其中粟粒性肺结核病例共118例。通过回顾性分析,研究粟粒性肺结核患者外周血血细胞数量变化。（2）BCG感染及IL-2治疗程序。根据文献报道及考虑到生物安全等因素,本课题应用大剂量BCG替代结核分枝杆菌感染小鼠来模拟临床粟粒性肺结核感染,首先用大剂量BCG（5×107 CFU/ml）分别以尾静脉注射和滴鼻的方式感染小鼠,分别于感染后3周、5周和8周,检测外周血血细胞数量、T细胞功能和骨髓造血细胞（LK细胞）增殖分化能力。研究中,设立低剂量BCG（5×105 CFU/ml）滴鼻感染小鼠作为对照,同时设PBS对照组排除外界因素和年龄对T细胞和骨髓造血细胞功能的影响。（3）外周血细胞数量、血清IFN-γ的水平和脏器指数的变化。将新鲜采集的小鼠血液加入抗凝管中,通过动物血液分析仪检测不同组血细胞数量的变化。未抗凝的外周血凝固后离心收集血清,用ELISA检测血清中IFN-γ的水平;通过称量脾脏、肝脏、肺脏及小鼠重量,观察BCG感染对脾脏指数、肝脏指数和肺脏指数的影响。（4）T细胞功能分析。通过ELISA检测脾脏淋巴细胞受BCG蛋白纯化衍生物（PPD）刺激后分泌IFN-γ和IL-2的水平;应用流式细胞术检测脾脏CD4+和CD8+T淋巴细胞表面表达抑制性受体PD-1的水平;应用EdU增殖试验检测脾脏CD4+和CD8+T淋巴细胞受PPD刺激后的增殖能力。（5）骨髓造血细胞的功能分析。无菌分离骨髓细胞并对其进行磁珠分选,得到LK细胞,用EdU增殖试验检测LK细胞的增殖能力;用ELISA的方法检测骨髓造血微环境中IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-6和GM-CSF的水平;提取LK细胞的总RNA,并应用实时荧光定量RT-PCR检测LK细胞中转录因子Batf2、IRF8、GATA2和NOTCH1的表达水平,分析BC G感染对LK细胞分化的影响。（6）IL-2治疗作用分析。在大剂量BCG入血感染后,应用IL-2对发生T细胞耗竭及骨髓造血细胞增殖分化异常的小鼠进行干预治疗。IL-2干预后,检测上述指标的变化,分析IL-2的治疗效果及机制。结果:（1）临床病例资料分析。我们回顾性分析了 2015年至2019年兰州市肺科医院收治的结核病病例28,047例,其中粟粒性肺结核病例共118例。根据患者外周血血细胞检测结果分析患者各类血细胞变化,发现118例粟粒性肺结核患者中89%发生淋巴细胞减少（105例）、23%发生白细胞减少（27例）、8.5%发生中性粒细胞减少（10例）、49.2%发生血红蛋白减少（58例）、11%发生红细胞减少（13例）、8.5%发生血小板减少（10例）、全血细胞减少6例,占4.2%。以上数据表明粟粒性肺结核常继发淋巴细胞减少,其次可继发白细胞减少、血红蛋白减少、血小板减少等各类血细胞减少症。（2）BCG感染对外周血血细胞数量和脏器指数的影响。在BCG感染后5周,与PBS组相比,大剂量BCG尾静脉注射组小鼠外周血白细胞、淋巴细胞和血小板减少,小鼠脾脏指数、肝脏指数和肺脏指数明显升高,提示脾脏、肝脏和肺脏明显肿大。（3）BCG感染对T细胞功能的影响。在BCG感染后3周、5周和8周,与PBS组、低剂量BCG滴鼻组和高剂量BCG滴鼻组相比,高剂量BCG尾静脉注射组脾脏CD8+T细胞明显高表达抑制性受体PD-1（p<0.05）。EdU增殖试验表明:低剂量BCG滴鼻组脾脏CD8+T细胞增殖能力明显强于其他组;相对于PBS组、低剂量BCG滴鼻组和高剂量BCG滴鼻组,高剂量BCG尾静脉注射组脾脏CD8+T细胞的增殖能力明显降低（p<0.05）。ELISA检测脾脏淋巴细胞受特异性抗原PPD刺激分泌IFN-γ和IL-2的水平,结果如下:在3-5周时高剂量BCG尾静脉注射组较低剂量BCG滴鼻组及PBS组产生较高水平的IFN-γ（p<0.05）,8周后产生IFN-γ的能力明显降低;在感染3-5周低剂量BCG感染组产生IL-2的水平高于PBS组和高剂量BCG尾静脉注射组（p<0.05）。（4）BCG感染对骨髓造血细胞功能的影响。在BCG感染后3周,高剂量BCG尾静脉注射组LK细胞增殖能力明显高于PBS组（p<0.01）,随后逐渐降低。骨髓上清液中细胞因子的变化如下:在BCG感染后5周,相比PBS组,高剂量BCG尾静脉注射组产生较高水平的IFN-γ和TNF-α（p<0.05）,IL-2、IL-6和GM-CSF的水平无明显变化,但低剂量BCG滴鼻组IL-2、IL-6和GM-CSF明显增高（p<0.05）。高剂量BCG尾静脉注射组骨髓LK细胞群中转录因子的表达水平与PBS对照组相比也发生了明显变化:髓系分化相关的转录因子Batf2和IRF8表达上调,而淋巴系分化相关的转录因子GATA2和NOTCH1表达下调。（5）IL-2的治疗作用。在大剂量BCG入血感染小鼠后,用IL-2进行干预治疗。结果发现,IL-2干预后,T细胞耗竭得以逆转。结论:回顾性分析临床粟粒性肺结核患者的病例资料,结果发现粟粒性肺结核患者会出现淋巴细胞减少、血红蛋白减少、血小板减少等造血功能受损表现,和文献报道一致。应用小鼠模型研究发现,大剂量BCG入血感染可致外周血淋巴细胞和血小板减少,诱导骨髓造血微环境中细胞因子IFN-γ和TNF-α的水平增高,导致骨髓LK细胞增殖能力降低,并上调髓系分化相关的转录因子Batf2和IRF8的表达,下调淋巴系分化相关转录因子GATA2和NOTCH1的表达,最终导致T细胞耗竭。补充IL-2后T细胞耗竭有所逆转。本研究结合临床病例资料和动物实验研究,从骨髓造血细胞发育分化的角度揭示粟粒性肺结核免疫功能低下的机制及骨髓造血功能的改变,为粟粒性肺结核防治提供了参考。T细胞发育分化过程需要糖酵解和氧化磷酸化提供能量,尤其是效应T细胞的糖酵解代谢更为活跃。上一章研究我们发现大剂量BCG入血感染会使T细胞过度活化,导致T细胞耗竭的发生。我们推测抑制糖酵解,减轻T细胞的活化,有可能阻断T细胞耗竭的发生。糖酵解也是肿瘤代谢的重要特征。我们实验室前期通过蛋白质组学筛选到宫颈癌组织高表达糖酵解酶烯醇化酶1（ENO1）。用ShRNA干扰沉默ENO1基因的表达可明显降低宫颈癌Hela和SiHa细胞的成瘤能力及侵袭转移能力,说明抑制ENO1表达可以阻断糖酵解,从而起到治疗肿瘤的作用。目的:虽然应用shRNA干扰ENO1表达可抑制肿瘤生长,但RNA干扰技术受到病毒载体和运输系统的限制。为了促进临床应用,本课题拟制备ENO1的单克隆抗体,进一步研究其抗肿瘤作用。此外,前两章的研究发现结核分枝杆菌抗原持续刺激和大剂量BCG入血感染会导致T细胞功能低下甚至耗竭,如何扭转耗竭对于结核病防治有重要意义。细胞代谢变化可决定T细胞功能,因而细胞代谢被认为是T细胞功能和分化的关键调节因子。本研究制备ENO1的单克隆抗体,后期将进一步通过干预T细胞代谢,研究治疗T细胞耗竭的新方法和策略。方法:本课题拟用真核表达系统表达ENO1蛋白,纯化ENO1蛋白,制备ENO1单克隆抗体。预期ENO1的单克隆抗体通过干扰肿瘤细胞表面ENO1可以降低肿瘤细胞迁移侵袭能力。我们筛选有较强抗宫颈癌SiHa细胞迁移侵袭能力的ENO1单克隆抗体。对编码ENO1单克隆抗体的基因进行测序,将其可变区基因序列重组构建在腺相关病毒上。后续我们将对腺相关病毒表达抗体可变区蛋白多肽的功能进行鉴定,对ENO1单克隆抗体对糖酵解的抑制作用展开深入研究。（1）ENO1的克隆、表达和纯化方案一:以pET30a-ENO1质粒为模板,将ENO1基因克隆入真核表达载体pcDNA中,构建重组质粒pcDNA3.1-ENO1,并将pcDNA3.1-ENO1以瞬时转染的方式成功转入人胚肾细胞（HEK-293T细胞）中,表达出ENO1蛋白,并用Ni-NTA介质进行纯化。方案二:将pcDNA3.1-ENO1以稳定转染的方式成功转染入中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1细胞）中,表达和纯化ENO1蛋白。方案三:将ENO1基因克隆入杆状病毒表达载体pFastBac1中,转入昆虫细胞Sf9中,表达和纯化ENO1蛋白。（2）ENO1单克隆抗体的制备。用ENO1蛋白反复免疫BALB/c小鼠,取出抗体滴度较高的小鼠脾脏细胞,与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。对阳性杂交瘤细胞进行反复筛选,获得效价较高的杂交瘤细胞株,诱导腹水产生,纯化得到ENO1单克隆抗体。（3）ENO1单克隆抗体的抗肿瘤作用评价。采用细胞划痕实验和Transwell小室实验检测五个ENO1单克隆抗体对宫颈癌SiHa细胞迁移、侵袭能力的影响,筛选出效果最佳的ENO1单克隆抗体。（4）ENO1单克隆抗体可变区基因测序。分别提取五株杂交瘤细胞的RNA,通过RT-PCR获得相应的cDNA。基于抗体重链和轻链恒定区的已知序列设计3’-末端基因特异性引物,联合5’-末端的通用引物用于cDNA基因的PCR扩增,通过对扩增产物进行测序,获得ENO1单克隆抗体重链和轻链可变区基因序列。（5）腺相关病毒包装ENO1抗体的可变区基因。选择对宫颈癌细胞的迁移、侵袭能力有明显抑制效果的ENO1单克隆抗体H1的轻链和重链可变区基因,中间用Linker--（GGGGS）3连接,克隆在pAAV-MCS载体上,由公司合成,简称rAAV-H1。对AAV辅助病毒系统中的pHelper、pAAV-RC和rAAV-H1菌液进行复苏、保种和扩增,并大量抽提质粒,将其转染入AAV-293细胞中,观察其转染效率、收集病毒并进行滴度测定。同时,将带有绿色荧光蛋白的pAAV-IRES-ZsGreen1转入AAV293细胞中,作为空载体对照（rAAV-GFP）。结果:（1）ENO1蛋白表达与纯化。首先将pcDNA3.1-ENO1以瞬时转染的方式成功转染入HEK-293T细胞中,表达纯化ENO1蛋白,但蛋白得率太低;将pcDNA3.1-ENO1以稳定转染的方式成功转染入CHO-K1细胞中,表达纯化目的蛋白,同样蛋白得率太低;最后将ENO1基因克隆入pFastBac1中,转入Sf9细胞中,蛋白表达量高,纯化出高纯度的ENO1蛋白。（2）ENO1单克隆抗体制备。ENO1蛋白免疫小鼠后,通过杂交瘤技术成功筛选到5株效价较高的阳性杂交瘤细胞株,纯化获得相应的单克隆抗体。（3）ENO1单克隆抗体对宫颈癌细胞迁移、侵袭作用的影响。应用细胞划痕实验和Transwell小室实验,初步评价5个ENO1单克隆抗体的抗肿瘤细胞迁移、侵袭作用。检测结果示五个ENO1单克隆抗体对宫颈癌SiHa细胞迁移、侵袭能力均有抑制作用,其中H1的抑制作用最强。（4）ENO1单克隆抗体可变区基因测序。在得到单克隆抗体的基础上,利用通用引物从杂交瘤细胞的RNA钓取抗体的重链和轻链可变区基因,对获得的抗体可变区基因进行测序,成功获得可变区基因序列。（5）腺相关病毒包装ENO1抗体的可变区基因。将得到的ENO1抗体重链和轻链可变区基因构建在腺相关病毒载体上,得到rAAV-H1。大量抽提得到浓度较高的pHelper、pAAV-RC和rAAV-H1质粒,将其转染入AAV293细胞中,结果示转染成功,且转染效率达到90%。结论:应用杆状病毒表达载体,成功表达和纯化出高纯度的ENO1蛋白;应用ENO1蛋白免疫小鼠,通过杂交瘤技术成功制备和筛选到5个高效价的ENO1单克隆抗体;通过ENO1单克隆抗体对宫颈癌细胞的迁移、侵袭能力的抑制作用评价,筛选出有明显抑制效果的ENO1单克隆抗体H1;成功获得ENO1单克隆抗体的可变区基因序列。将ENO1抗体的可变区基因重组到腺相关病毒载体上,得到rAAV-H1。ENO1单克隆抗体的制备和相关研究为下一步研究ENO1单克隆抗体抑制糖酵解抗肿瘤和T细胞耗竭作用奠定了基础。
张力[7]（2019）在《呼伦贝尔牛羊淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）流行病学研究》文中提出淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（Lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV）是布尼亚病毒目（Bunyavirales）、沙粒病毒科（Arenaviridae）、哺乳动物沙粒病毒属（Mammarenavirus,MARV）的负链RNA病毒。LCMV呈世界性分布,啮齿类动物是其自然宿主,可通过直接接触或经气溶胶传播造成LCMV感染。LCMV感染人可导致流感样症状或无菌性脑炎,免疫缺陷患者感染后致死率较高。孕妇在怀孕期间感染LCMV可导致流产、死胎、畸形、新生儿小头症及其他中枢神经系统后遗症。LCMV引发的人兽共患病常被忽视,严重威胁人类生命健康,已成为一个亟待解决的公共卫生问题。2018年我国首次在东北地区蜱中发现并分离到LCMV,蜱作为LCMV携带者感染率高达2.5%-12.2%。蜱是第二大病原体传播媒介,通过叮咬吸血传播多种人畜共患疾病。LCMV有可能在蜱中垂直传播或水平传播给其他脊椎动物和人,但现在未有相关研究。内蒙古自治区呼伦贝尔地区是蜱传疾病流行区域,对该地区牛、羊进行LCMV流行病学调查,有助于了解当地哺乳动物LCMV感染情况与LCMV在不同宿主之间循环传播方式,为LCMV有效防控提供科学依据。本研究在前期研究基础上,原核表达LCMV核衣壳（NP）蛋白,建立间接ELISA及荧光定量检测方法,进行了LCMV血清学及分子流行病学研究。LCMV NP蛋白原核表达。根据已发表的4株蜱源LCMV NP序列（MG554174,MG554175,MG554176,MG554177）设计特异性引物,通过RT-PCR从病毒基因组中获得目的基因后,构建原核表达载体pET-30a-LCMV-NP,转化到E.coli BL21（DE3）感受态细胞中经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物,通过亲和层析纯化获得重组蛋白。结果表明,通过RT-PCR技术扩增得到1785 bp目的基因,与蜱源LCMV同源性100%;表达的重组蛋白大小为56.4 kDa,纯化后蛋白浓度为0.626 mg/mL,具有反应原性。牛羊LCMV血清流行病学研究。2017年5月在呼伦贝尔地区采集牛血清样本234份、羊血清样本221份。以重组蛋白LCMV-NP（0.2μg/mL）作为包被抗原,采用间接ELISA法检测牛、羊血清中LCMV特异性抗体。结果显示,牛、羊血清中特异性抗体阳性率分别为2.56%（6/234）和4.52%（10/221）。牛羊LCMV分子流行病学研究。为建立更加灵敏的LCMV核酸检测方法,根据GenBank上LCMV NP基因保守区设计qPCR引物,进行染料法引物筛选和反应条件优化。结果表明,建立的实时荧光定量RT-qPCR法的R2值为0.997,扩增效率为96.498%,敏感性与特异性良好。通过本实验建立的实时荧光定量RT-qPCR方法检测上述牛、羊血清中LCMV RNA阳性率分别为21%（49/234）和19.9%（44/221）。血清学检测结果表明牛羊存在LCMV既往感染,分子生物学检测结果表明牛羊大多在近期感染LCMV,提示了LCMV可能在牛羊中存在持续性感染。PCR扩增得到牛LCMV NP基因序列与蜱源LCMV同源性最高为98%。系统进化树分析发现,牛源LCMV属于严重疾病相关的Ⅰ型LCMV,且与蜱源LCMV处于同一进化分支,提示牛体内的LCMV可能来源于蜱。本研究成功表达了LCMV NP重组蛋白,建立了LCMV检测间接ELISA和荧光定量PCR方法,对内蒙古呼伦贝尔地区牛羊LCMV流行情况进行了调查,提供了牛羊LCMV感染证据,为LCMV在不同宿主间的传播与遗传进化研究提供理论依据,也为LCMV的有效诊断防控奠定了基础。
刘莎莎[8]（2019）在《温州病毒血清流行率调查研究》文中指出沙粒病毒是一种有包膜、单股负链RNA病毒,其基因组由S和L两个节段组成,其宿主以啮齿类动物为主。沙粒病毒可引起以出血热和脑炎为主要症状的多种严重人类疾病,如在西非,LASV每年可感染10至30万病例、约5000人死亡;在阿根廷,JUNV引起病毒性出血热,随季节暴发流行。但在亚洲,目前已知的哺乳类沙粒病毒只有LCMV和2015年新发现的温州病毒WENV。最新在东南亚地区呼吸道感染患者中检测到WENV,但WENV是否可以引起跨种传播,是否存在爆发流行可能,尚不明确。首先利用原核表达系统表达LCMV和WENVNP并进行提取纯化,然后用纯化蛋白免疫小鼠获得抗LCMV和抗WENV血清。同时,利用昆虫细胞表达系统表达LCMV和WENVNP并进行提纯化,以此作为检测抗原,而小鼠抗血作为抗体,用westem-blot方法对LCMV与WENV NP进行交叉反应分析,结果显示LCMV和WENVNP之间存在双向交叉反应。为避免交叉反应造成的干扰,利用LCMVN蛋白建立竞争性ELISA检测方法。在此基础上,对采集自健康人群的830份血清样本进行WENV-IgG抗体检测,结果显示在受检血清样本中可以检测出WENV-IgG抗体阳性,ELISA总阳性数为32,其中Western Blot阳性数为5。儿童组血清总流行率为1.5%,其中0～0.5岁为0%,0.5～2岁为0,3-5岁为2.9%,5-14岁为2.2%。成年组血清总流行率为4.6%,其中15～44 岁为 3.6%,45～59 岁为 5.4%,≥60 岁为 4.1%。同时,利用RT-PCR方法,进一步对采集自呼吸道感染病人的1000份呼吸道样本,对WENV核酸进行检测,未检出阳性核酸样本。综上,本研究提示,LCMV和WENV N蛋白之间存在交叉反应,利用N蛋白对WENV的特异性N抗体检测应考虑其与LCMV抗原交叉反应;在正常人群中,检测到WENV-IgG阳性样本,提示我国需提高对WENV的防控意识;在呼吸道感染人群中,虽然未检测到WENV RNA阳性样本,可能与WENV低感染率、地理分布特点和核酸样本来源的局限性有关。本研究的初步结果,为进一步了解WENV跨种传播情况及血清学研究提供了重要的实验基础。
王泽东[9]（2019）在《新型分节段黄病毒的发现及其流行病学研究》文中研究表明近年来通过高通量测序技术发现了一类新型分节段黄病毒—荆门病毒属（Jingmenvirus）,主要成员包括Jingmen tick virus、Mogiana tick virus及Guaico Culex virus。该类病毒基因组分为4或5个节段,其中有2个节段来源于黄病毒的非结构蛋白,其他节段则表达病毒结构蛋白。该类病毒可感染蜱、蚊、牛、猴等动物,并且在中国、巴西、美国、乌干达地区都有分布。本研究在我国东北地区蜱咬伤病人血液中分离鉴定了一种新型分节段黄病毒-阿龙山病毒（Alongshan virus,ALSV）,并开展了人及动物流行病学研究。1.阿龙山病毒的分离鉴定:2017年4月采集哨点医院蜱咬伤病人血样进行宏病毒组学分析,发现1例病人血样中含有类似荆门蜱病毒（Jingmen tick virus,JMTV）的核酸序列,同源性57.4–74.5%。将血样接种Vero细胞,5–7天后可见轻微细胞病变;电镜负染观察,可见直径80–100 nm的带囊膜的近球形病毒粒子,切片观察可见胞质中有病毒颗粒。病毒基因全长为11350 bp,分为4个节段。由于病人发现于内蒙古阿龙山地区,因此命名为阿龙山病毒（ALSV）。2.阿龙山病毒基因组生物信息学分析:同源性分析发现ALSV与JMTV氨基酸同源性为23.7–80.9%;蛋白质组学分析ALSV存在类似黄病毒NS5和NS2b-NS3片段的NSP1和NSP2非结构蛋白,以及VP1囊膜蛋白、VP2核衣壳蛋白、VP3膜蛋白三个结构蛋白。进化分析发现ALSV与JMTV处于黄病毒属、瘟病毒属、肝炎病毒属之间,单独形成一个分枝,且分别处于不同分枝,表明ALSV属于分节段的荆门病毒属（Jingmenvirus）但是区别于JMTV的分节段黄病毒新种。3.阿龙山病毒在蜱咬伤病人流行病学分析:2017年4–8月采集的374份蜱咬伤住院病人血样中共检出86例ALSV阳性病例,患者主要集中在内蒙古东部及黑龙江大兴安岭地区,男性居多（73.3%）,多为野外工作者（97.7%）,有近期蜱叮咬史（95.3%）。病人发病潜伏期为3–7天,以头痛（80.2%）、发烧（77.9%）、疲乏（59.3%）为主要症状,住院10-14天可痊愈。4.阿龙山病毒在动物的流行病学分析:采集内蒙古东部地区牛羊血清各240份,检测发现牛羊ALSV ELISA抗体阳性率为4.6–9.2%;中和抗体阳性率为1.7–4.2%,说明牛羊存在ALSV的既往感染。RT-qPCR检测牛羊ALSV阳性率为26.3–27.5%,表明牛羊存在ALSV近期感染,可能为ALSV的储存宿主。在黑龙江和内蒙古采集蜱1105只,通过巢式PCR在全沟硬蜱中检出ALSV,黑龙江感染率3.7%,内蒙古6.5%,表明全沟硬蜱可能为ALSV的传播媒介。遗传进化分析显示牛、羊、蜱及人源ALSV同源性在98%以上,且位于进化树同一分枝,表明各宿主源ALSV在进化上密切相关。本研究发现了一种新型分节段黄病毒—阿龙山病毒,是世界上发现的第一个感染人的分节段黄病毒,对于蜱传疾病的防控具有重要指导意义,同时也为蜱传病研究提供了新的方向。
岳锋[10]（2015）在《CSFV和PCV2感染后免疫抑制性受体转录水平研究及阻断猪PD-1/PD-L1通路多肽基序鉴定》文中指出免疫抑制性受体传递免疫抑制和免疫耐受信号,是获得性免疫调节的重要分子,包括程序性死亡因子1 （programmed death-1, PD-1）、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4 （cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4）和淋巴细胞活化基因-3（lymphocyte activation gene-3, LAG-3）等。多种慢性或持续性病毒感染过程中,PD-1、CTLA-4或LAG-3等过量表达,活化免疫负调节信号通路,引起免疫细胞凋亡、增殖能力降低以及抗病毒细胞因子分泌减少等,造成机体免疫功能损伤或免疫抑制,阻断PD-1、CTLA-4、LAG-3与其相应配体相互作用,可以逆转T细胞免疫功能。猪瘟（classical swine fever, CSF）和断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS）是猪的两种重要传染性疾病,目前对CSF和PMWS引起免疫功能损伤或免疫抑制的致病机制已经从病原和宿主两方面进行了深入广泛的研究,但是,在宿主效应细胞免疫调节方面研究较少,免疫抑制性受体是否参与CSF和PMWS的免疫致病机制尚未见报道。因此,本课题旨在研究CSF和PMWS感染过程中免疫抑制性受体的转录水平及其对免疫效应影响,筛选和鉴定能阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽基序,以期进一步揭示CSF和PMWS的免疫致病机制,为研究免疫调节药物和佐剂提供理论基础。PD-1/PD-Ls通路活化是多种病毒性疾病造成免疫损伤的重要致病机制。本部分主要研究CSFV感染猪后PD-1及其配体PD-L1和PD-L2的转录水平变化。45日龄CSFV抗体阴性仔猪感染CSFV石门株,分成两组：感染组（10头）和对照组（5头）,颈部肌肉注射105×TCTD50的CSFV/头,对照组注射0.5 mL的PBS,感染后0 d、3 d、7 d、10 d、14 d和21 d,颈静脉采集抗凝血5 mL,分离猪外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）,实时荧光定量PCR （quantitative real-time, qPCR）检测PBMCs中PD-1、PD-L1、PD-L2、IL-2、IL-10的转录水平,同时检测血浆中CSFV载量,用CFSE标记PBMCs, rswIL-2和CD3单抗刺激,测定T细胞的增殖能力。结果显示,在感染后第3 d PD-1和PD-L1转录水平开始升高（p<0.05）,第7 d达到峰值（p<0.01）,而PD-L2转录水平在感染后3 d达到峰值（p<0.01）,之后开始降低。血浆中CSFV载量在感染后第7 d达到峰值,PD-1及其配体转录水平与CSFV载量成正相关。免疫负调节细胞因子IL-10转录水平在感染后7d显着升高（p<0.01）,IL-2转录水平在PD-1及其配体转录水平下降之后即感染后14 d显着升高（p<0.05）,感染后第7 d,T细胞增殖能力降低。结果表明CSFV感染能够引起PD-1/PD-Ls通路改变。选取河南新乡地区某规模化养猪场疑似患PMWS的断奶仔猪9头,临床症状表现为渐进性消瘦或生长缓慢、厌食、精神沉郁、皮肤苍白、被毛蓬乱、咳嗽和呼吸困难等,健康对照组6头,PCR检测血浆、肺脏和脾脏中病原PCV2、PRRSV、PPV、PRV和CSFV,采集猪抗凝血5mL/头,采集抗凝血2次,间隔7d,分离PBMCs, qPCR检测PBMCs中PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、PTEN以及细胞因子IL-2、IL-10和IFN-y的转录水平,流式细胞术检测PBMCs的增殖能力。结果显示,发病猪的血浆、肺脏和脾脏中分别扩增出PCV2 381 bp特异性目的条带,未扩增出PRV、PPV、PRRSV和CSFV的特异性目条带,根据临床症状和病原检测,确诊发病猪患PMWS。PD-L1（p<0.01）和PD-L2（p<0.05）转录水平显着升高,而PD-1、CTLA-4和LAG-3的mRNA水平无显着变化,PTEN的mRNA水平显着升高（p<0.01）,PTEN表达量升高证实PD-1/PD-Ls通路的活化,而且PD-L1还可以与B7分子结合抑制B7与CD28分子的结合,阻断共刺激信号B7/CD28通路,抑制T细胞活化；IL-10转录水平显着升高（p<0.01）,IL-2和IFN-y轻微升高,但是统计学分析不显着,PBMCs增殖能力显着降低。结果表明自然感染PMWS过程中可以引起PD-/PD-Ls通路改变,抗病毒细胞免疫功能降低,进一步揭示PMWS的免疫致病机制。根据PD-1与其配体复合物的三维结构与结合位点,设计合成包含PD-1与PD-L1结合位点的系列多肽,初步探讨合成多肽阻断PD-1/PD-L1通路的免疫调节。分离患PMWS猪的PBMCs, CFSE标记细胞,多肽与ConA共同刺激培养3 d,流式细胞术检测PBMCs的增殖变化；选取能促进PBMCs增殖的多肽标记FITC,检测标记多肽与猪重组蛋白PD-L1及PBMCs的结合情况；选取能结合猪PD-L1蛋白的多肽与灭活CSFV共同免疫小鼠后,检测血清中CSFV的抗体水平。结果显示,多肽PD-15能显着提高猪PBMCs增殖能力。并且PD-15能有效结合重组蛋白PD-L1和PBMCs,多肽PD-15与灭活CSFV共同免疫小鼠后,CSFV抗体水平显着升高。结果表明多肽PD-15能阻断猪PD-1/PD-L1通路,促进PBMCs增殖和提高抗体水平,为研制新型免疫调节佐剂奠定基础。
二、LCMV重组蛋白抗原应用研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、LCMV重组蛋白抗原应用研究（论文提纲范文）
（1）IL10在牛副流感病毒3型感染中的作用及其调控机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 牛呼吸道疾病病原及其固有免疫应答 |
| 1.1 牛呼吸道病原识别病原的分子基础 |
| 1.2 气道和肺上皮细胞对牛呼吸系统疾病的抵抗能力 |
| 1.3 固有免疫系统的效应细胞 |
| 第二章 牛副流感病毒3 型感染及其逃避宿主免疫的研究进展 |
| 2.1 宿主范围与传播特点 |
| 2.2 流行病学与基因型 |
| 2.3 BPIV3 编码基因与蛋白特征 |
| 2.4 牛副流感的临床症状与病理变化 |
| 2.5 病原分离与鉴定 |
| 2.6 BPIV3 造成的经济损失 |
| 2.7 BPIV3 的治疗与预防 |
| 2.8 副黏病毒拮抗Ⅰ型干扰素的研究概况 |
| 第三章 IL10 的信号转导与其在病毒致病中的作用 |
| 3.1 白细胞介素-10 的来源细胞与基本作用 |
| 3.2 IL10 的受体与信号转导 |
| 3.3 IL10 的相关家族与病毒编码的IL10 |
| 3.4 IL10 在病毒致病中的作用 |
| 3.5 IL10 重要产物SOCS3 在病毒感染中的作用 |
| 3.6 病毒诱导IL10 产生的信号通路 |
| 3.7 阻断IL10 清除病毒感染的新策略 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 犊牛BPIV3 血清抗体调查与BPIV3 A的分离鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、菌株与质粒 |
| 1.2 血清与病料采集 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 呼吸道症状的犊牛BPIV3 抗体调查 |
| 2.2 鼻棉拭子中的BPIV3 鉴定与分离培养 |
| 2.3 病毒的鉴定与纯化 |
| 3 结果 |
| 3.1 呼吸道症状的犊牛BPIV3 抗体调查 |
| 3.2 BPIV3 分离培养 |
| 3.3 BPIV3 的特性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 BPIV3 感染C57BL/6 小鼠与巨噬细胞的转录组分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要动物、细胞与毒株 |
| 1.2 主要试剂与耗材 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 BPIV3对C57BL/6 鼠的致病性 |
| 2.2 转录样本的制备 |
| 2.3 转录组测序 |
| 2.4 qPCR验证转录组测序结果 |
| 3 结果 |
| 3.1 BPIV3对C57BL/6 鼠的致病性 |
| 3.2 BPIV3 感染鼠巨噬细胞后细胞因子的变化 |
| 3.3 BPIV3 感染C57 小鼠后肺组织的转录组分析 |
| 3.4 BPIV3 感染原代巨噬细胞转录组测序与分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的重组表达及特性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、菌株与质粒 |
| 1.2 抗体 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的克隆与生物信息学分析 |
| 2.2 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的原核表达与多抗制备 |
| 2.3 牛IL10、SOCS3 的真核表达 |
| 2.4 牛IL10、IL10R1 腺病毒制备及蛋白表达 |
| 2.5 牛IL10 启动子双荧光素酶载体的构建 |
| 2.6 构建牛IL10、IL10R1、SOCS3 干扰载体 |
| 2.7 牛IL10 的生物学活性及信号通路研究 |
| 2.8 牛SOCS3 对I型干扰素表达的负调控 |
| 3 结果 |
| 3.1 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的克隆 |
| 3.2 牛IL10、IL10R1、SOCS3 的原核表达与多抗制备 |
| 3.3 牛IL10、SOCS3 的真核表达 |
| 3.4 牛IL10、IL10R1 胞外区的腺病毒感染细胞与表达蛋白鉴定 |
| 3.5 牛IL10 启动子双荧光素酶载体的构建与活性分析 |
| 3.6 牛IL10、IL10R1、SOCS3 干扰载体的构建 |
| 3.7 牛IL10 和IL10R的生物学活性 |
| 3.8 牛IL10 的信号通路 |
| 3.9 牛SOCS3 对I型干扰素表达的负调控 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 IL10 在牛副流感病毒3 型感染中的作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与质粒 |
| 1.2 抗体和抑制剂 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 BPIV3 感染细胞表达IL10 并发挥其活性 |
| 2.2 IL10/IL10R1对BPIV3 感染与细胞因子表达的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 BPIV3 感染细胞诱导IL10 的转录与表达 |
| 3.2 BPIV3 感染对STAT3 表达的影响 |
| 3.3 BPIV3 感染对SOCS3 转录的影响 |
| 3.4 BPIV3 感染对其他细胞因子表达的影响 |
| 3.5 IL10对BPIV3 感染与细胞因子表达的影响 |
| 3.6 IL10 受体阻断对BPIV3 复制与细胞因子表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 IL10 与牛副流感病毒3 型感染的相互调控 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与质粒 |
| 1.2 抗体和抑制剂 |
| 1.3 主要培养基及试剂 |
| 1.4 主要溶液的配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 BPIV3 感染诱导IL10 产生的信号通路 |
| 2.2 调控IL10 相关通路对BPIV3 复制与细胞因子表达的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 BPIV3 诱导IL10 产生所依赖的信号通路 |
| 3.2 调控IL10 相关通路对BPIV3 复制与细胞因子表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）ETEC K99-SIgA复合物制备及其增强肠道黏膜免疫应答的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 产肠毒素大肠杆菌概述 |
| 1.2 黏膜免疫机制 |
| 1.2.1 T细胞及树突状细胞（DC）、巨噬细胞在SIgA产生中的作用 |
| 1.2.2 M细胞在启动黏膜免疫中的关键作用 |
| 1.3 免疫复合物研究进展 |
| 1.3.1 免疫复合物在免疫反应中的作用 |
| 1.3.2 免疫复合物的免疫抑制作用 |
| 1.3.3 ICs疫苗研究进展 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验主要材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株、细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 ETEC K99-SIgA免疫复合物的制备 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 pET-32a-K99重组质粒的构建 |
| 2.2.3 pET-32a-K99重组蛋白的原核表达 |
| 2.2.4 pET-32a-K99重组蛋白的纯化 |
| 2.2.5 小鼠K99特异性IgG抗体的制备 |
| 2.2.6 小鼠K99特异性SIgA抗体的制备 |
| 2.2.7 以His pull-down方法制备ETEC K99-SIgA复合物 |
| 2.3 ETEC K99-SIgA免疫复合物增强肠道黏膜免疫应答的初步探究 |
| 2.3.1 小鼠小肠袢结扎实验 |
| 2.3.2 M细胞对K99-SIgA免疫复合物的摄取机制 |
| 2.3.3 K99-SIgA复合物对DC细胞成熟的影响 |
| 2.3.4 淋巴细胞免疫学实验 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ETEC K99-SIgA免疫复合物的制备 |
| 3.1.1 目的基因的扩增结果 |
| 3.1.2 重组质粒pET-32a-K99鉴定 |
| 3.1.3 测序结果 |
| 3.1.4 目的蛋白最佳诱导条件的确定 |
| 3.1.5 蛋白可溶性鉴定 |
| 3.1.6 纯化蛋白的Western blotting鉴定结果 |
| 3.1.7 小鼠血清中K99特异性IgG抗体水平 |
| 3.1.8 小鼠粪便中K99特异性SIgA抗体水平 |
| 3.1.9 ETEC K99-SIgA复合物的Western blotting鉴定结果 |
| 3.2 ETEC K99-SIgA免疫复合物增强肠道黏膜免疫应答的初步探究 |
| 3.2.1 小鼠小肠袢结扎实验结果 |
| 3.2.2 M细胞体外培养模型的鉴定 |
| 3.2.3 M细胞摄取K99-SIgA免疫复合物的结果 |
| 3.2.4 K99-SIgA复合物刺激DC细胞成熟的结果 |
| 3.2.5 小鼠脾淋巴细胞因子分泌水平 |
| 3.2.6 小鼠脾T淋巴细胞增殖水平 |
| 3.2.7 小鼠效应T细胞活力检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附录 |
（3）鞭毛素蛋白调节肝内T细胞免疫应答的机制及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 肝脏免疫应答的特征和耐受机制 |
| 1.1.1 肝脏免疫微环境 |
| 1.1.2 肝内细胞及其免疫耐受调节作用 |
| 1.2 CD8~+T细胞对肝内抗感染的重要性 |
| 1.2.1 急性病毒感染中CD8~+T应答特征 |
| 1.2.2 慢性病毒感染中CD8~+T细胞功能耗竭 |
| 1.2.3 慢性病毒性感染的免疫调节治疗 |
| 1.3 肠道微生物对肝脏病毒性感染的调节作用 |
| 1.4 微生物来源的PAMPs对肝内细胞的免疫调节作用 |
| 1.4.1 PAMPs对肝细胞的调节作用 |
| 1.4.2 PAMPs对肝内非实质细胞的调节作用 |
| 1.5 鞭毛素蛋白潜在的免疫调节作用 |
| 1.5.1 鞭毛素蛋白的两条信号通路 |
| 1.5.2 鞭毛素蛋白的免疫调节作用 |
| 1.6 鞭毛素蛋白潜在的肝内免疫调节作用 |
| 1.6.1 鞭毛素蛋白潜在的肝内免疫调节细胞类型 |
| 1.6.2 鞭毛素蛋白的肝内免疫调节作用 |
| 1.7 本课题的研究目的和实验设计 |
| 1.7.1 研究目的 |
| 1.7.2 研究路线及动物模型 |
| 第2章 材料方法 |
| 2.1 实验仪器、试剂和耗材 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 耗材 |
| 2.1.4 生物材料 |
| 2.1.5 培养基、缓冲液及溶液配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 pcDNA3.1-HBs质粒构建 |
| 2.2.2 重组蛋白的表达、纯化及检测 |
| 2.2.3 鞭毛素蛋白胞外TLR5刺激信号活性检测实验 |
| 2.2.4 重组鞭毛素蛋白胞内NLRC4通路激活活性实验 |
| 2.2.5 肝内原代细胞的分离 |
| 2.2.6 脾淋巴细胞的分离 |
| 2.2.7 CD8~+T细胞磁珠纯化 |
| 2.2.8 骨髓来源DCs(BMDCs)的诱导 |
| 2.2.9 肝脏浸润淋巴细胞分离 |
| 2.2.10 肝细胞的体外刺激及细胞因子检测 |
| 2.2.11 肝细胞与脾淋巴细胞共培养 |
| 2.2.12 鞭毛素蛋白体内处理 |
| 2.2.13 急性HBV动物模型建立和处理 |
| 2.2.14 慢性HBV动物模型的建立和鞭毛素蛋白处理 |
| 2.2.15 免疫组化 |
| 2.2.16 ELISA细胞因子检测 |
| 2.2.17 流式细胞术 |
| 2.2.18 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 鞭毛素蛋白减弱原代肝细胞的免疫抑制功能,调节CD8~+T细胞活化与功能 |
| 3.1.1 SF的纯化、鉴定与信号通路激活活性检测 |
| 3.1.2 SF调节肝细胞对T细胞功能的抑制作用 |
| 3.1.3 TLR5通路的激活减弱肝细胞对T细胞功能的抑制作用 |
| 3.1.4 SF刺激的肝细胞调节CD8~+T细胞的活化、分化和功能 |
| 3.1.5 SF刺激的肝细胞直接促进CD8~+T细胞的活化与功能,不依赖于APCs或 CD4~+T 细胞辅助 |
| 3.1.6 SF刺激的肝细胞能够提高抗原特异性CD8~+T细胞的活化和功能 |
| 3.1.7 小结 |
| 3.2 体内注射鞭毛素蛋白对肝细胞、肝内CD8~+T细胞和病毒复制的影响 |
| 3.2.1 腹腔注射SF能够改变肝细胞和肝内CD8~+T细胞的状态 |
| 3.2.2 多次腹腔注射SF对急性HBV复制和特异性CD8~+T 细胞应答的影响 |
| 3.2.3 高压水动力注射SF对肝内CD8~+T细胞和肝细胞的调节作用 |
| 3.2.4 高压水动力注射SF对急性HBV复制和病毒特异性T细胞应答的影响 |
| 3.2.5 小结 |
| 3.3 鞭毛素蛋白在慢性HBV治疗中的潜在应用价值 |
| 3.3.1 SF能够影响慢性HBV复制肝细胞的免疫调节能力 |
| 3.3.2 SF单独注射对慢性HBV复制的影响 |
| 3.3.3 SF在过继CD8~+T 细胞治疗慢性HBV实验中潜在的应用价值 |
| 3.3.4 小结 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 鞭毛素蛋白调节肝细胞免疫调节能力的潜在机制 |
| 4.2 鞭毛素蛋白对肝内细胞NLRC4炎症通路的激活情况 |
| 4.3 TLR5信号通路激活的肝细胞对其他细胞的调节作用 |
| 4.4 鞭毛素蛋白潜在的体内多种调节作用 |
| 4.5 鞭毛素蛋白体内注射对肝内细胞调节的时间与方式 |
| 4.6 TLRs激动剂对肝细胞免疫调节能力的不同影响 |
| 4.7 肠道微生物成分在肝内的潜在调节作用 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（4）基于金黄色葡萄球菌FnBPA和停乳链球菌GapC1-150的多表位疫苗免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 奶牛乳腺炎疫苗的研究进展 |
| 1.2.1 奶牛乳腺炎全菌体疫苗 |
| 1.2.2 奶牛乳腺炎荚膜多糖疫苗 |
| 1.3 金黄色葡萄球菌疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 金黄色葡萄球菌的致病机制 |
| 1.3.2 金黄色葡萄球菌亚单位疫苗 |
| 1.3.3 金黄色葡萄球菌FnBPA的研究进展 |
| 1.4 链球菌疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 链球菌的致病机制 |
| 1.4.2 链球菌亚单位疫苗的研究进展 |
| 1.4.3 链球菌GapC疫苗的研究进展 |
| 1.5 表位疫苗的研究进展 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 2 金黄色葡萄球菌FnBPA多表位疫苗免疫原性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 试剂盒及其他 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 多表位疫苗的设计 |
| 2.2.2 重组多表位肽原核表达载体鉴定 |
| 2.2.3 重组多表位肽表达纯化及表位肽合成 |
| 2.2.4 小鼠免疫接种及攻毒 |
| 2.2.5 小鼠脾淋巴细胞分离 |
| 2.2.6 脾淋巴细胞增殖检测 |
| 2.2.7 细胞因子水平检测 |
| 2.2.8 间接ELISA法检测血清IgG |
| 2.2.9 免疫小鼠器官中细菌定殖检测 |
| 2.2.10 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组表位肽质粒鉴定 |
| 2.3.2 重组多表位肽表达及纯化结果 |
| 2.3.3 多表位疫苗诱导的淋巴细胞增殖 |
| 2.3.4 多表位疫苗诱导的特异性细胞因子水平 |
| 2.3.5 多表位疫苗诱导的血清IgG水平 |
| 2.3.6 免疫小鼠器官中的细菌定殖量 |
| 2.4 讨论 |
| 3 停乳链球菌GapC_(1-150) 多表位疫苗免疫原性研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 试剂盒及其他 |
| 3.1.5 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 多表位疫苗的设计 |
| 3.2.2 重组多表位肽原核表达载体鉴定 |
| 3.2.3 重组多表位肽表达纯化及表位肽合成 |
| 3.2.4 小鼠免疫接种及攻毒 |
| 3.2.5 小鼠脾淋巴细胞分离 |
| 3.2.6 脾淋巴细胞增殖检测 |
| 3.2.7 细胞因子水平检测 |
| 3.2.8 间接ELISA法检测血清IgG水平 |
| 3.2.9 免疫小鼠器官中的细菌定殖检测 |
| 3.2.10 统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组多表位肽质粒鉴定 |
| 3.3.2 重组多表位肽表达及纯化结果 |
| 3.3.3 多表位疫苗诱导的淋巴细胞增殖 |
| 3.3.4 多表位疫苗诱导的特异性细胞因子水平 |
| 3.3.5 多表位疫苗诱导的血清IgG水平 |
| 3.3.6 免疫小鼠器官中的细菌定殖量 |
| 3.4 讨论 |
| 4 FnBPA和 GapC_(1-150) 多表位疫苗免疫原性研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌株和质粒 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 试剂盒及其他 |
| 4.1.5 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 多表位疫苗的设计 |
| 4.2.2 重组多表位肽原核表达载体鉴定 |
| 4.2.3 重组多表位的表达纯化及多肽的合成 |
| 4.2.4 小鼠免疫接种及攻毒 |
| 4.2.5 小鼠的脾淋巴细胞分离 |
| 4.2.6 脾淋巴细胞增殖检测 |
| 4.2.7 细胞因子水平检测 |
| 4.2.8 间接ELISA法检测血清IgG |
| 4.2.9 免疫小鼠器官中细菌定殖量检测 |
| 4.2.10 统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组多表位肽质粒鉴定 |
| 4.3.2 重组多表位肽表达及纯化结果 |
| 4.3.3 多表位疫苗诱导的淋巴细胞增殖 |
| 4.3.4 多表位疫苗诱导的特异性细胞因子水平 |
| 4.3.5 多表位疫苗诱导的血清IgG水平 |
| 4.3.6 免疫小鼠器官中的细菌定殖量 |
| 4.4 讨论 |
| 5 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（5）LAG3干扰寡核苷酸作为重组蛋白疫苗和灭活流感病毒疫苗佐剂的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 LAG3概述 |
| 1.1 LAG3的结构 |
| 1.2 LAG3的配体 |
| 1.2.1 MHCⅡ分子 |
| 1.2.2 Galectin-3 |
| 1.2.3 LSECtin |
| 1.2.4 FGL1 |
| 1.2.5 α-突触核蛋白 |
| 1.3 LAG3的表达 |
| 1.4 LAG3的表达调控 |
| 1.5 LAG3的信号转导通路 |
| 2 LAG3的免疫调节 |
| 2.1 LAG3对效应T细胞的调节 |
| 2.2 LAG3对Treg细胞的调节 |
| 2.3 LAG3对其他免疫细胞的调节 |
| 2.3.1 LAG3对pDC的调节 |
| 2.3.2 LAG3对NK细胞及NKT细胞的调节 |
| 3 靶向LAG3免疫治疗的应用 |
| 3.1 LAG3可溶性融合蛋白(IMP321)的应用 |
| 3.2 抗LAG3单克隆抗体的应用 |
| 4 佐剂的研究进展 |
| 4.1 矿物盐类佐剂 |
| 4.2 乳化剂 |
| 4.3 脂质体 |
| 4.4 模式识别受体激动剂 |
| 4.5 其它类型的佐剂 |
| 5 RNA靶向性寡核苷酸药物的研究进展 |
| 5.1 RNA靶向性寡核苷酸药物的分类及作用机制 |
| 5.1.1 ASO |
| 5.1.2 siRNA |
| 5.2 RNA靶向性寡核苷酸药物的化学修饰 |
| 5.3 RNA靶向性寡核苷酸药物的应用 |
| 6 肿瘤裂解物疫苗的研究进展 |
| 7 IFN-γ与疾病发生 |
| 7.1 IFN-γ的概述 |
| 7.2 IFN-γ与感染性休克 |
| 7.3 IFN-γ与乳糜泻 |
| 7.4 IFN-γ与过敏性肺炎 |
| 7.5 IFN-γ与造血功能障碍 |
| 7.6 IFN-γ与其它疾病 |
| 8 CD8~+T细胞与疾病发生 |
| 8.1 CD8~+T细胞概述 |
| 8.2 CD8~+T与多发性硬化 |
| 8.3 CD8~+T细胞与哮喘 |
| 8.4 CD8~+T细胞与动脉粥样硬化 |
| 8.5 CD8~+T细胞与肿瘤 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 LAG3干扰寡核苷酸对LAG3表达的影响 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 实验动物和细胞 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.2 主要实验试剂及仪器 |
| 1.2.1 寡核苷酸 |
| 1.2.2 重组蛋白 |
| 1.2.3 其它试剂 |
| 1.2.4 实验仪器与耗材 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 人和小鼠LAG3 m RNA序列的比对及反义寡核苷酸靶向区域的确定 |
| 1.3.2 LAG3反义寡核苷酸的分析与筛选 |
| 1.3.3 LAG3反义寡核苷酸的合成 |
| 1.3.4 疫苗的配制 |
| 1.3.5 小鼠免疫 |
| 1.3.6 小鼠脾细胞及淋巴结细胞的分离 |
| 1.3.7 细胞的培养 |
| 1.3.8 流式细胞术 |
| 1.3.9 免疫荧光实验 |
| 1.3.10 RT-PCR |
| 1.3.11 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 LAG3干扰寡核苷酸的设计与筛选 |
| 2.1.1 LAG3干扰寡核苷酸靶向区域的筛选 |
| 2.1.2 候选反义寡核苷酸的评估 |
| 2.2 LIO进入免疫细胞的情况 |
| 2.2.1 淋巴结中各类型免疫细胞对LIO的摄取 |
| 2.2.2 脾中各类型免疫细胞对LIO的摄取 |
| 2.2.3 LIO在T细胞中的定位 |
| 2.3 LIO对LAG3表达的影响 |
| 2.3.1 LIO对脾细胞LAG3 m RNA表达的影响 |
| 2.3.2 LIO对引流淋巴结细胞中CD4~+T及CD8~+T细胞LAG3蛋白表达的影响 |
| 2.3.3 LIO对脾细胞中CD4~+T及CD8~+T细胞LAG3蛋白表达的影响 |
| 2.3.4 LIO对Jurkat细胞LAG3蛋白表达的影响 |
| 3 小结 |
| 第二章 LIO作为重组蛋白疫苗和灭活病毒疫苗佐剂的效果 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 实验动物及细胞 |
| 1.2 主要实验试剂及仪器 |
| 1.2.1 重组蛋白及病毒 |
| 1.2.2 其他试剂 |
| 1.2.3 实验仪器与耗材 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 疫苗的配制 |
| 1.3.2 动物免疫 |
| 1.3.3 T细胞增殖实验 |
| 1.3.4 流式细胞术 |
| 1.3.5 实时定量PCR |
| 1.3.6 间接ELISA |
| 1.3.7 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 在recall反应中LIO对诱导抗原特异性效应T细胞反应的影响 |
| 2.1.1 LIO对T细胞增值影响的时间点摸索 |
| 2.1.2 LIO对recall反应中抗原特异性T细胞增值的影响 |
| 2.1.3 在recall反应中LIO对T细胞产生细胞因子能力的影响 |
| 2.2 LIO维持抗原特异性T细胞活化的效应 |
| 2.2.1 LIO对引流淋巴结细胞中T细胞CD69表达的影响 |
| 2.2.2 LIO对脾细胞中T细胞CD69表达的影响 |
| 2.2.3 LIO对引流淋巴结细胞中Th1和Th2型细胞因子产生的影响 |
| 2.2.4 LIO对脾细胞中Th1和Th2型细胞因子产生的影响 |
| 2.3 LIO-1 对T细胞反应影响的特异性 |
| 2.4 LIO对抗原非特异性T细胞增殖的影响 |
| 2.5 LIO对LAG3配体MHCⅡ的影响 |
| 2.5.1 LIO对引流淋巴结细胞中DC细胞MHCⅡ表达的影响 |
| 2.5.2 LIO对脾细胞中DC细胞MHCⅡ表达的影响 |
| 2.6 LIO作为重组蛋白疫苗及灭活病毒疫苗佐剂的效果 |
| 2.6.1 LIO-1 作为微生物疫苗佐剂的剂量摸索 |
| 2.6.2 LIO-2 对重组蛋白疫苗诱导的抗体反应的影响 |
| 2.6.3 LIO-1 作为重组蛋白疫苗佐剂的效果 |
| 2.6.4 LIO-1 作为灭活流感病毒疫苗佐剂的效果 |
| 3 小结 |
| 第三章 CD8~+T细胞和IFN-γ与小鼠十二指肠坏死的相关性观察 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 实验动物及细胞 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.2 主要实验试剂及仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 Lewis肺癌细胞的接种 |
| 1.3.2 Lewis肺癌肿瘤裂解物的制备及疫苗配制 |
| 1.3.3 Lewis肺癌皮下移植瘤模型的建立 |
| 1.3.4 小鼠外周血白细胞的分离 |
| 1.3.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Lewis肺癌肿瘤裂解物的制备 |
| 2.2 LIO-1 联合肿瘤裂解物疫苗治疗Lewis肺癌的效果 |
| 2.3 Lewis肺癌肿瘤裂解物疫苗对小鼠的脏器损伤 |
| 2.4 小鼠十二指肠坏死与外周血IFN-γ产生的相关性 |
| 2.5 小鼠十二指肠坏死与外周血T细胞的相关性 |
| 2.6 小鼠十二指肠坏死与脾及引流淋巴结中T细胞的相关性 |
| 3 小结 |
| 第三篇 讨论 |
| 第四篇 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）结核分枝杆菌抗原致骨髓造血细胞增殖分化异常实验研究暨烯醇化酶-1单克隆抗体制备与作用初步研究（论文提纲范文）
| 缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 结核分枝杆菌抗原持续刺激致骨髓造血细胞增殖分化异常实验研究 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 结核病与免疫耗竭 |
| 1.1.2 T细胞免疫耗竭 |
| 1.1.3 骨髓造血干细胞及其增殖分化调节 |
| 1.1.4 分枝杆菌感染可影响造血干细胞的分化 |
| 1.1.5 造血干细胞功能障碍与T细胞耗竭 |
| 1.1.6 选题思路 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验材料和仪器 |
| 1.2.2 实验对象 |
| 1.2.3 实验方法 |
| 1.2.3.1 BCG的培养 |
| 1.2.3.2 SDS-PAGE蛋白电泳相关试剂配制及方法 |
| 1.2.3.3 蛋白抗原制备 |
| 1.2.3.4 结核分枝杆菌抗原持续刺激致骨髓造血细胞增殖分化异常模型的建立 |
| 1.2.3.5 IL-2对骨髓造血细胞增殖分化异常的干预治疗 |
| 1.2.4 统计学分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 BCG的培养 |
| 1.3.2 蛋白抗原的制备 |
| 1.3.3 结核分枝杆菌抗原持续刺激致骨髓造血细胞增殖分化异常模型的检测结果 |
| 1.3.3.1 结核分枝杆菌抗原持续刺激致脾脏抗原特异性CD4~+T细胞分泌IFN-γ水平降低 |
| 1.3.3.2 结核分枝杆菌抗原持续刺激致TB10.4 _(4-12)特异性的记忆性CD8~+T细胞数量减少 |
| 1.3.3.3 结核分枝杆菌抗原持续刺激致骨髓LK细胞增殖能力下降 |
| 1.3.4 IL-2对骨髓造血细胞增殖分化异常的治疗作用 |
| 1.3.4.1 IL-2治疗使脾脏抗原特异性CD4~+ T细胞分泌IFN-γ水平升高 |
| 1.3.4.2 IL-2治疗使TB10.4 _(4-12)特异性的CD8~+记忆性T细胞数量增加 |
| 1.3.4.3 IL-2治疗后骨髓LK细胞的增殖能力回升 |
| 1.3.4.4 结核分枝杆菌抗原持续刺激和IL-2治疗后,骨髓造血细胞转录因子的变化 |
| 1.3.4.5 结核分枝杆菌抗原持续刺激和IL-2治疗后,骨髓造血微环境中细胞因子的变化 |
| 1.3.4.6 结核分枝杆菌抗原持续刺激和IL-2治疗后,JAK3和STAT5的表达上调 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 应用结核分枝杆菌抗原持续刺激模拟结核分枝杆菌感染引起的免疫病理损伤 |
| 1.4.2 骨髓造血细胞的表型鉴定 |
| 1.4.3 骨髓造血细胞与T细胞互相作用 |
| 1.4.4 结核分枝杆菌抗原持续刺激对细胞因子IFN-γ和IL-2分泌的影响 |
| 1.4.5 IFN-γ对骨髓造血干细胞的调节作用 |
| 1.4.6 IL-2对骨髓造血干细胞的调节作用 |
| 1.4.7 不同结核分枝杆菌抗原诱导T细胞耗竭的能力不同 |
| 1.4.8 骨髓造血细胞增殖分化异常与T细胞耗竭的关系 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 粟粒性肺结核的临床病例分析和BCG感染诱导骨髓造血细胞增殖分化异常实验研究 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.1.1 粟粒性肺结核与骨髓造血功能障碍 |
| 2.1.2 分枝杆菌感染与造血干细胞分化 |
| 2.1.3 细胞因子网络对造血干细胞增殖分化的调节作用 |
| 2.1.4 选题思路 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料和仪器 |
| 2.2.2 实验对象 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.3.1 BCG感染动物模型的建立 |
| 2.2.3.2 IL-2对大剂量BCG入血感染小鼠的干预治疗 |
| 2.2.4 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 病例分析 |
| 2.3.2 BCG感染动物模型免疫检测结果 |
| 2.3.2.1 大剂量BCG入血感染致白细胞、淋巴细胞和血小板减少 |
| 2.3.2.2 大剂量BCG入血感染致小鼠脾脏、肺脏和肝脏肿大 |
| 2.3.2.3 大剂量BCG滴鼻感染致脾脏CD4~+T细胞表面高表达PD-1 |
| 2.3.2.4 大剂量BCG入血感染致脾脏CD8~+T细胞表面高表达PD-1 |
| 2.3.2.5 大剂量BCG滴鼻感染致脾脏CD4~+T细胞增殖能力增强 |
| 2.3.2.6 大剂量BCG入血感染致脾脏CD8~+T细胞增殖能力降低 |
| 2.3.2.7 BCG感染对外周血血清中IFN-γ的影响 |
| 2.3.2.8 BCG感染对脾脏T细胞分泌细胞因子的影响 |
| 2.3.2.9 BCG感染对骨髓LK细胞增殖能力的影响 |
| 2.3.2.10 BCG感染对骨髓造血微环境中细胞因子水平的影响 |
| 2.3.2.11 BCG感染对骨髓LK细胞转录因子表达的影响 |
| 2.3.3 IL-2治疗大剂量BCG入血感染动物模型的效果评价 |
| 2.3.3.1 IL-2治疗可降低脾脏CD8~+T细胞PD-1的表达 |
| 2.3.3.2 IL-2治疗可增强脾脏T细胞的增殖能力 |
| 2.3.3.3 IL-2治疗可部分逆转骨髓LK细胞的增殖能力 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 临床粟粒性肺结核的血液学变化 |
| 2.4.2 BCG感染途径和剂量对T细胞及骨髓造血功能的影响 |
| 2.4.3 BCG感染模型与临床粟粒性肺结核感染 |
| 2.4.4 BCG感染后骨髓造血微环境细胞因子的变化与骨髓造血细胞增殖分化异常 |
| 2.4.5 BCG感染后骨髓造血细胞增殖能力改变 |
| 2.4.6 后续研究计划 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 糖酵解酶ENO1单克隆抗体制备及其作用初步研究 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.1.1 糖代谢 |
| 3.1.2 烯醇化酶1(ENO1)与糖代谢 |
| 3.1.3 ENO1与肿瘤 |
| 3.1.4 ENO1与宫颈癌 |
| 3.1.5 单克隆抗体的制备 |
| 3.1.6 腺相关病毒(AAV) |
| 3.1.7 选题思路 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料和仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 重组质粒pcDNA3.1-ENO1的构建 |
| 3.2.2.2 PcDNA3.1-ENO1在HEK-293T细胞中的表达和纯化 |
| 3.2.2.3 PcDNA3.1-ENO1转染CHO-K1细胞 |
| 3.2.2.4 PFastBac1-ENO1的构建 |
| 3.2.2.5 ENO1蛋白的表达和纯化 |
| 3.2.2.6 ENO单克隆抗体制备 |
| 3.2.2.7 ENO1单克隆抗体对宫颈癌细胞迁移侵袭能力的抑制作用 |
| 3.2.2.8 杂交瘤细胞RNA提取 |
| 3.2.2.9 ENO1单克隆抗体可变区基因测序 |
| 3.2.2.10 腺相关病毒载体包装ENO1单抗可变区基因 |
| 3.2.3 统计学处理 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 重组质粒pcDNA3.1-ENO1的构建 |
| 3.3.2 PcDNA3.1-ENO1在HEK-293T细胞中的表达和纯化 |
| 3.3.3 PcDNA3.1-ENO1转染CHO-K1细胞 |
| 3.3.4 ENO1基因在杆状病毒表达载体中的克隆、表达和纯化 |
| 3.3.5 ENO1单克隆抗体的制备 |
| 3.3.6 ENO1单克隆抗体对宫颈癌细胞迁移侵袭能力的抑制作用 |
| 3.3.7 ENO1单克隆抗体单克隆抗体可变区基因测序 |
| 3.3.8 腺相关病毒包装ENO1单克隆抗体可变区基因 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 真核表达系统的选择 |
| 3.4.2 单克隆抗体的制备及测序 |
| 3.4.3 ENO1单克隆抗体对宫颈癌细胞迁移侵袭能力的抑制作用 |
| 3.4.4 腺相关病毒载体的应用 |
| 3.4.5 后续研究计划 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成果 |
| 致谢 |
（7）呼伦贝尔牛羊淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）流行病学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 东北地区常见蜱传疾病 |
| 1.1 蜱传立克次体病 |
| 1.2 蜱传埃立克体病 |
| 1.3 莱姆病 |
| 1.4 蜱传脑炎 |
| 1.5 发热伴血小板减少综合征 |
| 1.6 蜱源淋巴细胞性脉络丛脑膜炎 |
| 1.7 蜱传无形体病 |
| 1.8 蜱传巴贝西虫病 |
| 第二章 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒研究进展 |
| 2.1 LCMV概述 |
| 2.2 LCMV病毒特征 |
| 2.3 LCMV致病机理 |
| 2.4 LCMV流行病学研究 |
| 2.5 LCMV检测诊断 |
| 2.6 LCMV预防治疗 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 内蒙古呼伦贝尔地区牛羊LCMV血清流行病学调查 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 内蒙古呼伦贝尔地区牛羊LCMV分子流行病学调查 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（8）温州病毒血清流行率调查研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 研究思路 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在学期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）新型分节段黄病毒的发现及其流行病学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 黄病毒概述 |
| 1.1.1 黄病毒研究史 |
| 1.1.2 黄病毒生命周期机制 |
| 1.1.3 黄病毒主要蛋白结构及功能 |
| 1.1.4 黄病毒的宿主范围及流行病学 |
| 1.1.5 黄病毒检测方法 |
| 1.2 分节段黄病毒的研究进展 |
| 1.2.1 分节段黄病毒研究史 |
| 1.2.2 分节段黄病毒基因组结构及编码蛋白功能 |
| 1.2.3 分节段黄病毒系统发育分析 |
| 1.2.4 分节段黄病毒宿主范围及地域分布 |
| 1.3 东北地区重要的蜱传人兽共患病原流行情况 |
| 1.3.1 蜱传森林脑炎病毒 |
| 1.3.2 发热伴血小板减少综合征病毒 |
| 1.3.3 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒 |
| 1.3.4 斑点热群立克次体 |
| 1.3.5 无形体 |
| 1.3.6 伯氏疏螺旋体 |
| 1.3.7 巴贝西虫 |
| 1.4 总结与展望 |
| 第二章 ALSV的分离鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病人样品及细胞 |
| 2.1.2 主要仪器与试剂 |
| 2.1.3 病人样品病毒宏基因组学前期制备 |
| 2.1.4 ALSV阳性样品筛选 |
| 2.1.5 病毒的分离与鉴定 |
| 2.1.6 病毒的全基因组扩增 |
| 2.1.7 病毒在不同细胞的增殖能力分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 病毒宏基因组学测序结果 |
| 2.2.2 病毒的分离与鉴定结果 |
| 2.2.3 病毒全基因组扩增结果 |
| 2.2.4 病毒在不同细胞的增殖能力检测结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 ALSV全基因组的生物信息学分析 |
| 3.1 方法 |
| 3.1.1 基因序列选取 |
| 3.1.2 同源性分析 |
| 3.1.3 糖基化位点分析 |
| 3.1.4 信号肽分析 |
| 3.1.5 跨膜区域分析 |
| 3.1.6 ALSV基因组序列保守区分析 |
| 3.1.7 ALSV的系统发育进化分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 ALSV与黄病毒其他成员同源性分析结果 |
| 3.2.2 ALSV基因组序列糖基化位点分析结果 |
| 3.2.3 ALSV基因组序列信号肽分析结果 |
| 3.2.4 ALSV基因组序列跨膜区分析结果 |
| 3.2.5 ALSV基因组序列保守区分析结果 |
| 3.2.6 ALSV的系统发育进化分析结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 ALSV在蜱咬病人的流行病学分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 毒株、细胞与病人血样 |
| 4.1.2 主要仪器与试剂 |
| 4.1.3 蜱叮咬住院病人的ALSV感染情况筛查 |
| 4.1.4 ALSV感染病人其他蜱传病原体检测 |
| 4.1.5 ALSV感染病人病例整理分析 |
| 4.1.6 ALSV感染病人阳转情况检测 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 蜱叮咬住院病人ALSV检测结果及人口统计学分析结果 |
| 4.2.2 ALSV感染病人其他蜱传病检测结果 |
| 4.2.3 ALSV感染病人临床症状及生化指标统计分析结果 |
| 4.2.4 ALSV感染病人阳转情况检测结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 ALSV在动物中的流行病学分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 毒株、细胞与样品采集 |
| 5.1.2 主要仪器与试剂 |
| 5.1.3 主要溶液及配置 |
| 5.1.4 ALSV VP2 原核表达 |
| 5.1.5 牛羊血清ALSV抗体ELISA方法检测 |
| 5.1.6 牛羊血清ALSV中和抗体实验 |
| 5.1.7 牛羊血清样品ALSV实时荧光定量PCR检测 |
| 5.1.8 ALSV阳性样品的病毒分离与鉴定 |
| 5.1.9 系统发育进化分析 |
| 5.1.10 统计学分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 ALSV VP2 蛋白重组表达 |
| 5.2.2 牛羊血清ALSV抗体ELISA检测结果 |
| 5.2.3 牛羊血清中和抗体检测结果 |
| 5.2.4 ALSV荧光定量RT-q PCR检测方法建立 |
| 5.2.5 牛羊血清样品分子生物学检测结果 |
| 5.2.6 牛羊样品血清学及分子生物学检测结果比较 |
| 5.2.7 蜱样品分子生物学检测结果 |
| 5.2.8 ALSV阳性样品病毒分离 |
| 5.2.9 不同宿主分离ALSV毒株遗传进化分析 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）CSFV和PCV2感染后免疫抑制性受体转录水平研究及阻断猪PD-1/PD-L1通路多肽基序鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 免疫抑制性受体的研究进展 |
| 1.1 PD-1及其配体的发现和结构鉴定 |
| 1.2 PD-1/PD-Ls分子传导通路 |
| 1.3 PD-1和PD-Ls的表达和调节 |
| 1.4 PD-1/PD-L1通路与病毒感染 |
| 1.5 免疫抑制性受体CTLA-4和LAG-3的研究进展 |
| 1.6 猪免疫抑制性受体的研究进展 |
| 2. 猪瘟致病机制研究进展 |
| 2.1 猪瘟 |
| 2.2 猪瘟病毒 |
| 2.3 CSFV免疫致病机制 |
| 3. 断奶仔猪多系统衰竭综合征致病机制研究进展 |
| 3.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征 |
| 3.2 PMWS病原 |
| 3.3 PMWS免疫致病机制 |
| 4. 本课题研究目的与意义 |
| 第二章 猪感染CSFV后PD-1及其配体转录水平研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 病毒、细胞和试验动物 |
| 2.2 主要生物学试剂 |
| 2.3 主要溶液配制 |
| 2.4 主要仪器 |
| 2.5 CSFV的繁殖及TCID_(50)的测定 |
| 2.5.1 CSFV繁殖 |
| 2.5.2 CSFV TCID_(50)测定 |
| 2.6 实时荧光定量PCR(qPCR)检测目的基因mRNA方法的建立 |
| 2.6.1 引物设计与合成 |
| 2.6.2 PBMC分离 |
| 2.6.3 PBMCs中总RNA抽提 |
| 2.6.4 反转录合成cDNA |
| 2.6.5 qPCR阳性标准品制备 |
| 2.6.6 qPCR标准曲线建立 |
| 2.7 Taqman探针qPCR检测CSFV方法的建立 |
| 2.7.1 引物与探针的设计与合成 |
| 2.7.2 Taqman探针qPCR阳性标准品准备 |
| 2.7.3 Taqman探针qPCR标准曲线建立 |
| 2.7.4 敏感性试验 |
| 2.7.5 特异性试验 |
| 2.8 检测CSFV感染过程中PD-1与其配体转录水平及免疫效应变化 |
| 2.8.1 人工感染CSFV |
| 2.8.2 qPCR检测PD-1、PD-L1、PD-L2及其细胞因子IL-2和IL-10 |
| 2.8.3 qPCR结果分析 |
| 2.8.4 检测血浆中CSFV载量 |
| 2.8.5 T细胞增殖能力检测 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 CSFV鉴定与TCID_(50)的测定 |
| 3.2 qPCR检测PD-1、PD-L1、PD-L2及细胞因子IL-2、IL-10标准曲线的建立 |
| 3.3 Taqman探针qPCR检测CSFV方法的建立 |
| 3.3.1 标准曲线的建立 |
| 3.3.2 敏感性 |
| 3.3.3 特异性 |
| 3.4 人工感染CSFV |
| 3.5 感染CSFV过程中PD-1、PD-L1和PD-L2 mRNA转录变化 |
| 3.6 感染CSFV过程中IL-2和IL-10 mRNA转录变化和T细胞增殖能力的检测 |
| 3.7 血浆中CSFV载量 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 PD-1及其配体PD-L1和PD-L2表达 |
| 4.2 细胞因子IL-2和IL-10表达及T细胞增殖能力 |
| 4.3 CSFV载量 |
| 5. 小结 |
| 第三章 自然感染PCV2后免疫抑制性受体转录水平研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 主要生物学试剂 |
| 2.2 主要溶液配制 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 试验动物 |
| 2.5 qPCR引物设计与合成 |
| 2.6 qPCR检测目的基因方法的建立 |
| 2.7 自然PCV2感染过程中主要免疫抑制性受体及细胞因子转录水平研究 |
| 2.7.1 试验动物 |
| 2.7.2 PMWS的PCR病原检测 |
| 2.7.3 qPCR检测免疫抑制性受体和细胞因子转录水平 |
| 2.7.4 检测PBMCs增殖能力 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 qPCR检测CTLA-4、LAG-3、PTEN及细胞因子IFN-γ标准曲线的建立 |
| 3.2 PMWS的病原检测 |
| 3.3 qPCR检测主要免疫抑制性受体的基因转录水平 |
| 3.4 qPCR检测细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-10转录变化 |
| 3.5 PBMCs增殖 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 病原检测 |
| 4.2 PCV2感染后免疫抑制性受体和配体的表达 |
| 4.3 PCV2感染后细胞因子表达与PBMC增殖 |
| 5. 小结 |
| 第四章 阻断猪PD-1/PD-L1通路的多肽基序鉴定 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂及免疫动物 |
| 2.2 主要溶液配制 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 固相法合成多肽基本流程 |
| 2.5 多肽设计 |
| 2.6 固相法合成多肽程序 |
| 2.6.1 溶胀Rink amide-MBHA Resin树脂 |
| 2.6.2 多肽合成酰化程序 |
| 2.6.3 Kaiser法检测多肽合成缩合反应 |
| 2.6.4 脱保护基团 |
| 2.6.5 多肽合成重复程序 |
| 2.6.6 TFA法裂解多肽 |
| 2.6.7 合成多肽沉淀及脱盐纯化 |
| 2.6.8 鉴定合成多肽纯度及结构特性 |
| 2.7 多肽的溶解 |
| 2.8 多肽标记FITC |
| 2.9 多肽PD-15阻断PD-1/PD-L1通路促进PBMC增殖能力 |
| 2.10 多肽PD-15与猪重组蛋白PD-L1结合 |
| 2.11 FITC标记多肽与PBMC结合 |
| 2.12 多肽PD-15作为佐剂免疫效果评价 |
| 2.12.1 免疫小鼠 |
| 2.12.2 ELISA检测抗体水平 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 多肽PD-15阻断后对PBMCs增殖影响 |
| 3.2 多肽PD-15与猪重组蛋白PD-L1的结合 |
| 3.3 多肽PD-15与PBMCs结合 |
| 3.4 测定多肽PD-15纯度及氨基酸序列 |
| 3.5 多肽PD-15对体液免疫的影响 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 固相多肽合成 |
| 4.2 多肽溶解 |
| 4.3 多肽阻断PD-1/PD-L1通路促进PBMC增殖 |
| 4.5 PD-15作为免疫佐剂对抗体水平的影响 |
| 5. 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 患PMWS断奶仔猪图片 |
| 博士期间发表论文及成果 |
四、LCMV重组蛋白抗原应用研究（论文参考文献）
- [1]IL10在牛副流感病毒3型感染中的作用及其调控机制[D]. 高明春. 吉林大学, 2021
- [2]ETEC K99-SIgA复合物制备及其增强肠道黏膜免疫应答的研究[D]. 陈小燕. 黑龙江八一农垦大学, 2021(09)
- [3]鞭毛素蛋白调节肝内T细胞免疫应答的机制及应用[D]. 闫虎. 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所), 2020(02)
- [4]基于金黄色葡萄球菌FnBPA和停乳链球菌GapC1-150的多表位疫苗免疫原性研究[D]. 马骏. 黑龙江八一农垦大学, 2020(09)
- [5]LAG3干扰寡核苷酸作为重组蛋白疫苗和灭活流感病毒疫苗佐剂的研究[D]. 李志琴. 吉林大学, 2019(02)
- [6]结核分枝杆菌抗原致骨髓造血细胞增殖分化异常实验研究暨烯醇化酶-1单克隆抗体制备与作用初步研究[D]. 李菲. 兰州大学, 2019
- [7]呼伦贝尔牛羊淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）流行病学研究[D]. 张力. 吉林农业大学, 2019(03)
- [8]温州病毒血清流行率调查研究[D]. 刘莎莎. 北京协和医学院, 2019(02)
- [9]新型分节段黄病毒的发现及其流行病学研究[D]. 王泽东. 中国农业科学院, 2019
- [10]CSFV和PCV2感染后免疫抑制性受体转录水平研究及阻断猪PD-1/PD-L1通路多肽基序鉴定[D]. 岳锋. 四川农业大学, 2015(12)