一、树突状细胞经EB病毒膜抗原gp340刺激后诱导抗肿瘤免疫应答（论文文献综述）
李红玉[1]（2021）在《HLA-DPB1和EB病毒gp42蛋白的结合方式与新疆地区霍奇金淋巴瘤发病的相关性研究》文中进行了进一步梳理研究目的:为了探索EB病毒与新疆地区霍奇金淋巴瘤的发病的相关性,了解新疆地区霍奇金淋巴瘤患者的临床现状,在已筛选出新疆地区人群与霍奇金淋巴瘤相关HLA-DPB1分型的基础上,进一步检测新疆地区健康人群HLA-DPB1亚型与霍奇金淋巴瘤HLA-DPB1亚型与EB病毒gp42的的结合方式、结合力的大小及差异。研究方法:1)我们使用慢病毒感染的方式,对T1细胞进行HLA-DPB1亚型的慢病毒感染,构建HLA-DPB1重组载体;2)使用免疫荧光标记的方法标记gp42蛋白,探索不同浓度下,gp42蛋白与HLA-DPB1重组载体的结合效率,获取最佳的gp42蛋白的结合浓度;3)使用流式细胞术检测HLA-DP+gp42+双阳性细胞,计算HLA-DPB1亚型与gp42蛋白亲和力大小及差异;4)我们使用分子动力学模拟的方式模拟gp42蛋白和HLA-DPB1亚型的结合,获取两者的结合方式、结合形态及所形成复合物的基本属性;5)回顾性分析在2016年1月1日至2020年9月1日期间初次就诊于新疆肿瘤医院的霍奇金淋巴瘤患者105例,收集该患者的临床特征,结合实验室检查结果及病理组织学检测,利用SPSS16.0软件进行统计学分析,探讨EB病毒感染者与非EB病毒感染者之间的临床特征及病理学特征的差异;6)分别选取EB病毒阳性霍奇金淋巴瘤患者15例及淋巴结反应性增生的患者10例,检测两组患者的CD3、CD4、CD8、PD1、PDL-1、HLA-DPB1、LMP1、CD30等分子的表达,对比免疫功能及表达产物的差异。研究结果:1)T1细胞进行慢病毒感染的最佳条件是选择B2助感染液、MOI=100、感染时间为72小时,在此基础上成功构建LV-DPB1-H组和LV-DPB1-HL组质粒载体;2)探索出gp42蛋白的最佳结合浓度,即gp42蛋白在80μg浓度时,HLA-DPB1与gp42的结合效率最高;3)HLA-DPB1的B链与gp42的A链通过氢键结合形成一个复合物,该复合物属亲水类蛋白,Resolution为3.25;4)LV-DPB1-HL组的HLA-DP+gp42+的双阳性率明显高与LV-DPB1-H组（29.467±2.108vs 15.867±0.929）,差异具有统计学意义;5)收集了105例霍奇金淋巴瘤患者的临床资料及病理特征并进行统计学分析,单因素分析结果显示:性别（P=0.007<0.1）、年龄（P=0.000<0.1）,Ann Arbor分期（P=0.088<0.1）、病理分型（P=0.000<0.1）是影响EB病毒阳性预后的因素;经多因素COX回归分析结果显示:年龄是影响EB病毒阳性霍奇金淋巴瘤预后的独立因素（P=0.000<0.05,HR:1.026,95%CI:1.014～1.042）;6)通过对15例EB病毒阳性霍奇金淋巴瘤患者及10例淋巴结反应性增生患者的免疫功能及表达产物分析,EB病毒阳性霍奇金淋巴瘤患者中LMP1、CD30、PDL1的表达量均高于EB病毒阳性淋巴结反应性增生患者,提示LMP1、CD30、PDL1与EB病毒阳性霍奇金淋巴瘤患者的发病机制存在相关性;与对照组相比,CD4+T细胞在病例组中的表达比例升高,差异有统计学意义;CD8+T细胞在病例组中的表达比例降低,差异有统计学意义;HLA-DPB1的表达量在病例组vs对照组的比例降低,差异有统计学意义。研究结论:EB病毒的gp42蛋白可以与人类白细胞抗原HLA-DPB1在细胞表面相结合,在gp42蛋白的浓度达到80μg时,两个蛋白可以达到较高的结合效率,共同结合后可以在细胞内作用,导致人体的免疫抑制作用发生改变,共同参与到霍奇金淋巴瘤的发病过程中。在EB病毒阳性霍奇金淋巴瘤组中,性别、部位、EBV-DNA复制、Ann Arbor分期、病理组织分型、初始治疗方案与EB病毒感染患者的预后无相关性,但年龄、血液EB病毒检测是影响EB病毒感染患者预后的独立预后因素,且EB病毒感染后,霍奇金淋巴瘤的免疫功能及免疫产物较淋巴结反应性增生均发生变化。因此,我们也许可以通过降低gp42浓度,即降低EB病毒的感染率来降低霍奇金淋巴瘤的发病;另一方面,根据分子动力学模拟的结果:我们可以通过断裂氢键、阻止亲水性结合等方式阻止疾病的发生,这些数据可能为后期霍奇金淋巴瘤的治疗方式及疫苗研究提供一定的参考价值。
马占川[2]（2020）在《MDSC分泌的Arg-1对肠炎小鼠Th17细胞的影响及橡黄素治疗机制的研究》文中进行了进一步梳理研究背景与目的:在炎症性肠炎（Inflammatory bowel disease,IBD）中,多种免疫细胞和肠道菌群相互影响共同导致肠炎进展。其中,由于Th17细胞在肠炎中的关键作用成为近年来研究的热点。我们先前的研究结果表明髓系来源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSC）通过分泌 Ⅰ 型精氨酸酶（arginase-1,Arg-1）促进Th17细胞的分化,从而加重系统性红斑狼疮的进展。但是在炎症性肠炎中,MDSC与Th17细胞的关系仍不明确,阻碍了肠炎治疗的研究。此外,橡黄素在肠炎治疗中的表现出一定功效,但其作用机制还有待于进一步研究。因此,本研究以髓系细胞Arg-1敲除（ArgmyeKO）小鼠构建肠炎模型,研究MDSC对Th17细胞功能的影响,并探究橡黄素在肠炎治疗中的作用机制,为炎症性肠炎的治疗提供新的思路。研究方法:（1）3.5%葡聚糖硫酸钠喂养ArgmyeKO小鼠或野生型小鼠8～12天得到肠炎小鼠。从喂养之日起每天记录小鼠体重,对粪便硬度,粪便潜血水平进行评分,直至小鼠死亡,测量结直肠长度。以时间为横坐标评分为纵坐标绘制肠炎小鼠疾病得分曲线,以时间为横坐标存活率为纵坐标绘制肠炎小鼠生存曲线,对比两组肠炎小鼠结直肠长度,借此评估肠炎状态下Arg-1对小鼠的影响。（2）流式分选纯化肠炎小鼠脾脏MDSC,与带有CFSE标记的CD3、CD28刺激的小鼠T细胞共培养3天,流式检测评估Arg-1敲除对MDSC功能的影响。（3）在肠炎发病前后收集小鼠外周血,脾脏细胞以及派氏集合淋巴结细胞检测MDSC、Th17细胞、Treg细胞以及γδT细胞的比例。取肠炎小鼠结直肠做HE染色评估免疫细胞浸润状态和肠粘膜屏障受损情况。（4）流式检测肠炎小鼠MDSC Arg-1的分泌,检测Th17细胞IL-17A、IL-17F以及IL-22的分泌;荧光定量PCR检测肠炎小鼠结直肠组织中ACTI、IL-22、IL-23、OCLN、COX-2 的表达。（5）流式分选纯化野生型小鼠脾脏MDSC,转输给ArgmyeKO小鼠,记录小鼠体重,粪便硬度,便血程度,结直肠长度。流式检测转输MDSC后肠炎小鼠派氏集合淋巴结和肠黏膜淋巴结中Th17细胞IL-17A、IL-17F的表达水平。（6）在第0,3,5,7天给肠炎小鼠腹腔注射橡黄素,橡黄素用量按0.5 μM/g体重计算。记录小鼠体重,粪便硬度,便血程度,结直肠长度。流式检测肠炎小鼠外周血,脾脏以及肠道固有层中MDSC 比例以及Arg-1和pSTAT3的水平,分选脾脏MDSC荧光定量PCR检测ESRI、ESR2的水平,检测小鼠脾脏和外周血派氏集合淋巴结和肠黏膜淋巴结中Th17细胞和γδT细胞IL-17A、IL-17F的表达水平。荧光定量PCR检测橡黄素治疗后肠炎小鼠结直肠组织中ACT1、IL-22、IL-23、OCLN、COX-2 的表达。研究结果:（1）肠炎期间Argmye KO小鼠体重下降明显,便血严重,肠组织中大量免疫细胞浸润,死亡率高于WT组小鼠。（2）肠炎期间ArgmyeKO小鼠结直肠组织IL-17A表达水平低于WT组小鼠;IL-17F表达水平高于WT组小鼠。ArgmyeKO小鼠派氏集合淋巴结中Th17细胞IL-17A的分泌量低于WT组小鼠,而IL-17F表达量则高于WT组小鼠。（3）肠炎期间ArgmyeKO小鼠肠组织和外周血中MDSC L比例低于WT组小鼠;其中M-MDSC 比例显着低于WT组,G-MDSC 比例组间无统计学意义。脾脏MDSC 比例在组间无统计学意义。此外,ArgmyeKO小鼠MDSC三个抑制分子Arg-1,iNOS,IDO表达水平低于WT组小鼠。ArgmyeKO小鼠结直肠中ACT1和COX-2表达量高于WT组小鼠;IL-22,IL-23,OCLN表达量在ArgmyeKO小鼠结直肠中更低。（4）转输WT来源的MDSC后,ArgmyeKCO小鼠便血减轻,体重流失程度减轻,结直肠比对照组小鼠更长。流式结果显示转输MDSC后,ArgmyeKO小鼠派氏集合淋巴结和肠黏膜淋巴结中Th17细胞分泌更多的IL-17A;而IL-17F的表达量低于对照组。（5）给予橡黄素治疗后,肠炎小鼠疾病评分降低,体重降低程度减轻,结直肠长度比对照组小鼠更长。流式结果显示治疗组小鼠外周血,脾脏和肠组织中MDSC 比例明显升高。MDSC表面雌激素受体表达量上升,胞内pSTAT3水平提高,MDSC分泌更多Arg-1。（6）给予橡黄素治疗后,肠炎小鼠结直肠组织IL-17A、IL-17F表达量升高。流式结果显示派氏集合淋巴结,肠黏膜淋巴结中Th17细胞和γδ T细胞分泌更多IL-17A;而IL-17F水平也高于对照组小鼠。治疗组小鼠结直肠中ACT1,IL-22,IL-23和OCLN表达量高于对照组小鼠;COX-2表达水平下降。结论:本研究发现在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中,激活MDSC中ESR/STAT3信号通路可以上调MDSC Arg-1的分泌水平。经橡黄素治疗后,肠炎小鼠体内MDSC 比例显着升高并分泌大量Arg-1。Arg-1提高Th17细胞IL-17A的表达同时抑制IL-17F的水平,促进肠粘膜修复相关因子的表达,从而缓解肠炎。我们的数据强调了 MDSC来源的Arg-1在小鼠肠炎中对Th17细胞IL-17A和IL-17F的调节作用,揭示了橡黄素缓解肠炎发病的机制,并为肠炎的治疗提供了新的思路。
杨璐[3]（2020）在《STING在BCR激活过程中协同PI3K调节肌动蛋白重组》文中研究指明背景目的:干扰素基因刺激因子（Stimulator of Interferon Genes,STING）,也称作MITA、MPYS或ERIS,是一种衔接蛋白,在外周淋巴组织的造血细胞中高表达。STING与IRF3相互作用激活I型干扰素的产生以应答来自多种胞内病原体的外源DNA,在先天免疫反应中发挥重要作用,然而其在适应性免疫中的作用及潜在的分子机制还不完全清楚。STING在SLE患者和MRL/lpr小鼠中低表达,pSHP1和pSHP2在MRL/lpr小鼠中也低表达,而BCR信号在SLE患者B细胞中高度活化。STING可以调控酪氨酸磷酸酶SHP1/2,但它是否可以在BCR激活过程中调控SHIP仍然不清楚。BCR的激活对于B细胞的功能至关重要,BCR激活会导致肌动蛋白重组,从而通过调节BCR的时空表达分布为BCR信号提供反馈调节信号。然而,STING是否调节BCR信号进而调节肌动蛋白重组还不清楚。本研究中,我们以Sting基因敲除鼠为模型,结合STING突变病人,研究STING缺陷对B细胞发育、分化,BCR信号和体液免疫的影响。方法:通过流式细胞术检测STING缺失对小鼠骨髓及外周B细胞发育、分化的影响。构建骨髓嵌合模型,消除STING缺失的环境因素对细胞发育、分化的影响。通过激光共聚焦检测STING缺失对脾B细胞中BCR活化和BCR信号转导的影响。通过TIRFm检测STING缺失对脾B细胞早期活化的影响。通过Western blot和磷酸化流式检测STING缺失对BCR信号的影响。最后,通过小鼠免疫模型检测STING缺失对B细胞发挥免疫功能的影响。同时,也通过流式细胞术检测了STING突变对患者B细胞发育及分化的影响。通过Western blot检测STING突变对患者B细胞中BCR信号的影响。结果:1.STING缺陷影响外周B细胞的稳态,但不影响骨髓亚群的发育。与WT鼠相比,Sting KO鼠中MZ和GC B细胞的比例和细胞数均明显升高。但Sting KO鼠中骨髓B细胞亚群以及FO、T1、T2 B细胞亚群的比例和细胞数与WT鼠相比无明显差异。骨髓嵌合模型结果显示,CD45.2+B细胞中MZ和GC B细胞比例也明显升高。H&E和免疫荧光结果显示,Sting KO鼠中GC结构染色更深,GL-7+GC的染色面积更大。2.STING缺陷不影响胸腺和外周T细胞亚群的发育。与WT鼠相比,Sting KO鼠中胸腺、脾脏、淋巴结中CD4+T、CD8+T、CD4+CD8+T、Treg、IFN-γ+T、IL-4+T、IL-17A+T细胞的比例和细胞数均无明显变化。3.STING参与BCR活化和调控B细胞外周耐受。在WT B细胞中,随着BCR的激活STING与BCR的共定位在10 min内逐渐升高。ER与BCR的共定位在WT B细胞与Sting KO B细胞中无显着差异。3D显微镜拍摄结果显示,抗原刺激后10 min内,STING和ER均与BCR cap共定位。此外,Sting KO鼠血清中抗双链DNA抗体水平显着升高,肾小球中IgG和补体沉积水平也显着升高,且脾脏、肾脏、肺脏和结肠中淋巴细胞浸润显着增多。4.STING缺陷上调近端BCR正向信号。与WT B细胞相比,抗原刺激后Sting KO B细胞中pY、p Btk或pCD19与BCR的共定位显着增加,pY、pCD19的表达水平以及pSyk/Syk、p Btk/Btk的相对表达水平均显着升高。5.STING缺陷下调BCR负向调控信号分子SHIP的活化。与WT B细胞相比,抗原刺激后Sting KO B细胞中pSHIP与BCR的共定位显着降低,pSHIP/SHIP的相对表达水平显着降低,pSHP-1/SHP-1的相对表达水平无明显变化。6.STING缺陷上调pWASP信号导致F-actin异常积累。与WT B细胞相比,抗原刺激后Sting KO B细胞中pWASP与BCR的共定位显着增加。磷酸化流式结果显示,与WT B细胞相比,抗原刺激5 min和10 min时,Sting KO B细胞中pWASP的表达水平升高,而此阶段F-actin的解聚能力减弱,致使F-actin聚合增加。7.STING缺陷上调PI3K信号转导导致F-actin异常积累。与WT B细胞相比,Sting KO B细胞与抗原接触区域的BCR积累显着减少,抗原接触面积显着增加,pY和F-actin积累显着增多。Sting KO B细胞经PI3K抑制剂处理后,其抗原接触面积降低至WT B细胞水平,其pY和F-actin积累也明显降低。此外,Sting KO B细胞中pPI3K/PI3K、pAkt/Akt、pFox O-1/Fox O-1、pS6/S6的相对表达水平也显着升高。与健康对照相比,Sting突变患者的静息和活化的外周血B细胞均表达较高的pPI3K。WT B细胞经PI3K、Syk、Lyn抑制剂处理相比,PI3K抑制剂处理组的B细胞中BCR与STING之间的共定位显着降低。8.STING缺陷导致体液免疫应答减弱。NP-KLH免疫后,Sting KO鼠中MZ和GC B细胞的比例和细胞数均显着降低。Sting KO鼠血清中NP特异性IgG1和IgM的抗体滴度也明显降低。免疫后,WT鼠与Sting KO鼠中MBC、PC、转换、未转换B细胞以及Tfh细胞的比例和细胞数均无明显差异。结论:STING以CD19-Btk轴介导的PI3K信号为中心枢纽调控肌动蛋白重组进而为BCR提供反馈信号。我们的研究提供了STING如何通过肌动蛋白重组进而调节BCR信号传导的新机制。
刘志礼[4]（2019）在《预警素表达的慢病毒疫苗对肝细胞癌免疫治疗的作用研究》文中研究表明复杂的生理屏障、耐药性以及肝癌组织抑制性的微环境导致肝细胞癌成为恶性程度高、临床治疗难度大的恶性肿瘤。绝大多数患者在确诊时已属于疾病的中晚期,能通过根治手术获益的病人仅有10%-20%。免疫治疗,特别是基于甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein,AFP）的免疫疗法在肝细胞癌治疗过程中显示出较大潜力,然而其临床效果依然有限。因此,亟需寻找一种新的治疗策略以提高AFP特异性的抗肿瘤免疫应答。树突状细胞（Dendritic cells,DC）是激发获得性免疫应答最重要的抗原提呈细胞,它可以刺激未致敏的初始T淋巴细胞引发初次免疫应答。而慢病毒在转染非分裂细胞（尤其是DC）方面优于逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒。最近,高迁移率族核小体结合域蛋白1（High Mobility Group Nucleosome Binding Domain Protein 1,HMGN1）作为抗肿瘤免疫的增强分子,已被用作一种新型的免疫佐剂,其在胞外可活化DC,并诱导DC的趋化性募集。然而,HMGN1在增强肝细胞癌AFP特异性抗肿瘤免疫应答方面的潜力尚不清楚。因此,本课题在三种肝癌小鼠模型和人肝癌细胞系上对表达有融合蛋白HMGN1和AFP慢病毒疫苗的抑瘤效果进行了系统测试,深入评估了HMGN1在增强AFP特异性抗肿瘤免疫应答方面的应用潜力,并对慢病毒疫苗的体内分布及抗肿瘤机制进行了初步探索,以期为肝细胞癌的治疗提供一种新的思路和策略。为进一步提高AFP特异性抗肿瘤免疫应答,我们构建了一种编码HMGN1和AFP融合蛋白的慢病毒疫苗（Lenti-HA）。WB检测结果显示:慢病毒可以在宿主细胞中高丰度地表达其携带的靶抗原,并且可以在胰岛素信号肽的引导下将融合蛋白分泌到细胞外发挥作用。通过流式细胞术和细胞毒实验证明:Lenti-HA可以显着提高小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的成熟度,并增强T淋巴细胞的活化能力,以起到更强的杀伤效果。并且在三种小鼠肝细胞癌模型上,包括皮下、原位和原发肝癌模型,系统测试了Lenti-HA的抗肿瘤效果及对免疫和肿瘤微环境的调控作用进行了检测。为验证这一新型疫苗在肝癌患者上应用的可行性,我们在人肝癌细胞系上对Lenti-HA的杀伤能力进行了测试。结果显示:在皮下、原位及原发肝细胞癌小鼠模型以及人肝癌细胞系上,Lenti-HA能够有效抑制肿瘤生长、延长荷瘤小鼠的生存期并且对人肿瘤细胞进行有效杀伤,说明Lenti-HA能够激活DC进而诱发抗原特异性免疫杀伤。尤为重要的是,Lenti-HA对原发肝癌小鼠的治疗,可以显着改善荷瘤小鼠抑制性的免疫和肿瘤微环境及有效抑制肝脏肿瘤向肺部转移。Lenti-HA能够有效提高AFP表达慢病毒疫苗（Lenti-AFP）的免疫原性。与Lenti-AFP相比,Lenti-HA免疫原性的提高可以显着降低慢病毒的使用剂量达6倍,从而显着提高慢病毒体内治疗的安全性。通过对慢病毒体内分布的检测发现,慢病毒主要分布于腹股沟淋巴结,并且未显示出明显的细胞倾向性。对其作用机制的初步解析发现Lenti-HA可能通过在腹股沟淋巴结招募和活化具有迁移活性的DC细胞尤其是CD103+DC,从而诱发AFP抗原特异性的抗肿瘤免疫应答。此外,我们发现在Lenti-HA治疗过程中CD8+T淋巴细胞起主导作用,并且记忆性T淋巴细胞和自然杀伤细胞也在Lenti-HA所介导的抗肿瘤免疫应答过程中起重要作用。我们的研究表明:HMGN1是一种有效的抗肿瘤免疫佐剂,能够显着增强AFP介导的抗肿瘤免疫应答,在三种不同的肝细胞癌小鼠模型上,能够有效抑制肿瘤生长和延长荷瘤小鼠的生存期。尤为重要的是,可以显着提高Lenti-AFP的免疫原性达6倍。并且在原发肝癌小鼠模型上,可以显着的改善免疫和肿瘤微环境。对其机制初探发现:CD8+T淋巴细胞在Lenti-HA治疗过程中起主要作用,但记忆T细胞及NK细胞也起重要作用。在人肝癌细胞系上也表现为AFP特异性抗肿瘤免疫应答反应的增强。本研究为肝细胞癌的免疫治疗提供了一种新型候选药物和治疗策略,可加速慢病毒疫苗的临床转化。
张正[5]（2019）在《PD-1抗体和外泌体激活的树突状细胞联合治疗前列腺癌的实验研究》文中指出前列腺癌（Prostate cancer,PCa）是发达国家常见的恶性肿瘤之一,具有较高的发病率和死亡率。前列腺癌一旦发生转移,患者的预后会非常差。发生转移的患者接受内分泌治疗（Androgen deprivation therapy,ADT）后通常效果显着,但最终因生化复发发生疾病进展,变为去势抵抗性前列腺癌（Castration-resistant prostate cancer,CRPC）,大部分前列腺癌相关的死亡都发生在转移性去势抵抗性前列腺癌阶段。在众多的针对前列腺癌的治疗中,免疫治疗已逐渐成为一种完善的治疗手段,诸如重组病毒肿瘤疫苗PROSTVAC、肿瘤疫苗Sipuleucel-T以及免疫检查点抑制剂（PD-1,CTLA-4等）被证明可以有效的延长前列腺癌患者的总体生存率（Overall survival,OS）。以肿瘤相关抗原为基础的融合蛋白作为抗原的肿瘤疫苗,如Sipuleucel-T虽然能有效的提升患者的总体生存率,但是针对疾病进展的作用有限。同时单一的免疫检查点抑制剂在前列腺癌治疗中效果也较为局限。因此,一方面寻找肿瘤特异性的新型抗原,高效率地促使树突状细胞摄取并提呈给T细胞,从而产生有效并且特异性强的抗肿瘤免疫反应十分重要;另一方面,前列腺癌的肿瘤疫苗联合免疫检查点抑制剂不仅可以招募肿瘤特异性毒性T细胞,还能够增加T细胞的效应功能,因此在提高前列腺癌治疗效果方面展现出巨大的潜力。本研究旨在探索前列腺癌细胞来源的外泌体（Tumor cell derived-exosomes,TEX）能否作为新型抗原,刺激并激活树突状细胞（Dendritic cell pulsed with TEX,DC-TEX）,将其作为肿瘤疫苗观察其在体外和体内杀伤肿瘤细胞的效果,同时针对PD-1/PD-L1这条耗竭T细胞功能的通路,引入PD-1抗体,分别在体内和体外水平评估其是否能够提高DC-TEX治疗前列腺癌的效果,为两种不同机制的免疫治疗联合应用提供理论支持。目的:1.分离肿瘤细胞的外泌体,在体外和体内水平探讨DC-TEX的抗肿瘤免疫效果;2.在体外和体内水平验证PD-1抗体是否能够增强DC-TEX治疗前列腺癌的效果。方法:1.利用超速离心的方法分离肿瘤细胞分泌的外泌体,通过Western blot、透射电镜以及纳米颗粒跟踪分析技术（Nanoparticle Tracking Analysis,NTA）鉴定外泌体,分析其性征及特点,并通过荧光染色技术观察其能否被树突状细胞摄取,并通过流式细胞术、ELISA实验以及细胞毒性实验来确定DC-TEX的活化情况和T细胞杀伤肿瘤细胞情况;2.通过Western blot和流式细胞术分析肿瘤细胞PD-L1的表达情况以及T细胞表面PD-1表达情况,通过细胞毒性实验以及ELISA实验探索PD-1抗体是否能够逆转DC-TEX激活的CD8+T细胞因表达PD-1受体而导致耗竭的状态;3.通过移植瘤块的方式建立经济、快速成瘤的野生型C57/BL6小鼠皮下前列腺肿瘤模型,体内水平通过观察及测量小鼠肿瘤体积、重量、生长速率以及生存率来评估DC-TEX和PD-1联合DC-TEX的治疗效果,流式细胞术以及免疫组化实验验证DC-TEX募集和活化T细胞的能力以及对全身免疫系统的影响,通过ELISA评估活化T细胞的功能状态。结果:1.成功分离出前列腺癌细胞分泌的外泌体,并通过Western blot、透射电镜以及NTA技术验证其形态、大小以及分子标记物符合外泌体特征,并且富含多种前列腺癌免疫相关的抗原;2.DC2.4细胞能够成功摄取TrampC1分泌的外泌体,并能促进DC2.4细胞的活化,活化的DC-TEX能够促进幼稚的T细胞转化成细胞毒性T细胞,具有较强的靶向杀伤肿瘤细胞的能力;3.证实前列腺癌细胞以及前列腺癌组织中表达PD-L1,在体外实验中,通过流式细胞术、ELISA实验以及细胞毒性试验证明DC-TEX联合PD-1抗体能够逆转DC-TEX激活的CD8+T细胞因表达PD-1受体而导致耗竭的状态;4.成功建立C57/BL6小鼠的皮下前列腺癌模型,发现DC-TEX联合PD-1抗体组能够有效的延长小鼠的生存期,小鼠肿瘤生长速率明显减缓,体积明显下降,通过流式细胞术、免疫组化和ELISA实验发现全身免疫系统处于激活状态。结论:1.外泌体激活的树突状细胞对比肿瘤裂解物,具有更强的抗肿瘤免疫效果;2.PD-1抗体能够增强DC-TEX杀伤肿瘤的效果,PD-1联合DC-TEX能起到协同抗肿瘤作用,对于提高前列腺癌患者的临床预后具有很大的潜力。
张鹏飞[6]（2019）在《基于生物表面展示策略的功能化纳米载体的构建和应用》文中指出在过去几十年,各种配体修饰的纳米载体已经被开发出来。众所周知,纳米材料的表面修饰可以极大地拓展纳米材料的功能和生物相容性,纳米载体的功能化一般需要将功能配体修饰在纳米颗粒的表面,从而赋予材料独特的靶向性、长循环稳定性、酶催化能力、生物治疗、免疫逃逸和生物传感等功能。用于纳米载体表面功能化的配体分子通常包括酶、多肽、适配体、多糖、抗体以及其他生物活性小分子等。其中,抗体等蛋白配体因其高亲和力和独特的生物活性,作为一类较为重要的配体,被研究人员偶联在不同类型的纳米粒子上,以实现功能化纳米粒子的肿瘤靶向运输及诊断。传统的配体修饰方法包括物理吸附和化学共价偶联等方法。然而,蛋白配体在与纳米粒子之间发生化学共价偶联反应的过程中可能会引发敏感性蛋白配体（如抗体、酶）的生物活性的损失并且难以控制配体的空间朝向,因此容易造成纳米材料功能化的效率低下等问题。理想的、针对蛋白配体的纳米偶联方法应该能够保证被连接配体的最优空间朝向、可接近性、体内循环稳定性以及良好的生物活性。开发出针对于蛋白配体的、纳米偶联的新方法,并且保证被偶联蛋白的正确朝向和生物活性,对于促进纳米医药以及纳米功能化的发展有着重大的意义。在另一方面,生物表面展示技术也在不断蓬勃发展。该技术主要是通过运用基因工程的手段在类病毒颗粒、病毒、酵母、细菌、噬菌体、铁蛋白或蛋白笼等生物载体的表面上展示各种多肽、重组蛋白、多糖等生物活性元件。目前,生物表面展示策略已经广泛地应用于微生物学、疫苗学、分子生物技术等领域,并产生了巨大的临床应用价值。此外,仿生策略被广泛地应用于纳米材料的开发,以赋予纳米材料更优越的独特功能,如生物相容性、免疫逃逸、细胞特异性的靶向能力、长循环稳定性或细胞独有的其他生物学功能。这一策略也通常涉及到生物来源的活性蛋白（病毒表面蛋白或多肽）或细胞组分（如细胞膜或细胞器）对纳米载体表面的修饰及功能化。综上所述,为了克服非特异性共价偶联方法的缺点并且开发出理想的、针对于蛋白配体的、纳米表面功能化的方法,在本研究中,本人通过结合生物表面展示技术以及细胞仿生策略,开发出了一种纳米载体功能化的新方法,并且制备了三种功能化的纳米载体（如:展示蛋白的病毒拟态纳米囊泡、外泌体拟态纳米囊泡与细胞膜包裹的纳米粒子）,这些载体在关于疫苗抗原投递、肿瘤靶向的药物运输和肿瘤免疫治疗的三个实验评估中都取得了良好的疾病治疗效果,充分证明了该新型生物功能化的纳米系统的优越性能以及该纳米偶联方法的普适性。本研究的主要工作以及创新包含以下四个方面:1、开发出了一种新型的基于纳米囊泡载体的蛋白展示技术（即纳米囊泡表面展示技术）,该技术可以在源自细胞膜的、纳米囊泡的表面,定向表达各种靶向抗体、病毒抗原蛋白、酶复合体等生物活性蛋白,从而赋予纳米囊泡与外泌体相似的功能。2、基于纳米囊泡表面展示技术以及病毒仿生策略,流感病毒包膜蛋白（血凝素蛋白HA）首先被基因工程改造后定向表达在哺乳动物细胞膜的表面,通过加入表面活化剂,诱导细胞膜出芽,从而分泌出了可以展示流感病毒HA膜蛋白的纳米囊泡。本实验证明了该流感病毒拟态纳米囊泡具有与天然流感病毒相似的大小、形貌、免疫原性和凝血活性,并且可以在小鼠体内诱导出高滴度的中和抗体,以抵御致死性流感病毒的感染,进而证明了这一病毒拟态纳米囊泡可以作为一种直接、有效和通用的疫苗研发平台,有利于开发出针对各种包膜病毒的疫苗。3、基于纳米囊泡表面展示技术,我们将肿瘤靶向的表皮生长因子或纳米抗体affibody分别定向表达在囊泡的表面,并在囊泡的内部装载治疗性的药物分子,因此赋予了纳米囊泡特异性识别肿瘤的功能,使得药物分子高浓度地聚集在肿瘤部位,从而达到了良好的肿瘤治疗效果。4、通过将囊泡表面展示技术和膜包裹纳米颗粒的方法有机地结合,PD-L1抗体先被定向表达在细胞膜囊泡的外表面,在细胞膜囊泡与氧化锰纳米颗粒经过微孔滤膜的共挤压后,本人成功制备出了一种可以展示PD-L1抗体的、细胞膜包裹的氧化锰纳米颗粒,该氧化锰纳米颗粒能够被细胞膜以及其上的PD-L1抗体有效的修饰及功能化,同时该系统可以将负载的免疫刺激分子靶向递送到肿瘤微环境,实现对肿瘤的放疗与免疫联合治疗。此外,我们发现该新型膜包裹纳米系统能够有效地在小鼠肿瘤模型中诱导全身的抗肿瘤免疫反应（远端效应）,成功地抑制了未辐照肿瘤的生长。
王欣[7]（2018）在《联合阻断免疫检查点PD1和VISTA分子在放射治疗小鼠CT26结肠癌模型的研究》文中研究指明目的:通过检测T细胞激活抑制物免疫球蛋白可变区结构域（VISTA）分子和CD8,CD33,程序性死亡受体1（PD1）,叉状头转录蛋白3（FOXP3）等分子在K-鼠类肉瘤病毒癌基因（K-RAS）外显子不同变异的结直肠癌组织中的表达并分析其临床意义。构建BALB/C小鼠肠癌细胞CT26双移植瘤模型,比较正常小鼠组,荷瘤对照组,CA170治疗组与大剂量单次照射组以及大剂量单次照射联合CA170治疗组不同组别瘤体和脾脏多个细胞因子表达和治疗后移植瘤体中免疫细胞的比例以及瘤体退缩的指标,探讨大剂量单次照射和VISTA和PD1信号通路联合阻断在在BALB/C小鼠双移植瘤模型诱导远隔效应可能的机制。方法:1.应用免疫组化技术检测VISTA和CD8,CD33,PD1,FOXP3等分子在K-RAS基因外显子不同变异的结直肠癌组织中的表达并分析其临床意义。2.培养小鼠肠癌细胞系CT26,构建BALB/C小鼠双移植瘤模型,采用液相悬浮微球蛋白分析技术检测不同治疗前后的小鼠模型的多个细胞因子表达变化;流式细胞术检测小鼠模型治疗前后移植瘤体内和脾脏免疫细胞比例的变化;游标卡尺测量瘤体比较瘤体退缩的指标。结果1、结直肠癌间质细胞表达VISTA,CD33,结直肠癌间质中的淋巴细胞表达FOXP3分子,PD1分子和CD8分子。2、VISTA,CD33,CD8分子表达在KRAS基因突变组和野生组之间差异有统计学意义（P<0.05）。3、VISTA,CD8及CD33分子在左右半结肠癌表达差异有统计学意义（P<0.05）。4.大剂量X射线联合CA170治疗显着缩小小鼠第1和第2瘤体（P<0.05）;X射线大剂量照射联合CA170相对单药CA170治疗和放射显着提高了小鼠第1肿瘤瘤体内的细胞因子CCL2/MCP-1,IL-1β,IFN-γ表达,降低了 VEGF,M-CSF的表达（P<0.05）。X射线大剂量照射联合CA170相对单药CA170治疗显着提高了小鼠第2肿瘤瘤体内的细胞因子CCL2/MCP-1,IL-1β,IFN-γ表达（P<0.05）。X射线大剂量照射联合CA170相对放射显着提高了小鼠第2肿瘤瘤体内的细胞因子CCL2/MCP-1,IL-1β,IFN-γ表达（P<0.05）,降低了 VEGF 的表达（P<0.05）。5.CA170联合放射治疗或单药CA170治疗增加了 CD3+/CD8+的小鼠第1和第2肿瘤内TIL的浸润和扩增。结论1.KRAS基因突变的结直肠癌组织中抑制性免疫微环境的形成可能与MDSCs高表达VISTA分子且因MDSCs抑制TIL功能有关。2.大剂量X射线照射联合CA170治疗可以显着放大大剂量X射线照射导致的天然免疫系统的活化并促进了宿主获得性抗肿瘤免疫的产生并显着地抑制小鼠CT26细胞移植瘤的生长。
孙艳丽[8]（2013）在《基于重组MS2病毒样颗粒的前列腺癌RNA疫苗的研究》文中研究表明近年来,RNA疫苗在肿瘤预防及治疗领域的价值愈加重要,不仅因为其具有良好的诱导体液和细胞免疫应答的能力,而且因为其具有DNA疫苗、蛋白疫苗以及多肽疫苗无可比拟的优势：与DNA疫苗相比,RNA疫苗不存在整合到宿主基因组内的可能,安全性较高；与蛋白疫苗相比,RNA疫苗可以诱导较强的细胞免疫应答；与多肽疫苗相比,RNA疫苗的免疫原性更强。然而,RNA的稳定性限制了其作为疫苗在疾病预防及治疗中的应用。尽管现在有多种方式被应用于提高RNA的稳定性,如对RNA骨架进行修饰,脂质体或金粒子包裹等,但是这些方法没有从根本上解决RNA稳定性差的问题,且需要经过体外转录过程或合成途径才能获得大量的RNA,这种制备过程不仅对生产条件要求较高,而且成本较高。腺病毒载体及复制子RNA也是目前常用的RNA递送载体,但病毒载体自身的结构蛋白多样并且其有重组成新病毒的可能,这使其难以应用于临床。目前临床研究及应用中最有效的传递方式是以树突状细胞为靶标的RNA疫苗,但是体外树突状细胞的制备成本较高、操作繁琐,而且自体树突状细胞的来源也有限。此外,microRNA研究及临床应用中还存在细胞内传递效率低的问题。鉴于上述RNA递送方式的缺点,急需一种安全、有效、稳定、传递效率高、制备程序简单、成本低、能大规模生产的RNA递送方式的出现。本研究从RNA稳定性差及其传递效率低这两方面着手,以MS2病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）作为RNA的递送载体,采用DNA重组技术分别制备了内含前列腺酸性磷酸酶（prostatic acid phosphatase, PAP） mRNA或microRNA的MS2VLPs,明确了其组装能力、包裹能力、穿膜能力、翻译能力及细胞毒性等,从体内外水平对其在前列腺癌预防及治疗中的价值进行了评估,同时还对其发挥抗肿瘤作用的免疫机理进行了初步探索。首先,基于MS2衣壳特异性包裹mRNA的能力,我们制备了一种稳定、高效的前列腺癌预防及治疗性mRNA疫苗,其以pESC-URA作为载体,在该载体GAL10启动子的下游插入MS2衣壳蛋白基因,在另一启动子GAL1的下游插入人或小鼠PAP与GM-CSF的融合基因,从而获得pMS2-hPAP-GM-CSF和pMS2-mPAP-GM-CSF两种表达载体,将其转化入酿酒酵母细胞进行表达,超声取其上清,通过凝胶过滤层析法获得了较纯的hPAP-GM-CSF VLPs和mPAP-GM-CSF VLPs,同时还制备了MS2VLPs、GM-CSF VLPs、hPAP VLPs、mPAP VLPs作为实验对照。我们还应用SDS-PAGE、透射电镜技术、耐酶性试验以及RT-PCR对上述VLPs进行了鉴定,结果表明,6种表达载体均能在酿酒酵母细胞内表达成VLPs,其直径约为30nm,分子量约为14kDa,并且其表达量与包裹的目的mRNA的长度成反比；MS2VLPs能完全包裹长度从429nt到1652nt的目的mRNA,并能保护这些mRNA防其被RNase降解。此外,CHO细胞毒性实验结果显示0～2000μg/mL的hPAP-GM-CSF VLPs对CHO细胞无细胞毒性。同时,体外细胞试验表明大量VLPs能被巨噬细胞在较短的时间内摄取,其内包裹的mRNA能在哺乳动物细胞内被翻译成有活性的蛋白,并且该翻译效率跟VLPs与细胞的孵育时间及二者的比例密切相关。我们还对PAP-GM-CSF VLPs诱导免疫应答的能力及其抗肿瘤效果进行了评价：以C57BL/6小鼠分别作为前列腺癌动物细胞模型,用hPAP-GM-CSF VLPs静脉注射C57BL/6,然后取其血清检测IL-12和TNF-a,结果4h时即检测到较高水平的IL-12,24h时检测到较高水平的TNF-a,且其诱导的免疫应答与hPAP-GM-CSF VLPs的剂量之间具有相关性。应用hPAP-GM-CSF VLPs免疫,有效的激活了树突状细胞,并且佐剂GM-CSF促进了树突状细胞的成熟,后者有效递呈抗原进一步激活了抗体IgG及T细胞免疫应答,尤其是Thl型和CTL细胞免疫应答,但没有破坏调节性T细胞的水平。肿瘤激发试验的结果表明在用上述6种VLPs免疫3次后,hPAP-GM-CSF VLPs诱导的免疫应答使得接种肿瘤的C57BL/6小鼠全部存活,而接种其他疫苗的小鼠相继全部死亡。此外,我们又将6种VLPs用于肿瘤治疗,结果仅hPAP-GM-CSF VLPs延迟了肿瘤的形成。其次,基于上述的研究成果以及MS2衣壳展示多肽的能力,为解决microRNA细胞内传递效率低的问题,我们又在MS2衣壳蛋白中引入了细胞穿膜肽—-TAT,从而制备了携带TAT且内含特定RNA的VLPs。该VLPs的表达载体以pESC-URA为基础,在其GAL10启动子的下游插入双MS2衣壳蛋白基因的串联序列,通过点突变、酶切以及连接等步骤在第二个MS2衣壳蛋白基因中插入了一段TAT多肽基因,在另一启动子GAL1启动子的下游插入microRNA-23a前体、microRNA-23b前体、GFP或GM-CSF的基因,从而获得了p2MS2-microRNA-23a. p2MS2-microRNA-23b、p2MS2-GFP以及p2MS2-GM-CSF四种载体,同时根据microRNA前体的特点,随机设计一段序列作为microRNA-23a的对照（p2MS2-microRNA-con）,然后将5种载体分别转化入酿酒酵母细胞进行表达,超声取其上清,通过凝胶过滤层析法获得了较纯的TAT-microRNA-23a VLPs. TAT-microRNA-23b VLPs、TAT-microRNA-con VLPs、TAT-GFP VLPs. TAT-GM-CSF VLPs。SDS-PAGE结果显示这些VLPs衣壳蛋白的分子量约为72kDa,并且该VLPs的表达量较之不携带TAT的VLPs明显下降；透射电镜检测结果显示插入TAT的MS2衣壳蛋白仍能在酿酒酵母细胞内组装成直径约为30nm的MS2VLPs;耐酶性试验结果表明携带TAT的MS2衣壳也具有保护其内的RNA防其被RNase降解的活性；RT-PCR的鉴定结果明确了携带TAT的VLPs仍具有包裹较长片段（772nt）的特定RNA （mRNA与microRNA）的能力；穿膜试验结果证实了该病毒样颗粒表面展示的TAT保留了其穿膜活性；CCK法细胞毒性实验结果显示在0～1000μg/mL范围内,携带TAT的VLPs并未显示出明显的细胞毒性；体外细胞试验表明不仅携带TAT的MS2衣壳蛋白包裹的mRNA能在哺乳动物细胞内翻译成目的蛋白,而且其包裹的microRNA前体也能在哺乳动物细胞内被加工成成熟的microRNA,且其表达量较高。最后,我们又对TAT-microRNA-23a VLPs体外抗肿瘤的效果进行了评价,结果显示,与阳性对照TAT-microRNA-23b VLPs相比较,TAT-microRNA-23a VLPs也能诱导前列腺癌细胞凋亡,且其诱导前列腺癌细胞凋亡的效果要优于TAT-microRNA-23b VLPs （10μg/mL:11.67±1.69vs.9.06±1.50, P<0.001;8.3μg/mL:3.53±0.44vs.1.92±0.12, P<0.01）,但TAT-microRNA-con VLPs不具有抗肿瘤效果。综上所述,基于MS2VLPs特异性包裹RNA及其衣壳蛋白展示多肽的能力,我们成功制备了两种安全、稳定、有效、传递效率高、制备程序简单、成本低、能大规模生产的RNA （mRNA及microRNA）疫苗,该疫西具有以下优点：（1）用重组蛋白技术易于制备,质量易于控制；（2）在酵母表达系统中显示出较高的表达量；（3）当与核酸酶共孵育时,显示出较高的稳定性；（4）分子大小适宜易于被吞噬细胞吞噬并在真核细胞内高效表达成目的抗原,这不仅打破了机体的免疫耐受状态,而且激活了树突状细胞,诱导了较强的免疫应答；（5）安全性较高,静脉内接种时无副反应出现；（6）同时诱导了体液和细胞免疫应答；（7）激活了CD4+T细胞应答,以Thl型免疫应答为主,这对效应性及记忆性CD8+T细胞的产生必不可少；（8）维持了CD4+T细胞与调节性T细胞之间的平衡；（9）诱导产生了较强的CTL细胞应答；（10）具有较强的抗肿瘤效果；（11）携带细胞穿膜肽的VLPs具有较强的穿膜能力,这为靶向性RNA疫苗的制备提供了新的思路。以上研究成功解决了RNA稳定性差及体内传递效率低的问题,这为肿瘤RNA疫苗的设计提供新的思路和方法,并为基于MS2VLPs的RNA疫苗在其他疾病预防及治疗中的应用奠定理论和实验基础。
邵惠训[9]（2012）在《树突状细胞疫苗的现状与未来》文中进行了进一步梳理1868年,Langerhans首先在人体皮肤的表皮层发现了树突状细胞,当时称之为Langerhans细胞。1973年,Steinman从小鼠脾脏分离出这种细胞,正式命名为树突状细胞（dendritic cells,DC）。DC在抗肿瘤、抗感染、移植排斥、变态反应性疾病和自身免疫性疾病治疗中具有广阔的应用前景[1-2]。由于这种细胞的发现,Steinman获得了2011
杜海军[10]（2010）在《树突状细胞-EBV-LMP2疫苗治疗鼻咽癌的初步研究》文中研究指明鼻咽癌（Nasoparyngeal carcinoma, NPC）是我国南方一些省（自治区）的常见恶性肿瘤之一。目前放射治疗是鼻咽癌治疗的基本方法,但中晚期鼻咽癌治疗后常常复发或向远处转移,对于复发和转移的患者在临床上尚无有效治疗方案。树突状细胞（Dendritic cell, DC）为基础的疫苗在治疗肿瘤方面,尤其在某些晚期肿瘤如黑色素瘤、前列腺癌、结肠癌、尿道癌的临床治疗方面已经取得一些的成效,现在已进入Ⅱ期临床试验。但DC在治疗NPC方面,还处于起始阶段。目前治疗用的DC是其前体细胞在细胞因子作用下体外诱导培养获得的,但对于DC诱导培养条件文献报道不一。本研究首先通过对DC培养条件、前体细胞来源、细胞因子组合、细胞贴壁孵育时间、rAd-LMP2感染DC剂量,细胞冻融方面的进行探索,优化了DC培养条件。我们课题组以rAd-LMP2以灌胃、肌肉注射和滴鼻的方式感染小鼠,均可诱发小鼠针对LMP2的特异性体液免疫和细胞免疫；EBV-LMP2 DNA疫苗、腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）疫苗、非复制5型腺病毒疫苗（Ad5）联合免疫Balb/C小鼠能够更好地诱导机体产生特异性CTL。rAd-LMP2、rAd5F35-LMP2肌肉免疫恒河猴诱导EBV-LMP2特异性的CTL。pcDNAⅢ-LMP2真核表达质粒免疫小鼠可诱发LMP2特异性细胞和体液免疫。在此基础上,我们以DC-LMP2肌肉免疫方式,研究LMP2诱导的特异性CTL。通过与广西自治区人民医院合作,在获得伦理委员会批准下,依据自愿原则,选择部分NPC治疗进行初步DC-LMP2皮内免疫治疗,首次以LMP2肽库形式检测DC-LMP2免疫后所激发LMP2特异性CTL,探讨患者特异性CTL与NPC发展进程的关系。结果显示：普通培养瓶诱导培养DC的效果最差,带滤膜盖的细胞培养瓶次之,六孔细胞培养板诱导培养效果最好。rmGM-CSF+rmIL-4+rmTNF-α组合对骨髓前体细胞诱导培养DC的效果最好,终浓度为rmGM-CSF（200U）+rmIL-4（10U）+rmTNF-α（100U）/mL;对脾脏来源DC进行诱导培养,rmGM-CSF+rmTNF-α组合的阳性率最高,但最终获得DC数量远远少于骨髓来源DC。随着前体细胞孵育时间的增加获得DC细胞数量也随之增多,DC纯度无明显差异。rAd-LMP2感染骨髓细胞诱导培养的DC,以10、100、1000 MOI感染DC,100 MOI感染DC效果最好,40-60%的DC中有LMP2表达。苔盼蓝法检测-80℃、-196℃冻存骨髓和脾脏淋巴细胞复苏后存活率,骨髓细胞存活率（94.8±0.7%和82.85±3.8%）均大于脾脏细胞（80.98±2.2%和68.3±5.2%）,DC前体细胞冻存复苏影响其诱导培养。以优化获得的DC培养条件诱导培养骨髓来源的DC,然后DC-LMP2免疫BALB/C鼠可诱导LMP2特异性免疫应答。第5周（308±167/106细胞,对照18±6/106细胞）强于第8周（196±81/106细胞,对照7±2/106细胞）；肌肉注射方式免疫小鼠rAd-LMP2、DC-LMP2所诱导的LMP2特异性CTL, rAd-LMP2组（1178±228/106细胞）大大高于DC-LMP2组(（308±167/106细胞）。在小鼠0,2,4周免疫后的第五周,DC-LMP2免疫组CD8+T/CD3+T细胞亚群的比值（22.6±1.7%）高于PBS（20.4±3.5%）和DC组（22.04±1.2%）,在第八周DC-LMP2免疫组CD8+T/CD3+T细胞亚群的比值（15.5±1.7%）低于PBS（17.6±2.9%）和DC组（17.5±1.5%）。在小鼠0,2,4周DC-LMP2免疫后,小鼠血清中产生LMP2抗体。在NPC患者前臂内侧下缘皮内免疫0.1 mL生理盐水,含1-2×105个DC-LMP2,未出现明显过敏反应,表明皮内免疫DC-LMP2的途径、部位、剂量安全可行。参加皮内免疫的部分NPC患者,在在第五周LMP2特异性CTL检测中,15人中9人提高了LMP2特异性CTL（/106）,6人在DC-LMP2免疫后LMP2特异性CTL降低。1人在第八周的特异性细胞免疫水平高于治疗前,1人低于治疗前。在NPC免疫前后的IgA/VCA和IgA/EA抗体滴度无明显改变,NPC患者经过初次临床常规治疗后3-21个月内,血清中EBV DNA载量均低于103copies/mL。总之,rmGM-CSF+rmIL-4+rmTNF-α组合对骨髓前体细胞诱导培养DC的效果最好,终浓度为rmGM-CSF（200U）+rmIL-4（10U）+rmTNF-α（100U）/mL; DC-LMP2免疫BALB/C鼠可诱导LMP2特异性CTL。CD8+T/CD3+T细胞亚群的比值先升高。DC-LMP2免疫NPC患者的的途径、部位、剂量安全可行,部分NPC患者提高了LMP2特异性CTL。
二、树突状细胞经EB病毒膜抗原gp340刺激后诱导抗肿瘤免疫应答（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、树突状细胞经EB病毒膜抗原gp340刺激后诱导抗肿瘤免疫应答（论文提纲范文）
（1）HLA-DPB1和EB病毒gp42蛋白的结合方式与新疆地区霍奇金淋巴瘤发病的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 新疆地区EB病毒阳性霍奇金淋巴瘤患者的生存状况分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 临床资料的收集 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 HLA-DPB1与EB病毒gp42 蛋白的结合方式研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要试剂与耗材 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验方法与步骤 |
| 1.5 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 新疆地区EB病毒阳性霍奇金淋巴瘤患者的免疫分子检测 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要实验试剂与耗材 |
| 1.3 主要实验方法与步骤 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 EB病毒与霍奇金淋巴瘤发病机制的相关研究 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（2）MDSC分泌的Arg-1对肠炎小鼠Th17细胞的影响及橡黄素治疗机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 炎症性肠炎 |
| 1.2.1 炎症性肠炎概述 |
| 1.2.2 炎症性肠炎的机制 |
| 1.2 Th17细胞 |
| 1.2.1 Th17细胞概述 |
| 1.2.2 Th17细胞的起源和发育 |
| 1.2.3 Th17细胞的可塑性 |
| 1.2.4 Th17细胞在IBD中的功能 |
| 1.3 调节性免疫细胞概述 |
| 1.3.1 调节性T细胞 |
| 1.3.2 调节性B细胞 |
| 1.3.3 调节性红细胞 |
| 1.3.4 调节性的髓系细胞 |
| 1.4 MDSC与自身免疫病 |
| 1.4.1 MDSC的起源 |
| 1.4.2 MDSC的功能 |
| 1.4.3 MDSC扩增的调控机制 |
| 1.4.4 MDSC功能的调控机制 |
| 1.4.5 MDSC与自身免疫病 |
| 1.4.6 MDSC在炎症性肠炎中的作用 |
| 1.5 自身免疫病中MDSC与Th17细胞的关系 |
| 1.6 炎症性肠病中MDSC和Th17细胞的展望 |
| 第2章 肠炎小鼠中MDSC影响Th17细胞IL-17A和IL-17F的表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验材料和试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Arg~(myeKO)小鼠的构建 |
| 2.3.2 炎症性肠炎小鼠模型的构建 |
| 2.3.3 肠炎分级评分标准 |
| 2.3.4 外周血单个核细胞的分离 |
| 2.3.5 脾脏单细胞悬液制备 |
| 2.3.6 小肠派氏集合淋巴结细胞分离 |
| 2.3.7 肠系膜淋巴结细胞分离 |
| 2.3.8 结直肠固有层淋巴结细胞分离 |
| 2.3.9 体外刺激PBMC实验 |
| 2.3.10 细胞表面染色 |
| 2.3.11 细胞内染色 |
| 2.3.12 抑制实验 |
| 2.3.13 抑制实验检测 |
| 2.3.14 荧光定量PCR |
| 2.3.15 转输实验 |
| 2.3.16 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 肠炎条件下Arg~(myeKO)小鼠Th17细胞IL-17A表达降低,IL-17F表达升高 |
| 2.4.2 肠炎条件下Arg~(myKO)小鼠MDSC比例下降 |
| 2.4.3 肠炎条件下Arg~(myeKO)小鼠肠组织中保护性因子表达下调 |
| 2.4.4 转输WT小鼠来源的MDSC缓解Arg~(myeKO)小鼠肠炎 |
| 2.5 实验讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 橡黄素通过ESR/STAT3通路促进MDSC存活 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 数据库 |
| 3.2.2 软件 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.2.4 试剂耗材 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 Arg~(myeKO)小鼠的构建 |
| 3.3.2 体外实验橡黄素处理髓系细胞 |
| 3.3.3 橡黄素治疗肠炎小鼠 |
| 3.3.4 肠炎分级评分标准 |
| 3.3.5 橡黄素互作基因的预测 |
| 3.3.6 基因富集和通路分析 |
| 3.3.7 小鼠骨髓细胞的分离 |
| 3.3.8 荷瘤小鼠脾脏细胞的分离 |
| 3.3.9 人脐带血单个核细胞的分离 |
| 3.3.10 细胞表面染色 |
| 3.3.11 细胞内染色 |
| 3.3.12 荧光定量PCR |
| 3.3.13 数据分析及统计方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 MDSC雌激素受体的激活通过STAT3通路上调Arg-1的分泌 |
| 3.4.2 扩增的MDSC减轻DSS诱导的小鼠肠炎 |
| 3.5 实验讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 在肠炎小鼠中橡黄素通过MDSC产生的Arg-1调节Th17细胞因子分泌 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验材料和试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 Arg~(myeKO)小鼠的构建 |
| 4.3.2 橡黄素治疗实验 |
| 4.3.3 外周血单个核细胞的分离 |
| 4.3.4 脾脏单细胞悬液制备 |
| 4.3.5 小肠派氏集合淋巴结细胞分离 |
| 4.3.6 肠系膜淋巴结细胞分离 |
| 4.3.7 结直肠固有层淋巴结细胞分离 |
| 4.3.8 体外刺激PBMC实验 |
| 4.3.9 细胞表面染色 |
| 4.3.10 细胞内染色 |
| 4.3.11 荧光定量PCR |
| 4.3.12 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 橡黄素通过上调ESR/pSTAT3促进MDSC促进Arg-1分泌 |
| 4.4.2 MDSC分泌的Arg-1促进Th17细胞IL-17A的表达,抑制IL-17F的水平 |
| 4.4.3 MDSC来源的Arg-1促进小鼠肠组织中保护性因子表达下调 |
| 4.5 实验讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间科研成果 |
| 致谢 |
（3）STING在BCR激活过程中协同PI3K调节肌动蛋白重组（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一 实验材料 |
| 二 实验方法 |
| 1 小鼠基因鉴定 |
| 2 流式细胞术检测小鼠骨髓、脾脏、胸腺、淋巴结以及人外周血淋巴细胞亚群 |
| 3 纯化小鼠脾脏B细胞 |
| 4 纯化人外周血B细胞 |
| 5 磷酸化流式 |
| 6 激光共聚焦显微镜(Confocal) |
| 7 全内反射荧光显微镜(TIRFm) |
| 8 Western blot |
| 9 免疫荧光 |
| 10 H&E染色 |
| 11 NP-KLH免疫实验 |
| 12 小鼠骨髓嵌合模型 |
| 13 ELISA |
| 14 抗dsDNA抗体检测 |
| 15 PI3K、Syk和 Lyn抑制剂处理 |
| 三 统计分析 |
| 结果 |
| 一 STING缺陷影响外周B细胞的稳态,但不影响骨髓亚群的发育 |
| 二 STING缺陷不影响胸腺和外周T细胞亚群的发育 |
| 三 STING参与BCR活化 |
| 四 STING缺陷上调近端BCR正向信号 |
| 五 STING缺陷下调BCR负向调控信号分子SHIP的活化 |
| 六 STING缺陷上调p WASP信号导致F-actin异常积累 |
| 七 STING缺陷上调PI3K信号转导导致F-actin异常积累 |
| 八 STING缺陷导致体液免疫应答减弱 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 STING在免疫系统中的作用 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）预警素表达的慢病毒疫苗对肝细胞癌免疫治疗的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、HA慢病毒(Lenti-HA)对肝细胞癌免疫治疗的作用研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验使用细胞系 |
| 1.1.2 实验模式动物 |
| 1.1.3 实验用的主要仪器设备 |
| 1.1.4 实验用的主要试剂及耗材 |
| 1.1.5 试剂配制 |
| 1.1.6 实验方法 |
| 1.1.7 数据分析及图像绘制软件 |
| 1.1.8 统计学分析 |
| 1.1.9 所用的引物序列 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 Lenti-HA的构建及体内外抑瘤效果的测试 |
| 1.2.2 在肝癌皮下瘤模型上对Lenti-HA的治疗剂量进行优化 |
| 1.2.3 Lenti-HA在肝癌原位瘤模型上治疗效果的测试 |
| 1.2.4 Lenti-HA在原发肝癌模型上治疗效果的测试 |
| 1.2.5 Lenti-HA抗肿瘤机制的初步探索 |
| 1.2.6 Lenti-HA对人肝癌细胞系体外杀伤效果的测试 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 Exosome在肝细胞癌免疫治疗中的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）PD-1抗体和外泌体激活的树突状细胞联合治疗前列腺癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、TEX在体外杀伤前列腺癌肿瘤细胞的功能研究 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 材料与仪器 |
| 1.1.2 对象及实验方法 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.2.1 TrampC1 分泌的外泌体的鉴定与特点 |
| 1.2.2 DC2.4 细胞系摄取肿瘤来源外泌体的情况 |
| 1.2.3 DC2.4 摄取TEX后有关活化与成熟的分子表型的变化 |
| 1.2.4 外泌体激活的树突状细胞的体外抗肿瘤免疫功能研究 |
| 1.2.5 肿瘤来源的外泌体与肿瘤裂解物以及不同来源的外泌体的比较…… |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、PD-1 抗体联合DC-TEX在体外水平对于前列腺癌细胞的免疫治疗效果的研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料与仪器 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 PD-1 抗体能够逆转DC-TEX活化的T细胞的耗竭状态 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、PD-1 抗体联合DC-TEX在体内水平对于前列腺癌的免疫治疗效果的研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验试剂和仪器 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 TrampC1 细胞系在C57/BL小鼠皮下肿瘤模型的建立 |
| 3.2.2 PD-1 抗体联合DC-TEX在前列腺癌小鼠模型中抗肿瘤免疫效果… |
| 3.2.3 小鼠的肿瘤组织中免疫微环境的变化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 在学期间发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 外泌体与免疫联合疗法在治疗前列腺癌方面的应用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）基于生物表面展示策略的功能化纳米载体的构建和应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 序言 |
| 1.1 纳米材料概述 |
| 1.2 功能化纳米粒子简介 |
| 1.2.1 功能化纳米粒子的用途 |
| 1.2.2 功能化纳米粒子上偶联配体的种类 |
| 1.3 纳米材料功能化及其表面修方法概述 |
| 1.3.1 表面包被法 |
| 1.3.2 物理吸附法 |
| 1.3.3 化学偶联法 |
| 1.3.4 针对蛋白配体的纳米偶联方法 |
| 1.4 纳米仿生材料综述 |
| 1.4.1 病毒拟态纳米材料 |
| 1.4.2 细胞拟态纳米材料 |
| 1.4.3 细菌拟态纳米材料 |
| 1.4.4 其他生物拟态纳米材料 |
| 1.5 生物表面展示技术的概述 |
| 1.5.1 微生物表面展示系统 |
| 1.5.2 细胞表面展示系统 |
| 1.5.3 蛋白纳米笼表面展示系统 |
| 1.6 选题的意义、目的和思路 |
| 第二章 病毒拟态纳米囊泡作为通用的疫苗抗原展示平台 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验仪器和试剂 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验质粒、细胞、菌株及小鼠 |
| 2.2.4 常用实验试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 常用的分子克隆实验方法 |
| 2.3.2 HA抗原基因的细胞转染 |
| 2.3.3 流感病毒血凝素蛋白HA在细胞膜上定位的鉴定 |
| 2.3.4 流感病毒拟态纳米囊泡的制备和纯化 |
| 2.3.5 流感病毒拟态纳米囊泡的材料学相关表征 |
| 2.3.6 流感病毒拟态纳米囊泡的凝血酶活性检测 |
| 2.3.7 小鼠的免疫及免疫效果的评价 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 激光共聚焦显微镜鉴定HA抗原的细胞定位 |
| 2.4.2 病毒拟态纳米囊泡的冷冻电镜成像 |
| 2.4.3 病毒拟态纳米囊泡的免疫共沉淀检测 |
| 2.4.4 凝血酶活性检测 |
| 2.4.5 小鼠免疫血清的总抗体滴度测定 |
| 2.4.6 中和抗体滴度检测 |
| 2.4.7 血凝抑制效果的测试 |
| 2.4.8 小鼠的攻毒实验 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 外泌体拟态纳米囊泡作为肿瘤靶向的药物递送平台 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验仪器和试剂 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验质粒、细胞、菌株及小鼠 |
| 3.2.4 常用实验试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 质粒构建及基因转染 |
| 3.3.2 靶向蛋白配体的细胞定位 |
| 3.3.3 外泌体拟态纳米囊泡的制备 |
| 3.3.4 外泌体拟态纳米囊泡的材料学表征 |
| 3.3.5 体外细胞靶向结合实验以及光热治疗 |
| 3.3.6 体外细胞毒性检测 |
| 3.3.7 小鼠肿瘤模型的建立 |
| 3.3.8 多模态分子成像及成像指导下的光热治疗 |
| 3.3.9 阿霉素药物的生物分布 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 质粒构建 |
| 3.4.2 改造后的hEGF的细胞定位 |
| 3.4.3 表面活化剂诱导细胞出芽产生微囊泡 |
| 3.4.4 不同表面活化剂对囊泡粒径的影响 |
| 3.4.5 外泌体拟态纳米囊泡的其他表征 |
| 3.4.6 外泌体拟态纳米囊泡的细胞靶性以及生物活性的检测 |
| 3.4.7 细胞的靶向光热治疗 |
| 3.4.8 肿瘤的多模态成像 |
| 3.4.9 成像指导下的活体光热治疗 |
| 3.4.10 HER2靶向的药物运输 |
| 3.4.11 HER2靶向的小鼠肿瘤治疗 |
| 3.4.12 小鼠各脏器的H&E染色 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 展示PD-L1抗体的、细胞膜包裹的氧化锰纳米粒子用作肿瘤的放疗与免疫联合治疗,以诱导远端效应 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验仪器和试剂 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验试剂及材料 |
| 4.2.3 实验质粒、细胞、菌株及小鼠 |
| 4.2.4 常用实验试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 MnO_2纳米粒子的合成 |
| 4.3.2 骨髓间充质干细胞的培养与基因工程修饰 |
| 4.3.3 骨髓间充质干细胞(MSC)来源的膜囊泡的提取 |
| 4.3.4 细胞膜包裹的氧化锰纳米粒子的制备 |
| 4.3.5 膜包裹氧化锰纳米粒子的表征 |
| 4.3.6 体外细胞实验 |
| 4.3.7 活体成像 |
| 4.3.8 肿瘤放疗与免疫治疗 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 PLV-aPD-L1质粒的构建 |
| 4.4.2 PD-L1 ScFv在细胞中的定位 |
| 4.4.3 透射电镜图 |
| 4.4.4 膜包裹氧化锰纳米颗粒的其他表征 |
| 4.4.5 体外细胞靶向性以及免疫激活 |
| 4.4.6 体外放疗增敏检测 |
| 4.4.7 放疗后的细胞杀伤效果 |
| 4.4.8 活体MR成像 |
| 4.4.9 活体荧光成像 |
| 4.4.10 远端效应的检测 |
| 4.4.11 放疗后细胞因子的检测 |
| 4.5 讨论与小结 |
| 第五章 总结和展望 |
| 附件 |
| 参考文献 |
| 缩写词 |
| 致谢 |
（7）联合阻断免疫检查点PD1和VISTA分子在放射治疗小鼠CT26结肠癌模型的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Absract |
| 研究背景 |
| 第一部分 VISTA等免疫分子在K-RAS基因变异结直肠癌组织中表达的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 引用文献 |
| 附图 |
| 第二部分 联合阻断免疫检查点PD1和VISTA分子在放射治疗小鼠CT26结肠癌模型的研究 |
| 材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 引用文献 |
| 缩略语对照表 |
| 致谢 |
（8）基于重组MS2病毒样颗粒的前列腺癌RNA疫苗的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 基于MS2 VLPs的前列腺癌预防及治疗性mRNA疫苗的研究 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1. 材料 |
| 1.1.1. 菌株、细胞系和质粒 |
| 1.1.2. 主要试剂 |
| 1.1.3. 溶液的配制 |
| 1.1.4. 仪器及耗材 |
| 1.2. 方法 |
| 1.2.1. pMS2-hPAP-GM-CSF、pMS2-mPAP-GM-CSF等酵母表达载体的构建 |
| 1.2.2. hPAP-GM-CSF VLPs、mPAP-GM-CSF VLPs等的表达及纯化 |
| 1.2.3. hPAP-GM-CSF VLPs、mPAP-GM-CSF VLPs等的鉴定 |
| 1.2.4. CCK法检测细胞毒性 |
| 1.2.5. hPAP-GM-CSF VLPs免疫刺激活性的检测 |
| 1.2.6. VLPs包裹的mRNA体外翻译能力及清除速率的分析 |
| 1.2.7. mRNA疫苗接种 |
| 1.2.8. ELISA法检测抗体效价 |
| 1.2.9. T细胞增殖实验 |
| 1.2.10. ELISA法和ELISPOT法检测细胞因子 |
| 1.2.11. FACS法检测树突状细胞(DCs)和调节性T细胞(Tregs) |
| 1.2.12. 肿瘤接种及肿瘤大小检测 |
| 1.2.13. 统计学分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1. pMS2-hPAP-GM-CSF、pMS2-mPAP-GM-CSF等酵母表达载体的构建 |
| 2.2. hPAP-GM-CSF VLPs、mPAP-GM-CSF VLPs等的表达及纯化 |
| 2.3. hPAP-GM-CSF VLPs、mPAP-GM-CSF VLPs等的鉴定 |
| 2.4. VLPs包裹的mRNA体外翻译能力及清除速率的分析 |
| 2.5. hPAP-GM-CSF VLPs的细胞毒性及免疫刺激能力的分析 |
| 2.6. hPAP-GM-CSF VLPs等mRNA疫苗对DCs的激活作用 |
| 2.7. hPAP-GM-CSF VLPs等mRNA疫苗诱导的体液免疫应答 |
| 2.8. hPAP-GM-CSF VLPs等mRNA疫苗诱导的细胞免疫应答 |
| 2.9. hPAP-GM-CSF VLPs等mRNA疫苗对调节性T细胞的影响 |
| 2.10. hPAP-GM-CSF VLPs等mRNA疫苗肿瘤预防效果的评估 |
| 2.11. hPAP-GM-CSF VLPs等mRNA疫苗肿瘤治疗效果的评估 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 基于MS2 VLPs的前列腺癌治疗性microRNA疫苗的初步研究 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1. 材料 |
| 1.1.1. 菌株、细胞系和质粒 |
| 1.1.2. 主要试剂 |
| 1.1.3. 溶液的配制 |
| 1.1.4. 仪器及耗材 |
| 1.2. 方法 |
| 1.2.1. p2MS2-microRNA-23a、p2MS2-microRNA-23b等酵母表达载体的构建 |
| 1.2.2. TAT-microRNA-23a VLPs、TAT-microRNA-23b VLPs等的表达及纯化 |
| 1.2.3. TAT-microRNA-23a VLPs、TAT-microRNA-23b VLPs的鉴定 |
| 1.2.4. CCK法检测细胞毒性 |
| 1.2.5. TAT-mRNA VLPs及TAT-microRNA VLPs体外翻译能力的分析 |
| 1.2.6. FACS法检测肿瘤细胞凋亡 |
| 1.2.7. 统计学分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1. p2MS2-microRNA-23a、p2MS2-microRNA-23b等酵母表达载体的构建 |
| 2.2. TAT-microRNA-23a VLPs、TAT-microRNA-23b VLPs等的表达及纯化 |
| 2.3. TAT-microRNA-23a VLPs、TAT-microRNA-23b VLPs等的鉴定 |
| 2.4. TAT-microRNA-23a VLPs的细胞毒性分析 |
| 2.5. 携带TAT的VLPs包裹的RNA体外翻译能力的分析 |
| 2.6. TAT-microRNA-23a VLPs体外抗肿瘤效果的评价 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 论文综述 |
| 参考文献 |
| 附录1 pESC-URA载体信息 |
| 附录2 pGEM~(?)-T Easy载体信息 |
| 附录3 重组表达载体pMS2测序和序列比对结果 |
| 附录4 重组表达载体pMS2p测序和序列比对结果 |
| 附录5 重组表达载体pMS2-hPAP测序和序列比对结果 |
| 附录6 重组表达载体pMS2-mPAP测序和序列比对结果 |
| 附录7 重组表达载体pMS2-GM-CSF测序和序列比对结果 |
| 附录8 重组表达载体pMS2-hPAP-GM-CSF测序和序列比对结果 |
| 附录9 重组表达载体pMS2-mPAP-GM-CSF测序和序列比对结果 |
| 附录10 重组表达载体p2MS2测序和序列比对结果 |
| 附录11 重组表达载体p2MS2-GM-CSF测序和序列比对结果 |
| 附录12 重组表达载体p2MS2-GFP测序和序列比对结果 |
| 附录13 重组表达载体p2MS2-microRNA-23a测序和序列比对结果 |
| 附录14 重组表达载体p2MS2-microRNA-23b测序和序列比对结果 |
| 附录15 重组表达载体p2MS2-microRNA-con测序和序列比对结果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）树突状细胞疫苗的现状与未来（论文提纲范文）
| 1 DC的生物学特性 |
| 2 DC的分离与培养 |
| 3 DC疫苗的应用前景 |
| 3.1 在抗肿瘤领域的应用前景 |
| 3.2 在抗感染领域的应用前景 |
| 3.3 在器官移植领域的应用前景 |
| 3.4 在变态反应性疾病领域的应用前景 |
| 3.5 在自身免疫性疾病领域的应用前景 |
| 4 结语 |
（10）树突状细胞-EBV-LMP2疫苗治疗鼻咽癌的初步研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 树突状细胞体外诱导培养条件优化的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 树突状细胞-EBV-LMP2疫苗在小鼠中药效学的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 树突状细胞-EBV-LMP2疫苗在NPC患者中的免疫效果的初步研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 树突状细胞为基础的肿瘤疫苗研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、树突状细胞经EB病毒膜抗原gp340刺激后诱导抗肿瘤免疫应答（论文参考文献）
- [1]HLA-DPB1和EB病毒gp42蛋白的结合方式与新疆地区霍奇金淋巴瘤发病的相关性研究[D]. 李红玉. 新疆医科大学, 2021(08)
- [2]MDSC分泌的Arg-1对肠炎小鼠Th17细胞的影响及橡黄素治疗机制的研究[D]. 马占川. 吉林大学, 2020(08)
- [3]STING在BCR激活过程中协同PI3K调节肌动蛋白重组[D]. 杨璐. 华中科技大学, 2020(01)
- [4]预警素表达的慢病毒疫苗对肝细胞癌免疫治疗的作用研究[D]. 刘志礼. 天津医科大学, 2019(02)
- [5]PD-1抗体和外泌体激活的树突状细胞联合治疗前列腺癌的实验研究[D]. 张正. 天津医科大学, 2019(02)
- [6]基于生物表面展示策略的功能化纳米载体的构建和应用[D]. 张鹏飞. 厦门大学, 2019(08)
- [7]联合阻断免疫检查点PD1和VISTA分子在放射治疗小鼠CT26结肠癌模型的研究[D]. 王欣. 苏州大学, 2018(04)
- [8]基于重组MS2病毒样颗粒的前列腺癌RNA疫苗的研究[D]. 孙艳丽. 北京协和医学院, 2013(11)
- [9]树突状细胞疫苗的现状与未来[J]. 邵惠训. 中国医药生物技术, 2012(01)
- [10]树突状细胞-EBV-LMP2疫苗治疗鼻咽癌的初步研究[D]. 杜海军. 中国疾病预防控制中心, 2010(03)