一、用地高辛标记的核酸探针从尿囊液和组织中检测传染性支气管炎病毒（论文文献综述）
武奇[1]（2021）在《IBV S蛋白抗原表位鉴定及与宿主细胞互作的研究》文中研究表明传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起鸡的一种急性、高度接触性传染病,主要表现为呼吸道与肾脏疾病。IBV目前仍是危害养禽业的重要病原体之一,给全球的养禽业造成了巨大的经济损失。疫苗免疫在控制IB方面扮演着重要作用,IBV抗原的不断变异严重制约了现有的疫苗研发策略和血清学诊断。S蛋白是含有丰富中和抗原表位的表面蛋白,也是病毒进入宿主细胞的关键蛋白。但是目前对于S蛋白功能的认识及其与宿主细胞的互作还知之甚少。因此,本研究围绕IBV防控关键技术的开发,从S蛋白广谱中和表位鉴定及S蛋白与宿主细胞互作两个方面进行了研究。具体内容如下:1、传染性支气管炎病毒S蛋白新的关键抗原表位鉴定本研究首先利用软件对IBV S蛋白进行分析,根据S蛋白序列的抗原性、亲水性、表面抗原指数、保守性等指标,选取并人工合成五条抗原性和亲水性好、高度保守的多肽。通过多肽和血清交叉反应,证明五条多肽均与IBV血清有反应原性,其中Pep1的反应性最好,可以与检测的5个血清型中的4个血清型血清有很好的交叉反应性,仅仅不与New cluster型毒株CK/CH/2010/JT1的血清发生交叉反应。人工合成CK/CH/2010/JT1株的该段多肽序列,命名Pep6。通过对多肽序列比较分析,发现Pep1与Pep6序列存在5个氨基酸差异。多肽血清交叉反应结果显示Pep6不仅可以与CK/CH/2010/JT1血清反应,同时与所有检测血清均发生交叉反应。为了确定影响抗原性改变的关键氨基酸,对多肽进行截短和单个氨基酸突变,最后确定16R氨基酸是决定抗原表位广谱性的关键氨基酸。对NCBI数据库中所有的全基因毒株进行序列分析,发现传统的Mass型毒株均是16K毒株,而目前在中国流行的QX型,TW-1型等毒株均是16R突变株,进一步分析发现,16R突变株自20世纪90年代开始出现,随后发展成为流行优势株,目前在全球各大洲均有分布。本研究鉴定了一个广谱的抗原表位,并证明了 16R氨基酸是该抗原表位具有广谱性的关键。这为新型广谱疫苗的研发和检测方法的建立提供了一定理论指导。2、检测IBV抗体多肽ELISA方法的建立及初步应用本实验室在前期的IBV流行病学调查过程中发现,现有的商品化IBV抗体检测试剂盒,不能很好的检测出新型IBV变异株的血清抗体。利用Pep6抗原表位多肽作为包被抗原,建立检测IBV抗体的pELISA方法。本研究首先对检测条件进行优化,确定pELISA最佳反应条件为:最佳包被浓度0.63 μg/mL;血清最佳稀释度为1:200;血清最佳孵育时间为60 min;酶标抗体最佳孵育时间60 min;底物最佳反应时间20 min。确定pELISA的临界值为0.185。批间和批内重复性检测结果显示变异系数均小于10%,具有很好的重复性。特异性检测结果表明pELISA其他禽类病毒阳性血清均不发生非特异性反应。以IFA为参考方法,测定了 250份临床血清样品,结果显示,pELISA的敏感性、特异性和准确性分别为99.14%、94.12%和98.80%,显着高于商品化试剂盒。为评估pELISA在检测IBV疫苗引起的免疫应答中的适用性,本研究测定了 IBVH52、4/91疫苗免疫后不同时间点采集的血清,结果显示pELISA最早在疫苗接种后7 d就能检测出IBV特异性抗体,而商品化试剂盒在免疫后14 d才能检测出IBV特异性抗体。进一步分析发现,pELISA检测出的阳性率明显高于商品化的ELISA试剂盒,提示本研究建立的pELISA在检测IBV抗体和评价IBV疫苗方面具有一定的应用价值。3、应用pELISA替代中和实验评估IBV疫苗免疫应答的初步研究鸡群中血清的中和抗体是反映鸡群免疫状况的主要指标,也是评价疫苗免疫效果的关键指标之一。传统上用中和试验测定血清中和抗体,但中和实验操作复杂,技术程度较高,制约了疫苗应用后的效率评价。然而,目前还没有简单、快速的检测IBV中和抗体的替代方法。为此,探究了 pELISA作为一种潜在替代中和实验评价IBV疫苗的免疫应答的可能。首先制备Pep6的多抗血清,ELISA结果显示,多肽血清与多肽能发生特异性反应。病毒与血清的交叉中和实验结果显示Pep6的多抗血清能够中和IBV病毒,中和效价为1:8,表明Pep6含中和抗原表位。随后,应用pELISA与中和实验比较检测IBV 阳性血清,结果显示血清中和效价与pELISA效价具有很好的正相关性。进一步比较检测了 M41、H52、CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14 毒株免疫/攻毒后不同时间点采集的血清,结果显示免疫/攻毒后血清的中和效价和ELISA效价均随免疫时间逐渐升高。各毒株血清的中和效价与pELISA效价的具有明显的正相关性,总相关系数达到0.83。该方法的建立为临床基层IBV疫苗免疫效果评价提供了技术条件。4、IBV S1蛋白与宿主细胞膜蛋白互作的研究IBV S蛋白在病毒感染复制过程起关键作用,通常S1与识别宿主受体并结合细胞相关,而S2促进病毒囊膜与细胞膜融合。尽管IBV是最早发现的冠状病毒,目前对IBV S1与宿主细胞互作的认识仍非常有限,还没有鉴定出IBV的蛋白受体,同时对于IBV入胞机制仍知之甚少。为此本研究构建了正确表达S1-IgGFc融合蛋白的真核质粒pCAGGS-S1-IgGFc,利用Protein G纯化柱纯化了 S1-IgGFc融合蛋白,然后应用细胞膜提取试剂盒提取CEK细胞的膜蛋白,将纯化的融合蛋白与CEK细胞膜蛋白进行免疫共沉淀（Co-IP）,SDS-PAGE银染结果显示,与对照相比发现了 3条差异条带。将差异条带送质谱测序,共鉴定出GRP78、ANXA2、HSPA9、Vimentin等4种宿主蛋白与IBV S1蛋白互作,提示这些蛋白可能在病毒感染细胞发挥某种作用,为进一步探究IBV与宿主细胞膜蛋白的互作机制研究提供一定的材料和理论基础。5、GRP78蛋白促进IBV在CEK细胞中的复制GRP78蛋白又称HSPA5蛋白,是热休克蛋白家族的成员之一。传统上认为GRP78是一种ER伴侣蛋白,目前GRP78蛋白因在多种病毒的感染过程中发挥重要作用而被人们所熟知。在上一部分研究的基础上,通过Co-IP实验,进一步确定了 IBV S1蛋白与GRP78蛋白确实存在相互作用。本研究用抗GRP78多克隆抗体封闭CEK细胞,抑制GRP78蛋白的表达,结果发现抗GRP78多克隆能够有效抑制IBV M41在CEK细胞中的复制。进一步用siRNA干扰实验证明,当CEK细胞表面的GRP78的表达被抑制时,IBVM41的感染也被显着抑制。非易感细胞重建实验结果提示,不同浓度的GRP78真核质粒（0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg）转染CEF细胞,随着转染质粒浓度不断升高,IBVM41感染CEF细胞的感染能力逐渐增强,成明显的正相关。综上所述,GRP78蛋白在IBV感染CEK细胞过程中扮演了重要角色,该GPR78可能促进IBV进入宿主细胞。
姜煜晨[2]（2021）在《江苏地区小鹅瘟流行病学调查及其细胞适应毒研究》文中指出小鹅瘟（Gosling Plague,GP）是一种由鹅细小病毒（Goose Parvovirus,GPV）引起 1-20日龄雏鹅或雏番鸭的高度接触性、传播性、高致病性和高死亡率的急性或亚急性败血性传染病,严重危害养鹅业的发展。虽然小鹅瘟弱毒疫苗及卵黄抗体的使用对小鹅瘟的控制发挥了重要作用,但小鹅瘟依然有流行趋势。本研究在对江苏地区小鹅瘟分子流行情况初步了解基础上,对GPV-CZM、CZM-70和CZM-142进行了全基因序列分析,并对细胞适应毒CZM-142进行了动物攻毒保护实验相关的研究。1 2019-2020年江苏地区小鹅瘟分子流行调查为了解江苏地区小鹅瘟的流行情况,于2019年到2020年采集来自扬州大学动物医院的疑似小鹅瘟病例的肠道和肝脏等样品,共分离到30份GPV分离株。从流行季节来看,以春夏两季所得到的分离株较多;从临床脏器病变情况来看,主要以肠道症状为主。对所有GPV分离株的主要结构基因VP3进行测序,并对其基因序列、遗传进化、糖基化位点和基因重组测试进行分析研究。结果表明:30株GPV分离株的VP3全长均为1605bp,编码534个氨基酸,与GenBank中已发表的经典GPV-VP3序列同源性为95.2%-100%,氨基酸序列同源性为97.6%-100%,分离株集中分布在同一亚群中,与经典GPV株亲缘关系较近,说明遗传进化相对保守。所有分离株均有5个糖基化位点,比标准B株少505-508位NRTS糖基化位点。重组事件分析发现,现有分离株病毒没有重组情况的发生。2不同代次CZM株病毒全基因分析本研究选取GPV-CZM、CZM-70和CZM-142三株病毒进行了全基因测序和致病性试验。致病性试验结果表明,与其他代次毒株相比,CZM-142株在雏鹅的发病、致死率、体重等方面的影响是最小的,可以作为潜在的细胞弱毒疫苗候选株。全基因测序结果发现,三株病毒的全长均为5106bp。与GPV-CZM相比,CZM-142株基因存在79个核苷酸差异位点,其中,非编码区有32个核苷酸差异位点;编码区中有16个核苷酸差异位点位于NS片段,31个位于VP片段,不存在碱基的插入与缺失。氨基酸方面有8个位于NS蛋白,25个位于VP蛋白,其中部分氨基酸位点差异通过分析发现可能与细胞致弱机制有关。3细胞适应毒CZM-142动物攻毒保护实验为了解小鹅瘟细胞适应毒CZM-142对野毒攻毒保护的免疫效果,本研究将CZM-142适应毒分别以625、1250、2500和5000TCID50免疫剂量免疫1日龄雏鹅,并在免疫后第6天进行强毒100LD50的攻毒试验。结果发现,2500和5000TCID50剂量CZM-142适应毒免疫后不仅能产生较高抗体水平,而且均能有效保护雏鹅不发病,强毒对照组雏鹅全部发病死亡,说明2500个TCID50剂量的CZM-142适应毒就能有效保护100LD50的强毒感染,提示小鹅瘟细胞适应毒CZM-142株有望成为小鹅瘟病毒细胞弱毒疫苗候选株并应用于小鹅瘟的防控。
周雨洁[3]（2021）在《一株鸡源呼肠孤病毒的分离鉴定及竞争ELISA检测方法的建立》文中研究表明禽呼肠孤病毒（Avian reovirus,ARV）,属于呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属,可引起鸡的病毒性关节炎（Avain viral arthritis）,感染率可达100%,发病率为5%～20%,死亡率为1%～3%,能够引起肉鸡胴体品质下降和蛋鸡产蛋率下降。近年来,该病在我国流行呈上升趋势,ARV变异毒株更是给家禽业造成了严重的经济损失。竞争ELISA（Competitive ELISA,C-ELISA）是定量小分子时常用的方法。在该方法中,将与靶标功能相同的标记的竞争分子与检测样本共同孵育,随着样本中靶标分子的浓度增加,能与固相抗原结合的竞争分子呈现下降趋势,此时C-ELISA的信号降低。通过检测信号干扰量,观察预期信号输出的干扰程度来测定待测样本中抗体的浓度,能够有效避免间接ELISA潜在的二抗交叉反应,特异性强,灵敏度高。本研究采用鸡胚肝细胞分离方法对疑似感染病料进行病毒分离,通过RT-PCR检测、同源性比较、遗传进化分析等方法进行病毒的鉴定。病料研磨液接种鸡胚肝细胞后能够引起细胞融合,与典型细胞病变特征相吻合。RT-PCR检测结果与目标条带一致。通过对分离株S1～4基因的同源性和遗传变异分析发现,该分离株S1基因与经典毒株S1133、1733和2048的同源性分别只有76.4%、76.5%和76.5%,S2基因与经典毒株S1133、1733同源性能达到91.6%和91.5%,S3基因与经典毒株S1133、1733、2048同源性为88.93%、89.10%和88.22%,S4基因与经典毒株S1133、1733同源性能达到80.4%和80.5%,且均离经典毒株遗传距离较远。以上数据结果均显示本研究分离得到的是一株ARV变异毒株,将其命名为:ARV-8毒株。动物回归试验表明该毒株能够导致鸡的关节发生肿胀,关节腔有明显渗出,胸腺、脾等免疫器官肿大,且肉鸡比蛋鸡更为易感。利用本实验室构建的σC-pET-32a重组表达质粒,转入E.coli BL21（DE3）表达菌,优化诱导表达融合蛋白。通过镍柱亲和层析法进行蛋白纯化,SDS-PAGE电泳确定目的蛋白的表达形式为包涵体,通过蛋白质印迹（Western blot）、BCA浓度测定,证明重组蛋白表达特异性良好,反应性高。免疫14日龄的SPF鸡,每隔两周进行二免和三免,采集三免后的鸡血清,制备标准阳性血清。酶联免疫吸附试验（ELISA）测定阳性血清的效价为1:8000;通过间接免疫荧光（IFA）、Western blot、无菌性检测,证实其特异性、纯净性良好。通过方阵法确定蛋白最佳包被浓度为1:400,单抗最佳稀释浓度为1:500;血清最佳稀释浓度为1:50,羊抗鼠Ig G-HRP酶标二抗最佳稀释浓度为1:4000,封闭液选择为5%脱脂奶粉,最佳包被时间为4℃过夜,最佳封闭时间为2h,血清、单抗最佳孵育时间为1h,二抗最佳孵育时间为1h,显色液最佳时间为20min。将本研究建立的方法初步应用于临床检测,效果良好。综上所述,本研究从疑似感染的病鸡中分离鉴定出一株ARV变异野毒株,原核表达其主要结构蛋白σC,制备ARV阳性和阴性血清,建立了检测ARV抗体的竞争ELISA方法,为ARV变异毒株的检测,以及流行病学调查和疫苗评估提供了技术支持。
姜楠[4]（2020）在《禽偏肺病毒四重实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用》文中研究指明禽偏肺病毒主要引起火鸡和鸡发生急性高度接触性上呼吸道传染病。根据编码附属糖蛋白G基因的不同,禽偏肺病毒分为A、B、C和D四个亚型。火鸡是该病毒的易感动物,任何年龄都可发生呼吸道感染,日龄大的禽类较为严重。本病容易诱发其他细菌疾病的发生,易形成混合感染,导致死亡率上升。种火鸡和种鸭感染禽偏肺病毒可以造成产蛋性能严重下降,给养禽业造成严重经济损失。目前,除澳大利亚以外,该病已在世界范围内广泛流行。为明确禽偏肺病毒对国内家禽的影响及提高我国禽偏肺病毒检测水平,缩短检测时间,简化实验操作程序,满足疫病快速初筛及快速检测需求,本研究建立了能够同时检测四种亚型禽偏肺病毒的实时荧光RT-PCR检测方法,并采集1920份禽类双拭子进行核酸检测,分析禽偏肺病毒在禽群中的分布规律。本研究分别针对A、B、D三个亚型禽偏肺病毒的G基因和C亚型禽偏肺病毒的M基因的保守区域设计4对引物及4条特异性TaqMan探针,建立禽偏肺病毒四重实时荧光RT-PCR检测方法,对所建立的检测方法进行敏感性和特异性评估。同时,从8个省份/直辖市的活禽交易市场采集1920份禽双拭子样品,提取样品中的病毒RNA,利用已建立的禽偏肺病毒四重实时荧光RT-PCR方法进行检测。为了保证检测方法的准确性,通过文献查找已发布的禽偏肺病毒常规RT-PCR检测方法进行验证。结果表明,用本试验筛选的引物和探针建立的禽偏肺病毒四重实时荧光RT-PCR方法检测,将检测模板10倍梯度稀释,A、B和C亚型禽偏肺病毒可以检测到正常扩增曲线的最低模板浓度为102copies/μL,D亚型禽偏肺病毒可以检测到正常扩增曲线的最低模板浓度为103copies/μL,具有较高的灵敏度;取各亚型禽流感病毒和我国流行的其他禽类常见呼吸道病毒进行实时荧光RT-PCR方法检测,结果显示各亚型禽流感病毒和其他禽类常见呼吸道病毒及阴性对照均未出现扩增曲线,具有较高的特异性。在1920份双拭子样品中检测出39份双拭子样品为禽偏肺病毒阳性。其中B亚型禽偏肺病毒32份,感染宿主全部为鸡;C亚型禽偏肺病毒5份,A亚型和C亚型混合感染禽偏肺病毒2份,感染宿主为鸭和鹅。利用已发表的禽偏肺病毒常规RT-PCR检测方法进行验证,均可以扩出正确的目的条带;将RT-PCR产物进行测序,测序结果在NCBI上进行BLAST比对分析,所得结果与建立的检测方法结果一致。两种方法的检测结果符合率为100%。本研究建立的禽偏肺病毒四重实时荧光RT-PCR检测方法,具有良好的特异性和敏感性,可以用于禽偏肺病毒的快速检测同时区分四个亚型,大大提高了检测效率。本研究对8个省/直辖市的1920份拭子样品检测结果表明,我国部分鸡、鸭和鹅存在带毒现象,初步分析了我国部分地区禽群中禽偏肺病毒的分布规律,为下一步检测其他地区禽群中的禽偏肺病毒提供方向,为我国禽偏肺病毒的防治提供正确的理论依据。
胡瑞鸿[5]（2020）在《抗H株小鹅瘟病毒卵黄抗体的研制与质量评估》文中研究表明小鹅瘟（Gosling plague,GP）又称为鹅细小病毒病,是由鹅细小病毒引起的一种高度接触性、败血性传染病,是危害养鹅业的主要传染病。近年来,根据遗传进化分析,小鹅瘟病毒（Gosling plague virus,GPV）的毒力有增强趋势,给该病的防治带来更大的挑战。目前GP的特异性防治主要依赖接种卵黄抗体（Immunoglobulin of yolk,IgY）进行被动免疫,对GP强毒感染具有明显的防治效果。由于IgY具有价格低廉、防治效果好等优点,已被广大养鹅户接受和采用。但目前使用的IgY多为粗制抗体,缺乏统一的生产、检验标准,琼扩抗体效价高低不等,故研制一种纯度及效价高,防治效果好,有统一生产标准的GPV IgY势在必行。本研究从黑龙江省某地饲养的雏鹅群中,采集疑似GP病死鹅的病料,进行GPV的分离鉴定,利用分离获得的GPV研制抗GP的IgY,并对其质量进行评价,具体研究内容和方法如下:（1）GPV的分离鉴定用氯仿提取法从疑似GP病死鹅的肝、脾组织中分离病毒,接种3日龄雏鹅和12日龄鹅胚进行病毒分离;分离的病毒经特异性检验（琼脂扩散试验（AGP）和鹅胚中和试验）、超微结构观察、毒力测定、理化特性（热敏感试验、乙醚敏感试验、氯仿敏感试验、胰蛋白酶敏感试验、耐酸性试验）检验、纯净性试验、核酸检测、VP3基因序列鉴定及基因进化树分析,进行综合鉴定。（2）GPV IgY的研制将分离鉴定获得的GPV（命名为H株）,经鹅胚逐级传代至F10,F10代进行1000倍稀释,接种12日龄鹅胚,收获鹅胚液作为GPV灭活疫苗抗原,抗原无菌检验和毒力检测合格后,进行浓缩及灭活,通过接种12日龄鹅胚进行灭活检验;灭活检验合格后进行GPV灭活疫苗的配制及乳化,获得GPV灭活疫苗,对其进行物理性状、无菌检验及安全性检验;将检验合格的GPV灭活疫苗按经典免疫程序免疫产蛋鸡,当高免鸡蛋卵黄液的GPV IgY琼扩抗体效价≥1:64时,对其进行除脂、提取和灭活,制备出抗H株GPV IgY。（3）抗H株GPV IgY的质量评价通过监测GPV IgY的琼扩抗体效价对GPV IgY的理化特性（温度、酸碱度、胃蛋白酶的作用时间、冻融次数）进行评价;通过GPV IgY单次单剂量、重复单剂量和单次大剂量皮下注射3日龄雏鹅及小白鼠的安全性试验,观察雏鹅和小白鼠的健康状况,局部及全身反应情况对GPV IgY的安全性进行评价;通过不同琼扩抗体效价和不同剂量的GPV IgY对GPV强毒攻毒24 h雏鹅的治疗试验、对GPV感染不同时长和不同日龄雏鹅的治疗试验,依据雏鹅治愈率,对GPV IgY治疗效果进行评价;用不同琼扩抗体效价和不同免疫剂量的GPV IgY对雏鹅皮下接种,24 h后用GPV强毒攻毒,依据雏鹅保护率进行预防效果评价;同类产品免疫3日龄雏鹅,依据雏鹅保护率与治愈率,评价GPV IgY与同类产品的差异。通过物理性状、无菌检验、支原体检验、GPV IgY琼扩抗体效价监测及对雏鹅攻毒保护率监测,确定GPV IgY的储存温度和时间。试验结果表明:（1）GPV的分离鉴定结果分离的病毒接种雏鹅,呈现与GP一致的临床症状和病理剖检变化;接种鹅胚,可在鹅胚中增殖,且为非血凝性感染病毒;AGP显示,从雏鹅和鹅胚分离的病毒液与GP阳性血清之间出现沉淀线;鹅胚中和试验证明,病毒液能被GP阳性血清中和,中和后的病毒液接种鹅胚不引起死亡;电镜下观察,H株病毒粒子具有典型的细小病毒特征;H株鹅胚和雏鹅传代培养F6～F10代,毒价最高且稳定,病毒的ELD50和LD50分别大于10-5.0/0.2 m L和10-4.0/0.2m L;以分离到的H毒株分别接种3日龄、10日龄、20日龄雏鹅,其致病性随雏鹅日龄增大而减弱;分离的病毒在56℃3 h保持其感染性,能够抵抗乙醚、氯仿、胰蛋白酶和酸性条件（p H3.0）的作用;分离的病毒液细菌、支原体和外源病毒检查均为阴性,证明H株病毒纯净;PCR核酸检测病毒约在500 bp处出现特异性DNA条带,DNA大小与GPV相符;上述结果表明,分离的病毒符合GP生物学特性,该病毒为GPV（命名为H株）。以PCR扩增出的VP3基因,与参考毒株的VP3基因序列对比,核苷酸的同源性在95.9%～99.1%之间,氨基酸同源性为97.9%～99.6%之间;基因进化树分析表明,H株与在黑龙江省分离的SP、ZZ、ZD、DQ、JX等毒株亲缘关系较与GD（广东）、YG（扬州）等毒株近。（2）GPV IgY的制备结果GPV H株灭活疫苗抗原无菌检验呈阴性、鹅胚液ELD50为10-5.22/0.2 m L、灭活检验鹅胚全部健活。GPV灭活疫苗的物理性状、无菌检验、安全检验均合格。用该GPV灭活疫苗免疫产蛋鸡,收集AGP≥1:64高免鸡蛋的卵黄液。高免卵黄液经酸化水1:8稀释、p H5.2、4℃作用15 h、1900 g离心20 min条件下除脂;酸化水-1.5%辛酸-33%硫酸铵提取;终浓度0.05%甲醛溶液经20～25℃灭活24 h,对GPV IgY的琼扩抗体效价、蛋白浓度及蛋白纯度均无显着影响,确定上述除脂、提取和灭活条件为最佳工艺。（3）GPV IgY的质量评价结果上述制备的抗H株GPV IgY在60℃以下作用2 h,GPV IgY琼扩抗体效价与对照比不降低,当温度达到70℃以上,琼扩抗体效价显着降低,当温度达到75℃作用30 min时,琼扩抗体效价呈阴性;p H范围在4.0～11.0时,GPV IgY琼扩抗体效价与对照比差异不显着,p H值为3.0和12.0时,GPV IgY琼扩抗体效价显着低于对照组;当胃蛋白酶作用6 h,琼扩抗体效价无变化,作用8 h以上显着降低;GPV IgY经5次反复冻融,琼扩抗体效价与对照比无显着差异;GPV IgY免疫雏鹅和小白鼠均未出现任何注射局部和全身不良反应,精神状态良好,采食正常;GPV IgY对雏鹅治疗效果表明,琼扩抗体效价越高、注射剂量越大,雏鹅治愈率越高;病毒感染雏鹅的时间越长、雏鹅日龄越大,雏鹅治愈率越低;GPV IgY对雏鹅预防效果表明,同一注射剂量,琼扩抗体效价越高,雏鹅保护率越高,同一琼扩抗体效价,注射剂量增加,雏鹅保护率增高;GPV IgY免疫雏鹅后12 h～10 d,对雏鹅保护率高达88.00%以上,可有效抵抗病毒感染。差异对比试验表明,研制的GPV IgY的雏鹅保护率与治愈率均高于同类产品。（4）GPV IgY的储存条件2～8℃储存24个月,GPV IgY的物理性状、纯净性、琼扩抗体效价稳定,对雏鹅感染GPV的保护率达88.00%以上。（5）GPV IgY推荐使用剂量和方法对已感染GPV的雏鹅,选择GPV IgY琼扩抗体效价为1:16以上,1.0 m L/只;对未感染雏鹅进行紧急预防免疫,0.5 m L/只,皮下注射,对GPV感染的治愈率和保护率均达80.00%。
陈基明[6]（2020）在《aMPV、IBV、NDV三重RT-PCR以及aMPV N蛋白的表达和间接ELISA方法的建立与应用》文中认为禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus,a MPV）主要引起鸡和火鸡的上呼吸道感染,造成蛋鸡产蛋率和蛋品质下降。近年发现a MPV对番鸭等其它禽类也存在致病性。a MPV单一感染致死率不高,但会导致免疫力下降,继发其它疾病,增加死亡率。目前除大洋洲外均出现a MPV感染的报道,该病严重威胁了世界范围内的养禽业。血清学调查表明目前包括广西在内的多个地区养鸡场的鸡群普遍存在a MPV感染,且不同品种、性别和用途的鸡群均感染严重,部分种鸡群阳性感染率甚至达到100%。a MPV分离较为困难,其感染鸡的临床症状、解剖病变又与传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）和新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）相似,传统的病理解剖观察很难区分。此外,近年来a MPV、IBV和NDV混合感染呈多发态势。因此,建立同时检测a MPV、IBV和NDV的诊断方法和了解该病在鸡群的流行情况非常重要。本课题组前期已建立了a MPV的RT-PCR检测方法,因此,本研究在此基础上建立a MPV、IBV及NDV三重RT-PCR检测方法并应用于临床样品检测,同时原核表达了a MPV N蛋白中亲水性和抗原性较好的保守区,纯化后作为包被抗原建立能够检测a MPV特异性抗体的通用型间接ELISA方法,具体如下。一、a MPV、IBV及NDV的三重RT-PCR方法的建立和应用根据Genbank收录的NDV的F基因序列设计一对特异性引物,结合本课题组已设计的a MPV及IBV通用引物,建立了能够同时检测a MPV、IBV及NDV的三重RT-PCR方法。对扩增条件进行优化,特异性试验、敏感性试验和重复性试验等结果表明了方法的可行性。结果显示三重RT-PCR方法能够特异地扩增a MPV、IBV及NDV,而IBDV、ILTV、REV、ALV、MDV、MDPV、DHAV、FADV、DTMUV、E.coli、Salmonella等扩增结果均为阴性;所建立的三重RT-PCR方法最低检出限为1 ng/μL的c DNA;重复性试验结果表明该方法重复性良好。应用建立的方法对220份临床样品检测,结果a MPV检测阳性率为10.45%（23/220）;IBV阳性率为56.4%（124/220）;NDV阳性率2.7%（6/220）。本研究建立了高效快速、灵敏特异的针对a MPV、IBV及NDV的三重RT-PCR检测方法,为养禽生产中三种常见多发的呼吸道疾病的同步快速诊断和疫情的监控提供了有力的技术支撑。二、禽偏肺病毒N蛋白的原核表达根据生物信息学软件对a MPV N蛋白氨基酸序列保守性、二级结构及B细胞抗原位点进行预测,选取较为保守、亲水性、抗原性好的N基因部分片段连入表达载体p ET32a-1中,转化大肠杆菌DE3细胞进行IPTG诱导表达,优化条件后大量表达,利用Ni-NTA树脂进行纯化,SDS-PAGE电泳和Western blot结果显示成功表达了N蛋白。a MPV N蛋白在原核表达系统中的成功表达为a MPV快速诊断技术的开发及基因工程疫苗的研制奠定了基础。三、禽偏肺病毒N蛋白间接ELISA方法的建立及应用应用以上纯化好的重组N蛋白作为包被抗原,经过一系列的条件优化,初步建立了基于N蛋白的间接ELISA方法,所建立ELISA方法与NDV、IBDV、AIV、ALV、MDV、IBV等阳性血清均无交叉反应,批内重复性试验最大变异系数为6.20%,批间重复性试验最大变异系数为8.25%,均小于10%。应用建立的N蛋白间接ELISA方法与商品化试剂盒对326份血清样品进行平行检测,结果表明所建立的N蛋白间接ELISA方法与商品试剂盒符合率为95.4%。对广西地区规模化养殖公司鸡群共960份血清样品进行a MPV抗体检测,结果表明a MPV抗体阳性率为94.06%。本研究为a MPV ELISA检测试剂盒研制打下了基础,同时为a MPV的早期诊断与流行病学调查建立了技术平台。综上所述,本研究建立了高效快速、灵敏特异的针对a MPV、IBV及NDV的三重RT-PCR检测方法;设计并原核表达保守性、抗原性、亲水性良好的通用型N蛋白;并且基于此蛋白建立了间接ELISA方法。本研究为常见多发的a MPV、IBV及NDV混合感染的快速诊断、疫情监测提供了良好的技术平台,为a MPV的早期诊断和流行病学调查奠定了扎实的技术基础。
张琪[7]（2020）在《鹅源减蛋综合征病毒的分离鉴定及其基因组的进化分析》文中提出减蛋综合征（Egg drop syndrome,EDS）是由减蛋综合征病毒（Egg drop syndrome virus,EDSV）引起的一种以产蛋鸡产薄壳或无壳蛋,产蛋率严重下降为主要特征的禽类传染性疾病,该病在世界范围内的发生和流行给养禽业带来了巨大的经济损失。鹅是EDSV主要自然宿主之一,成年鹅感染EDSV后只带毒不致病,成为鸡源EDS的传染源之一,雏鹅感染后可引发急性呼吸系统疾病,EDSV仅有一个血清型,不同分离株间致病性存在较大差异。因此,鹅源EDSV的分离鉴定和遗传进化分析不仅为进一步有效防制鹅EDSV感染提供了理论依据和物质基础,同时为防控鸡源EDS起到了积极的作用。本研究中,从吉林省某鹅场疑似感染小鹅瘟的病死雏鹅中采取小肠病料处理后,经PCR鉴定确认为小鹅瘟（Gosling plague,GP）和EDS混合感染。将病料匀浆接种SPF鸭胚盲传至第5代致胚体死亡,继续传至20代,期间进行PCR检测,表明只有EDSV增殖,病毒得到初步纯化。同时,将鸭胚毒接种鸭胚肝细胞（Duck embryo Liver cell,DEL）,72 h后出现EDSV典型的细胞病变。血凝实验表明分离毒只凝集鸡、鸭、鹅等禽类红细胞,不凝集牛、兔、羊等哺乳动物红细胞。扫描电子显微镜观察纯化后的病毒粒子,呈现腺病毒粒子典型形态。以上结果证实分离毒株为EDSV,命名为JL-EDSV-629株。根据Gen Bank上已经发表的EDSV基因组序列,利用引物设计软件设计了15对相互重叠的引物扩增JL-EDSV-629株,除两端的非编码区5’UTR和3’UTR外的基因组序列,拼接测序结果并进行同源性分析。结果表明共获得33215 nt的基因组序列,A+T含量为56.98%,符合富AT腺病毒特征;共编码29个ORF,主要为六邻体（hexon）、五邻体（penton）、纤维蛋白（fiber）、p VIII、p IIIa、p VII、p X和TP等结构蛋白,和DBP、IVa II、52K、EP、100K等非结构蛋白;与EDSV参考毒株AV-127、EDS和D11-JW-032相比,JL-EDSV-629株共有49个核苷酸发生突变,其中16个为错义突变。与EDSV参考毒株基因的氨基酸相比,其中同源性为100%的有penton、p X、hexon、DBP等19个基因,同源性为99.3%～99.8%的有TP、p VII,fiber等10个基因。生物信息学分析表明,该分离毒的基因组结构及基因排列顺序与EDSV参考毒株完全一致。核苷酸序列同源性分析及系统发育进化树分析表明,JL-EDSV-629株与富AT腺病毒属参考毒株同源性较高且亲缘关系较近,其中与EDSV参考毒株同源性达到99.8%,亲缘关系最近;与同属BAd V-4、OAV-287及Sn Ad V-1毒株达到54.6%～60.4%。与其他腺病毒属参考毒株同源性仅有25.8%～36.1%。同时,本研究制备了鸭抗JL-EDSV-629株多克隆抗体,多抗的血凝抑制（Hemagglutination Inhibition,HI）效价可达到13log2。利用原核表达系统制备了penton重组蛋白,ELISA结果显示penton的特异性抗体效价为1:16000,Western Blot结果显示制备的多抗与penton重组蛋白有良好的反应性,为后续研究该分离毒株的血清学诊断方法及结构蛋白的生物学功能提供物质基础。
庄金秋,阮震,张颖,梅建国,苗立中[8]（2018）在《鸡传染性支气管炎病毒实验室检测方法研究进展》文中指出鸡传染性支气管炎（IB）是鸡的一种急性、高度接触性、呼吸道传染病,严重危害着养禽业的健康发展。为有效地控制本病的流行,建立快速准确的检测方法具有重要意义。本文从该病的病原分离和鉴定、血清学及分子生物学等方面对IB的实验室检测方法最新研究进展进行了综述。
于春梅[9]（2013）在《坦布苏病毒的分离鉴定及荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用》文中研究指明坦布苏病毒感染是由坦布苏病毒（Tembusu virus，TMUV）引起的一种以蛋鸭产蛋量下降和雏鸭神经症状为主要特征的传染性疾病。主要表现为发生迅速、流行范围广、传播速度快、发病率和死亡率都较高，严重威胁我国养鸭业的发展，加强该病的研究对保护和促进我国养鸭业的发展具有重要意义。TMUV感染于2010年由曹贞贞、张大丙首次报道，之后在我国的大部分养鸭地区流行。建立精确、快速的检测方法是控制TMUV的有效措施。本研究从发病雏鸭脑内分离到一株TMUV，并对该病毒的生物学特性进行了研究；建立了荧光定量PCR的检测方法，利用建立的方法对雏鸭和蛋鸡不同组织器官中的TMUV分布情况进行了检测，从而为TMUV致病机理的研究提供理论依据一、坦布苏病毒SDLZ株的分离鉴定通过鸭胚尿囊腔接种，从疑似TMUV感染的病料组织中分离得到一株病毒，通过RT-PCR方法和动物回归试验对分离株进行鉴定，并对该毒株的培养特性进行了研究。分离毒株RT-PCR鉴定结果显示，PCR产物与设计引物预期产物大小一致，克隆测序结果与GenBank中的TMUV相应片段的核苷酸同源性均为100%。分离毒株人工感染雏鸭后的症状及病理变化与自然感染的病例相同；鸭胚半数致死量DELD50为10-4.5/0.2mL；该毒株可在鸡胚、鸭胚、鸭胚成纤维细胞（DEF）、非洲緑猴细胞（Vero）中培养增殖，并引起胚体和细胞病变。上述结果表明，分离毒株为TMUV，命名为SDLZ株。二、坦布苏病毒荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用根据本实验室测定的一株TMUV全基因序列（SDLZ株），选择该序列的E基因和NS5基因作为病毒蛋白基因，分别在其保守区域设计并合成特异性引物，扩增长度为225bp和264bp的目的片段。以β-actin肌动蛋白基因为内参基因，扩增长度为139bp的目的片段。将PCR扩增的的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒，经筛选、鉴定纯化后，倍比稀释作为标准品，用于实时荧光定量PCR中NS5、E基因及内参基因β-actin标准曲线的构建，建立检测坦布苏病毒的相对荧光定量RT-PCR方法。研究结果表明，构建的荧光定量PCR检测方法检测10倍梯度稀释的β-actin、NS5和E质粒标准品，最小检出模板浓度约为10Copies/μL，E基因、NS5基因和β-actin基因的Ct值与阳性质粒标准品的浓度均成良好的线性关系，标准曲线线性关系R2值均在0.99以上；特异性结果表明，E基因、NS5基因和β-actin基因的熔解曲线单一，表明扩增产物单一，无非特异性产物和引物二聚体；重复性结果显示，E基因、NS5基因和β-actin基因的批内、批间变异系数均小于0.5%。本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法快速、稳定、特异性强、灵敏度高，可以用于TMUV早期检测，以便于早发现，以及时采取相应的防治措施，减少TMUV感染对养鸭业造成的危害。三、坦布苏病毒在雏鸭体内的动态分布规律将纯化的TMUV人工感染3日龄雏鸭，定期剖杀攻毒组和对照组雏鸭，用建立的荧光定量PCR方法对各组织病料进行检测。结果显示：试验组雏鸭人工感染3d后可在各个组织中检测到TMUV，感染后7d在各组织中的相对表达量达到最大，感染15d天仍能在各组织中检测到病毒。TMUV相对表达量最高的器官为胰脏、脑、心脏，相对表达量在0.5～0.8之间，表明这些器官是TMUV感染后的主要靶器官。其次为肝脏、脾脏，相对表达量在0.4～0.6之间。表达量较低的为法氏囊和肺脏，相对表达量在0.2～0.4之间四、坦布苏病毒在蛋鸡体内的分布规律应用建立的荧光定量PCR方法检测TMUV感染产蛋鸡不同组织在不同时间段TMUV的相对表达量的变化，结果显示：攻毒后3d在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、胰脏、卵泡、输卵管中均可检测到坦布苏病毒，各组织TMUV的相对表达量都较高，其中卵泡和输卵管最高；攻毒后5d肝脏、脾脏、肺脏、胰脏的病毒含量减少，卵泡和输卵管含量没有变化；攻毒后9d，只在卵泡中检测到病毒。坦布苏病毒相对表达量最高的的器官为卵泡和输卵管，其次为心脏、肝脏、脾脏，肺脏和胰脏的相对表达量最低。结果表明，坦布苏病毒虽然没有对蛋鸡造成明显的临床症状和病理变化，但是在产蛋鸡体内各组织器官均检测到了坦布苏病毒的存在，说明坦布苏病毒能够感染蛋鸡且在产蛋鸡体内存活并增殖。
孙静[10]（2011）在《商品肉鸡呼吸道病原体共感染的检测》文中研究表明H9N2亚型禽流感病毒（Avian Influenza virus , AIV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）、传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV）、禽偏肺病毒（Avian Pneumovirus viruses, aMPV）、大肠杆菌（Escherichia coli , E. coli ）、鼻气管鸟杆菌（Ornithobacterium rhinotracheale, ORT ）和禽败血性支原体（Mycoplasma gallisepticum, M.G）是常见的能引起肉鸡呼吸道疾病的病原体。这些病原体既可以单独感染,也可以与其他一个或多个呼吸道病原体混合感染使商品肉鸡发病。而当两种或两种以上病原体同时或先后感染机体,可产生协同致病作用,比单一病原体所致疾病严重的多。近年来,呼吸道病原体共感染的报道越来越多,是目前导致我国商品肉鸡呼吸道疾病难于防制的重要原因。为快速、准确的对发生呼吸道疾病的肉鸡脏器中呼吸道病原体进行检测,本研究将AIV H9N2的HA基因、NDV的F基因、IBV的M基因、aMPV的F基因、MG的16SRNA基因、ORT的16SRNA基因和E. coli的16SRDNA基因的部分片段标记为地高辛探针。经灵敏性和特异性实验结果表明,所标记探针特异性强,灵敏度高。为了解山东省肉鸡群中呼吸道病原体的感染情况,本研究从山东省不同地区的商品肉鸡群和死亡鸡胚中分别采集脏器样品,用核酸探针技术对呼吸道病原体进行了检测,以此为呼吸道疾病的防控提供流行病学资料。从山东省济南、潍坊、青岛等地区肉鸡群采集421份有呼吸道症状的病、死鸡肺脏及160份临床健康肉鸡的肺脏进行上述七种呼吸道病原体的检测。结果表明421份发病肉鸡肺脏中AIV H9N2、NDV、IBV、aMPV、MG、ORT和E. coli的检出率分别为53.68%、68.41%、33.49%、54.87%、57.25%、9.02%和49.17%;且存在严重的共感染现象,共感染率高达90.26%,单一感染和阴性个体仅占7.36%和2.38%;发病肉鸡群中七种呼吸道病原体二重、三重、四重、五重、六重、七重感染的检出率分别达19.48%、26.12%、27.32%、11.88%、4.51%、0.95%,以二重、三重和四重感染最为常见。而临床健康肉鸡肺脏中AIV（H9N2）、NDV、IBV、aMPV、MG、ORT和E. coli的检出率分别为12.50%、23.13%、5.63%、36.87%、21.88%、0%和16.88%;阴性和单一样品所占比例分别为25.00%、43.75%;多重感染样品仅占31.25%,且主要为二重感染。上述结果表明,发病肉鸡和临床健康肉鸡均存在呼吸道病原体共感染,但二者差异极显着（P<0.001）,发病肉鸡更为严重,呼吸道病原体多重感染是肉鸡呼吸道疾病日益严重的重要原因。本研究对从山东省部分地区采集193份父母代发生呼吸道疾病后的死亡鸡胚脏器样品,用核酸探针技术进行上述七种呼吸道病原体的检测。结果表明H9N2 AIV、NDV、IBV、aMPV、MG、ORT和E. coli阳性率分别为33.33%、44.44%、26.11%、35.56%、48.33%、0%、52.22%,且存在严重的共感染现象,共感染率高达77.72%,单一感染和阴性个体仅占2.59%和19.69%;死亡鸡胚中七种呼吸道病原体二重、三重、四重、五重、六重、七重感染的检出率分别达30.56%、31.61%、11.40%、4.15%、0%、0%,多重感染主要为二、三重感染。上述结果表明,父母代发生呼吸道疾病后,鸡胚孵化过程中的死亡鸡胚中存在呼吸道病原体的共感染,呼吸道病原体多重感染是鸡胚死亡率上升的重要原因。在本研究中从山东省的发病鸡群中分离了1株病毒,经HA、HI试验和病毒回归试验确定所分离的毒株为新城疫病毒,命名为LVCX。按常规方法测得LVCX株的生物学毒力指标MDT、ICPI和IVPI分别为47.4 h、1.975和2.85,鸡胚半数致死量LD50为10-9.8。通过RT-PCR扩增出了LVCX的F基因,通过分析其融合蛋白氨基酸序列发现,分离株LVCX属于基因Ⅶ型,其多肽裂解位点为112-RRQKRF-117。表明LVCX株为NDVⅦ型强毒株。
二、用地高辛标记的核酸探针从尿囊液和组织中检测传染性支气管炎病毒（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用地高辛标记的核酸探针从尿囊液和组织中检测传染性支气管炎病毒（论文提纲范文）
（1）IBV S蛋白抗原表位鉴定及与宿主细胞互作的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 传染性支气管炎病毒研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 发现和分类 |
| 1.2 IBV的形态 |
| 1.3 IBV的理化特征 |
| 1.4 IBV培养特性 |
| 1.5 IBV致病性 |
| 1.6 IBV生活周期 |
| 2 IBV分子生物学特性 |
| 2.1 IBV基因组 |
| 2.2 IBV主要编码蛋白及功能 |
| 2.3 IBV毒株分型 |
| 3 IBV流行病学 |
| 3.1 自然宿主 |
| 3.2 实验室宿主 |
| 3.3 传播方式 |
| 3.4 IBV流行现状 |
| 4 IBV变异机制 |
| 4.1 点突变 |
| 4.2 基因缺失或插入 |
| 4.3 同源重组 |
| 5 诊断技术 |
| 5.1 分离鉴定 |
| 5.2 血清学诊断 |
| 5.3 分子生物学检测 |
| 综述二 IBV疫苗研究进展 |
| 1 疫苗接种 |
| 1.1 疫苗 |
| 1.2 接种时间 |
| 1.3 疫苗接种程序 |
| 2 疫苗的应用 |
| 2.1 喷雾疫苗接种 |
| 2.2 凝胶疫苗接种 |
| 3 疫苗接种后的保护评价 |
| 3.1 病毒分离 |
| 3.2 纤毛停滞 |
| 3.3 qRT-PCR |
| 3.4 血清中和抗体水平评价 |
| 综述三 IBV S蛋白研究进展及与宿主细胞互作研究进展 |
| 1 IBV S蛋白研究进展 |
| 1.1 结构特点 |
| 1.2 序列多样性 |
| 1.3 IBV S蛋白功能 |
| 1.4 影响病毒吸附的宿主因素 |
| 2 IBV与宿主互作的研究进展 |
| 2.1 病毒感染对细胞凋亡的影响 |
| 2.2 病毒感染过程中自噬的激活 |
| 2.3 冠状病毒感染与天然免疫反应 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 IBV S蛋白关键抗原表位的鉴定 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 病毒、多肽和血清样品 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 主要试剂配方 |
| 1.4 多肽库合成 |
| 1.5 IBV毒株EID_(50)测定 |
| 1.6 IBV S蛋白序列保守性和抗原性比较分析 |
| 1.7 pELISA实验步骤 |
| 1.8 IDEXX检测试剂盒实验步骤 |
| 1.9 IBV S2蛋序列比较分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 IBV S蛋白抗原性和保守性分析 |
| 2.2 多肽与IBV阳性血清的交叉反应 |
| 2.3 多肽抗原性关键氨基酸的确定 |
| 2.4 16R变异株的流行情况 |
| 3 讨论 |
| 第二章 检测IBV抗体多肽酶联免疫吸附试验(pELISA)方法建立及应用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 pELISA方法步骤 |
| 1.5 pELISA方法条件的优化 |
| 1.6 pELISA方法性能的评价 |
| 2 结果 |
| 2.1 Pep6与不同基因型毒株的血清具有很好的反应性 |
| 2.2 pELISA抗体检测方法条件的优化 |
| 2.3 pELISA临界值、重复性和特异性测定 |
| 2.4 pELISA性能的评价 |
| 3 讨论 |
| 第三章 pELISA评价疫苗免疫效力的潜在作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 ELISA方法实验步骤 |
| 1.4 多肽血清的制备 |
| 1.5 血清中和滴度的测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 多肽血清中和效果 |
| 2.2 pELISA与中和实验比较测定血清抗体滴度 |
| 2.3 免疫血清pELISA滴度与中和滴度的相关性 |
| 3 讨论 |
| 第四章 IBV S1蛋白互作蛋白的宿主蛋白 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 生物试剂 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 病毒总RNA提取 |
| 1.5 真核表达载体的构建 |
| 1.6 CEK细胞的制备 |
| 1.7 质粒转染 |
| 1.8 间接免疫荧光(IFA) |
| 1.9 Western-blot |
| 1.10 S1-IgGFc融合蛋白的纯化 |
| 1.11 CEK细胞膜蛋白提取 |
| 1.12 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 1.13 SDS-PAGE(银染) |
| 1.14 质谱 |
| 2 结果 |
| 2.1 sp-S1-IgGFc片段PCR扩增结果 |
| 2.2 重组质粒酶切鉴定 |
| 2.3 重组质粒转染IFA鉴定FJ14S1-IgGFc融合蛋白表达 |
| 2.4 激光共聚焦鉴定重组S1-IgGFc融合蛋白表达 |
| 2.5 Western blot鉴定重组融合蛋白S1-IgGFc的表达 |
| 2.6 重组S1-IgGFc融合蛋白的纯化 |
| 2.7 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.8 质谱鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第五章 GRP78蛋白协助IBV感染宿主细胞 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 生物试剂 |
| 1.3 主要试剂溶液配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 引物设计 |
| 1.6 真核质粒构建 |
| 1.7 CEKC的制备 |
| 1.8 质粒转染 |
| 1.9 共聚焦鉴定真核蛋白表达 |
| 1.10 免疫沉淀(IP) |
| 1.11 抗体封闭实验 |
| 1.12 siRNA干扰 |
| 1.13 GRP78转染293T重建实验 |
| 1.14 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 酶切鉴定构建的真核表达载体 |
| 2.2 共聚焦鉴定蛋白表达 |
| 2.3 GRP78蛋白与IBV S1蛋白的互作 |
| 2.4 多克隆抗体封闭CEK细胞膜表面GRP78蛋白抑制IBV复制 |
| 2.5 siRNA干扰GRP78的表达能抑制IBV的复制 |
| 2.6 非易感细胞感染实验 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）江苏地区小鹅瘟流行病学调查及其细胞适应毒研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 鹅细小病毒基本特征 |
| 1.1 病原学特征 |
| 1.2 宿主范围和培养特性 |
| 2 基因分子特征 |
| 2.1 GPV基因组结构 |
| 2.2 非结构蛋白 |
| 2.3 结构蛋白 |
| 3 临床特点 |
| 3.1 流行病学 |
| 3.2 临床症状和病理变化 |
| 4 诊断 |
| 4.1 病毒分离与鉴定 |
| 4.2 分子生物学诊断 |
| 4.3 血清学诊断 |
| 5 防治 |
| 本研究的目的及意义 |
| 研究内容一 2019-2020年江苏地区小鹅瘟分子流行调查 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料与实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒分离 |
| 2.2 病毒鉴定 |
| 2.3 PCR产物的纯化 |
| 2.4 与pGEM-T Easy载体的连接 |
| 2.5 连接产物的转化 |
| 2.6 质粒DNA的提取 |
| 2.7 酶切鉴定 |
| 2.8 重组质粒序列测定及分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 接种鹅胚结果 |
| 3.2 HA试验结果 |
| 3.3 PCR鉴定结果 |
| 3.4 重组质粒酶切鉴定结果 |
| 3.5 流行情况分析 |
| 3.6 GPV-VP3序列分析 |
| 3.7 氨基酸序列分析 |
| 3.8 VP3潜在糖基化位点分析 |
| 3.9 重组分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 研究内容二 不同代次CZM株病毒全基因分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒株、细胞及实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 原代GEF细胞制备 |
| 2.2 病毒传代 |
| 2.3 不同代次CZM株半数组织细胞感染量的测定 |
| 2.4 不同代次CZM株鹅胚半数感染量和半数致死量的测定 |
| 2.5 不同代次CZM株雏鹅致病性实验 |
| 2.6 全基因PCR扩增 |
| 2.7 构建重组质粒 |
| 2.8 重组质粒的筛选与鉴定 |
| 2.9 重组质粒序列测定及分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 GPV-CZM、CZM-70和CZM-142的TCID_(50)试验结果 |
| 3.2 GPV-CZM、CZM-70和CZM-142的EID_(50)和ELD_(50)试验结果 |
| 3.3 不同代次CZM株对雏鹅致病性实验结果 |
| 3.4 GPV全基因PCR扩增结果 |
| 3.5 重组质粒酶切鉴定结果 |
| 3.6 GPV全基因序列分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 研究内容三 细胞适应毒CZM-142动物攻毒保护实验 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 GPV强毒株的筛选 |
| 2.2 强毒对雏鹅半数致死量的测定 |
| 2.3 母源抗体检测 |
| 2.4 CZM-142免疫剂量选择试验 |
| 2.5 攻毒保护试验 |
| 2.6 攻毒保护重复性试验 |
| 2.7 泄殖腔排毒检测和体重称量 |
| 2.8 血清的分离 |
| 2.9 不同剂量免疫水平检测 |
| 2.10 组织器官病变情况 |
| 3 结果 |
| 3.1 GPV强毒株筛选结果 |
| 3.2 强毒对雏鹅半数致死量测定结果 |
| 3.3 母源抗体检测结果 |
| 3.4 CZM-142免疫剂量选择结果 |
| 3.5 攻毒保护试验结果 |
| 3.6 攻毒保护重复性试验结果 |
| 3.7 PCR检测泄殖腔排毒情况 |
| 3.8 免疫后鹅体重变化 |
| 3.9 不同免疫剂量抗体水平检测结果 |
| 3.10 组织器官病变情况 |
| 4 小结与讨论 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（3）一株鸡源呼肠孤病毒的分离鉴定及竞争ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡源呼肠孤病毒病的概述 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 致病性 |
| 1.2 鸡呼肠孤病毒病的诊断及防控 |
| 1.2.1 病毒分离与鉴定 |
| 1.2.2 分子生物学诊断 |
| 1.2.3 血清学诊断 |
| 1.2.4 防控措施 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的分离及鉴定 |
| 2.2.2 σC蛋白的原核表达 |
| 2.2.3 阳性血清、阴性血清的制备 |
| 2.2.4 ARV抗体竞争ELISA方法的建立及应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 毒株的分离鉴定结果 |
| 3.1.1 病毒分离情况 |
| 3.1.2 RT-PCR扩增结果 |
| 3.1.3 遗传进化分析 |
| 3.1.4 病毒纯净性检测结果 |
| 3.1.5 ELD_(50)的测定结果 |
| 3.1.6 TCID_(50)的测定结果 |
| 3.1.7 动物回归试验结果 |
| 3.2 σC蛋白的原核表达 |
| 3.2.1 SDS-PAGE电泳结果 |
| 3.2.2 Western-blot鉴定结果 |
| 3.2.3 蛋白浓度的确定 |
| 3.3 阳性血清、阴性血清的制备 |
| 3.3.1 血清的特异性鉴定结果 |
| 3.3.2 ELISA效价检测结果 |
| 3.3.3 血清的质量检验结果 |
| 3.4 ARV抗体竞争ELISA方法的建立及应用 |
| 3.4.1 ARV抗体竞争ELISA方法的优化 |
| 3.4.2 ARV抗体竞争ELISA方法的建立 |
| 3.4.3 临界值的判定 |
| 3.4.4 特异性试验结果 |
| 3.4.5 敏感性试验结果 |
| 3.4.6 重复性试验结果 |
| 3.4.7 临床检测试验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）禽偏肺病毒四重实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 aMPV的病原学 |
| 1.1 aMPV的病原分类 |
| 1.2 aMPV的形态学和理化性质 |
| 1.3 aMPV的基因组特征 |
| 2 aMPV的流行病学 |
| 2.1 自然宿主和易感动物 |
| 2.2 传播途径 |
| 2.3 临诊症状 |
| 3 病毒的分离鉴定 |
| 3.1 诊断样本的采集 |
| 3.2 aMPV的培养方法 |
| 3.3 aMPV的检测方法 |
| 4 aMPV的防治 |
| 4.1 aMPV的预防 |
| 4.2 aMPV疫苗的研制与应用 |
| 4.3 aMPV的治疗 |
| 5 研究的目的与意义 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 毒株来源 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒核酸提取 |
| 2.2 阳性质粒的合成与稀释 |
| 2.3 设计引物与探针 |
| 2.4 荧光RT-PCR反应体系 |
| 2.5 灵敏度和特异性验证 |
| 2.6 临床样品检测 |
| 2.7 一步法RT-PCR检测 |
| 2.8 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.9 核苷酸序列测定及分析 |
| 结果 |
| 1 筛选的引物和探针 |
| 2 灵敏度试验结果 |
| 3 特异性试验结果 |
| 4 临床样品检测结果 |
| 4.1 aMPV四重荧光RT-PCR检测结果 |
| 4.2 常规RT-PCR检测结果 |
| 4.3 aMPV基因测序结果 |
| 4.4 aMPV阳性样本数据分析 |
| 讨论 |
| 1 aMPV四重实时荧光RT-PCR检测方法建立 |
| 2 临床样品检测 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A (作者简介) |
| 附录B (在研期间发表论文 |
（5）抗H株小鹅瘟病毒卵黄抗体的研制与质量评估（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 小鹅瘟病毒研究现状 |
| 1.1.1 小鹅瘟病毒及小鹅瘟病简介 |
| 1.1.2 小鹅瘟病毒的鉴定方法 |
| 1.2 小鹅瘟生物制剂研究进展 |
| 1.2.1 小鹅瘟病毒活疫苗 |
| 1.2.2 小鹅瘟病毒灭活疫苗 |
| 1.2.3 小鹅瘟病毒基因疫苗 |
| 1.2.4 小鹅瘟病毒重组活载体疫苗 |
| 1.2.5 小鹅瘟抗血清 |
| 1.2.6 小鹅瘟病毒卵黄抗体 |
| 1.3 卵黄抗体的研究进展 |
| 1.3.1 卵黄抗体的结构特点 |
| 1.3.2 卵黄抗体的提取方法 |
| 1.3.3 卵黄抗体的灭活方法 |
| 1.3.4 卵黄抗体应用 |
| 1.3.5 卵黄抗体的优势与展望 |
| 1.4 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器与设备 |
| 2.2 主要材料和试剂 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 研究技术路线图 |
| 2.3.2 小鹅瘟病毒分离培养 |
| 2.3.3 小鹅瘟病毒的鉴定 |
| 2.3.4 小鹅瘟病毒灭活疫苗的制备及检验 |
| 2.3.5 小鹅瘟病毒卵黄抗体的制备 |
| 2.3.6 小鹅瘟病毒卵黄抗体质量评价 |
| 2.3.7 小鹅瘟病毒卵黄抗体储存条件的确定 |
| 2.4 试验数据分析及统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 小鹅瘟病毒分离培养 |
| 3.1.1 小鹅瘟病毒在雏鹅分离培养结果 |
| 3.1.2 小鹅瘟病毒在鹅胚分离培养结果 |
| 3.2 小鹅瘟病毒鉴定 |
| 3.2.1 小鹅瘟病毒特异性试验结果 |
| 3.2.2 小鹅瘟病毒粒子超微结构观察结果 |
| 3.2.3 小鹅瘟病毒毒力测定 |
| 3.2.4 小鹅瘟病毒理化特性 |
| 3.2.5 小鹅瘟病毒的纯净性试验结果 |
| 3.2.6 小鹅瘟病毒核酸检测结果 |
| 3.2.7 小鹅瘟病毒VP3基因序列鉴定 |
| 3.3 小鹅瘟病毒灭活疫苗抗原的制备及成品检验 |
| 3.3.1 小鹅瘟病毒H株灭活疫苗制备抗原用病毒的检验 |
| 3.3.2 小鹅瘟病毒H株灭活疫苗检验 |
| 3.4 小鹅瘟病毒卵黄抗体的制备 |
| 3.4.1 产蛋鸡选择结果 |
| 3.4.2 高免鸡蛋的琼扩抗体效价监测结果 |
| 3.4.3 小鹅瘟病毒卵黄抗体除脂条件的确定 |
| 3.4.4 小鹅瘟病毒卵黄抗体提取方法的确定 |
| 3.4.5 小鹅瘟病毒卵黄抗体外源性病毒灭活方法确定 |
| 3.5 小鹅瘟病毒卵黄抗体的质量评价 |
| 3.5.1 小鹅瘟病毒卵黄抗体的理化特性 |
| 3.5.2 小鹅瘟病毒卵黄抗体的安全性评价 |
| 3.5.3 小鹅瘟病毒卵黄抗体对人工感染雏鹅的治疗效果评价 |
| 3.5.4 小鹅瘟病毒卵黄抗体对雏鹅注射后攻毒的预防效果评价 |
| 3.5.5 小鹅瘟病毒卵黄抗体与试验选用的同类产品差异试验 |
| 3.6 小鹅瘟病毒卵黄抗体储存条件的确定 |
| 3.6.1 储存温度及时间对小鹅瘟病毒卵黄抗体物理性状的影响 |
| 3.6.2 储存温度及时间对小鹅瘟病毒卵黄抗体纯净性的影响 |
| 3.6.3 储存温度及时间对小鹅瘟病毒卵黄抗体琼扩抗体效价的影响 |
| 3.6.4 储存温度及时间对雏鹅攻毒预防效果的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 小鹅瘟病毒的分离鉴定及生物学特性分析 |
| 4.2 小鹅瘟病毒H株VP3基因序列分析 |
| 4.3 影响HA与HI效果的因素分析 |
| 4.4 小鹅瘟病毒灭活疫苗的制备 |
| 4.5 鸡群的选择管理与高免蛋黄收集 |
| 4.6 小鹅瘟病毒卵黄抗体除脂条件的确定及主要影响因素分析 |
| 4.7 最优小鹅瘟病毒卵黄抗体提取方法确定及分析 |
| 4.7.1 辛酸终浓度对小鹅瘟病毒卵黄抗体的影响 |
| 4.7.2 小鹅瘟病毒卵黄抗体提取方法的对比分析及验证 |
| 4.7.3 小鹅瘟病毒卵黄抗体的琼扩抗体效价与蛋白浓度的相关性分析 |
| 4.8 小鹅瘟病毒卵黄抗体灭活条件的确定 |
| 4.9 小鹅瘟病毒卵黄抗体的质量评价 |
| 4.9.1 小鹅瘟病毒卵黄抗体安全性评价 |
| 4.9.2 小鹅瘟病毒卵黄抗体治疗效果评价 |
| 4.9.3 小鹅瘟病毒卵黄抗体的预防效果评价 |
| 4.9.4 小鹅瘟病毒卵黄抗体试验选用的同类产品差异 |
| 4.10 储存条件的确定 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
（6）aMPV、IBV、NDV三重RT-PCR以及aMPV N蛋白的表达和间接ELISA方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩写对照 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 禽偏肺病毒的病原学 |
| 1.1.1 禽偏肺病毒的病原分类 |
| 1.1.2 禽偏肺病毒病毒形态学和理化特性 |
| 1.1.3 禽偏肺病毒基因组成和结构蛋白 |
| 1.1.4 禽偏肺病毒的复制与侵染机制 |
| 1.2 禽偏肺病毒的流行病学 |
| 1.2.1 禽偏肺病毒的宿主与易感动物 |
| 1.2.2 禽偏肺病毒的传播与分布 |
| 1.3 禽偏肺病毒的临床症状与病理变化 |
| 1.3.1 禽偏肺病毒的临床症状 |
| 1.3.2 禽偏肺病毒的病理变化 |
| 1.4 禽偏肺病毒的诊断方法 |
| 1.4.1 禽偏肺病毒的分离与培养 |
| 1.4.2 禽偏肺病毒的鉴定与鉴别诊断 |
| 1.4.2.1 禽偏肺病毒的电镜鉴定 |
| 1.4.2.2 禽偏肺病毒的分子生物学鉴定 |
| 1.4.2.3 禽偏肺病毒的血清学鉴定 |
| 1.4.2.4 禽偏肺病毒的鉴别诊断 |
| 1.5 禽偏肺病毒的研究进展 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 禽偏肺病毒、传染性支气管炎病毒及新城疫病毒的三重RT-PCR方法的建立和应用 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 毒株的增殖及RNA抽提 |
| 2.2.1.1 病毒的增殖 |
| 2.2.1.2 病毒核酸的提取及反转录 |
| 2.2.2 RT-PCR引物设计与合成 |
| 2.2.3 NDV通用引物的RT-PCR方法的扩增条件的优化 |
| 2.2.3.1 引物浓度范围的优化 |
| 2.2.3.2 退火温度范围的优化 |
| 2.2.3.3 特异性试验 |
| 2.2.3.4 敏感性试验 |
| 2.2.3.5 重复性试验 |
| 2.2.3.6 临床初步应用 |
| 2.2.4 三重RT-PCR鉴别方法的扩增条件优化 |
| 2.2.4.1 引物浓度范围的优化 |
| 2.2.4.2 退火温度范围的优化 |
| 2.2.5 三重RT-PCR特异性试验 |
| 2.2.6 三重RT-PCR敏感性试验 |
| 2.2.7 三重RT-PCR重复性试验 |
| 2.2.8 三重RT-PCR的初步应用 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 NDV通用引物的RT-PCR方法的扩增条件的优化结果 |
| 2.3.1.1 NDV通用引物的RT-PCR方法的引物添加量优化结果 |
| 2.3.1.2 NDV通用引物的RT-PCR方法的退火温度优化结果 |
| 2.3.1.3 NDV通用引物的RT-PCR方法特异性试验结果 |
| 2.3.1.4 NDV通用引物的RT-PCR方法敏感性试验结果 |
| 2.3.1.5 NDV通用引物的RT-PCR方法重复性试验结果 |
| 2.3.1.6 NDV通用引物的RT-PCR方法的临床初步应用 |
| 2.3.2 三重RT-PCR引物添加量优化结果 |
| 2.3.3 三重RT-PCR退火温度优化结果 |
| 2.3.4 三重RT-PCR特异性试验结果 |
| 2.3.5 三重RT-PCR敏感性试验结果 |
| 2.3.6 三重RT-PCR重复性试验结果 |
| 2.3.7 三重RT-PCR的初步应用 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 禽偏肺病毒N蛋白的原核表达 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 毒株的增殖及RNA抽提 |
| 3.2.1.1 病毒的增殖 |
| 3.2.1.2 病毒的提取及反转录 |
| 3.2.2 N蛋白重组表达质粒的构建 |
| 3.2.2.1 N基因的扩增 |
| 3.2.2.2 目的片段与表达载体的连接 |
| 3.2.2.3 连接产物的转化 |
| 3.2.2.4 重组表达质粒的抽提 |
| 3.2.2.5 重组表达质粒的鉴定 |
| 3.2.3 N基因的原核表达 |
| 3.2.3.1 重组表达质粒转化表达菌株 |
| 3.2.3.2 重组N蛋白的诱导表达及SDS-PAGE电泳检测 |
| 3.2.3.3 重组N蛋白的Western Blot鉴定 |
| 3.2.3.4 重组N蛋白的诱导表达条件的优化 |
| 3.2.3.5 重组N蛋白的大量诱导表达 |
| 3.2.3.6 重组N蛋白的纯化 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 PCR扩增重组N基因的结果 |
| 3.3.2 重组表达质粒的鉴定 |
| 3.3.2.1 重组表达质粒的PCR及酶切鉴定结果 |
| 3.3.2.2 重组表达质粒的测序结果 |
| 3.3.3 SDS-PAGE鉴定结果 |
| 3.3.3.1 不同诱导时间蛋白表达结果 |
| 3.3.3.2 不同浓度诱导剂蛋白表达结果 |
| 3.3.3.3 重组N蛋白Western Blot结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 禽偏肺病毒N蛋白的间接ELISA方法的建立及应用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂和仪器 |
| 4.1.2 主要试剂的配制 |
| 4.1.3 样品来源 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 N蛋白的间接ELISA最佳条件的摸索 |
| 4.2.1.1 抗原包被浓度和血清检测浓度的摸索 |
| 4.2.1.2 抗原包被条件的摸索 |
| 4.2.1.3 封闭时间的摸索 |
| 4.2.1.4 一抗作用时间的摸索 |
| 4.2.1.5 酶标二抗浓度的摸索 |
| 4.2.1.6 酶标二抗作用时间的摸索 |
| 4.2.1.7 显色TMB底物反应时间的摸索 |
| 4.2.1.8 阴阳性临界值的确定 |
| 4.2.1.9 ELISA特异性试验 |
| 4.2.1.10 ELISA敏感性试验 |
| 4.2.1.11 ELISA重复性试验 |
| 4.2.2 间接ELISA与商品化试剂盒的比较 |
| 4.2.3 间接ELISA的临床应用 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 间接ELISA摸索结果 |
| 4.3.1.1 抗原包被浓度和血清检测浓度的摸索结果 |
| 4.3.1.2 抗原包被条件的摸索结果 |
| 4.3.1.3 封闭时间的摸索 |
| 4.3.1.4 一抗作用时间的摸索 |
| 4.3.1.5 酶标二抗浓度的摸索 |
| 4.3.1.6 酶标二抗作用时间的摸索 |
| 4.3.1.7 显色TMB底物反应时间的摸索 |
| 4.3.1.8 阴阳性临界值的确定 |
| 4.3.1.9 根据摸索出的最佳条件确定间接ELISA的步骤 |
| 4.3.1.10 ELISA特异性试验 |
| 4.3.1.11 ELISA敏感性试验 |
| 4.3.1.12 ELISA重复性试验 |
| 4.3.2 间接ELISA与商品化试剂盒的比较 |
| 4.3.3 间接ELISA的临床应用 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 攻读硕士学位期间论文发表情况 |
（7）鹅源减蛋综合征病毒的分离鉴定及其基因组的进化分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 腺病毒概述 |
| 1.2 EDS的病原学 |
| 1.2.1 EDSV的分类 |
| 1.2.2 EDSV基本生物学特性 |
| 1.2.3 EDSV的基因组结构与复制周期 |
| 1.2.4 EDSV的蛋白及功能 |
| 1.3 EDS的流行病学与致病性 |
| 1.3.1 发生与分布及存在的问题 |
| 1.3.2 传播、携带者和传播媒介 |
| 1.3.3 致病性及其致病机制 |
| 1.4 EDS的诊断 |
| 1.4.1 临床诊断 |
| 1.4.2 剖检及组织学诊断 |
| 1.4.3 病毒的分离 |
| 1.4.4 血清学诊断 |
| 1.4.5 分子生物学诊断 |
| 1.5 EDS的防治 |
| 1.5.1 综合防治措施 |
| 1.5.2 疫苗 |
| 1.5.3 药物防治 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料及试验动物 |
| 2.1.2 质粒、菌株及载体 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要溶液配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 JL-EDSV-629 毒株的分离 |
| 2.2.2 JL-EDSV-629 毒株的鉴定 |
| 2.2.3 JL-EDSV-629 毒株在鸭胚上传代及血凝价测定 |
| 2.2.4 JL-EDSV-629 毒株基因组克隆 |
| 2.2.5 JL-EDSV-629 毒株基因组生物信息学分析 |
| 2.2.6 全病毒多抗血清的制备及抗体效价的测定 |
| 2.2.7 JL-EDSV-629 毒株penton的克隆及原核表达 |
| 2.2.8 penton特异性抗体效价的测定及免疫反应性鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 JL-EDSV-629 毒株的分离 |
| 3.1.1 病料的PCR鉴定 |
| 3.1.2 JL-EDSV-629 毒株的分离 |
| 3.2 JL-EDSV-629 毒株的鉴定 |
| 3.2.1 PCR鉴定 |
| 3.2.2 血凝特性及理化特性 |
| 3.2.3 病毒的超离纯化及病毒粒子形态学的观察 |
| 3.2.4 感染DEL细胞的特性 |
| 3.3 JL-EDSV-629 毒株在鸭胚上传代及血凝价测定 |
| 3.4 JL-EDSV-629 毒株基因组克隆 |
| 3.4.1 基因组的分段扩增 |
| 3.4.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.5 JL-EDSV-629 毒株基因组序列分析 |
| 3.5.1 JL-EDSV-629 株基因组结构特征分析 |
| 3.5.2 基因组同源性及系统进化树分析 |
| 3.5.3 penton基因同源性及系统进化树分析 |
| 3.5.4 fiber基因同源性及系统进化树分析 |
| 3.5.5 hexon基因同源性及系统进化树分析 |
| 3.5.6 DBP基因同源性及系统进化树分析 |
| 3.6 鸭抗JL-EDSV-629 株多克隆抗体效价的测定 |
| 3.7 JL-EDSV-629 毒株penton的克隆及原核表达 |
| 3.7.1 penton基因的克隆 |
| 3.7.2 p MD18-T-EDSV-penton重组质粒的鉴定 |
| 3.7.3 p ET-32a-EDSV-penton重组质粒的鉴定 |
| 3.7.4 penton重组蛋白的诱导表达 |
| 3.7.5 penton重组蛋白的纯化浓缩 |
| 3.8 penton特异性抗体效价的测定及免疫反应性鉴定 |
| 3.8.1 penton特异性抗体效价的测定 |
| 3.8.2 重组蛋白免疫反应性的Western Blot鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 JL-EDSV-629 株病毒的分离鉴定 |
| 4.2 JL-EDSV-629 毒株在鸭胚上传代及血凝价测定 |
| 4.3 JL-EDSV-629 株病毒基因组扩增 |
| 4.4 JL-EDSV-629 株病毒序列分析 |
| 4.5 多抗制备、penton蛋白的表达及免疫反应性分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（8）鸡传染性支气管炎病毒实验室检测方法研究进展（论文提纲范文）
| 1 病毒分离与鉴定 |
| 1.1 鸡胚接种 |
| 1.2 气管环接种 |
| 1.3 细胞培养 |
| 1.4 电镜检测 |
| 2 血清学检测方法 |
| 2.1 血凝和血凝抑制试验 (HA&HI) |
| 2.2 琼脂扩散试验 (AGP) |
| 2.3 病毒中和试验 (VN) |
| 2.4 荧光抗体技术 (FA) |
| 2.5 酶联免疫吸附试验 (ELISA) |
| 2.5.1 间接ELISA |
| 2.5.2 斑点ELISA (Dot-ELISA) |
| 2.5.3 夹心ELISA及双抗体夹心ELISA |
| 2.5.4 捕获ELISA |
| 2.6 胶体金免疫层析技术 (GICA) |
| 2.7 对流免疫电泳技术 (CIE) |
| 2.8 斑点免疫金测定法 (DIGFA) |
| 3 分子生物学检测方法 |
| 3.1 RT-PCR |
| 3.2 荧光定量RT-PCR |
| 3.3 环介导逆转录等温扩增技术 (RT-LAMP) |
| 3.4 核酸探针技术 |
| 3.5 基因芯片技术 |
| 3.6 限制性酶切片段长度多态性技术 (RFLP) |
| 4 小结 |
（9）坦布苏病毒的分离鉴定及荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 坦布苏病毒的一般生物学特性 |
| 1.1.1 分类学地位与形态学 |
| 1.1.2 理化特性 |
| 1.1.3 培养特性 |
| 1.1.4 主要症状 |
| 1.1.5 主要病理变化 |
| 1.2 坦布苏病毒的流行病学研究 |
| 1.3 坦布苏病毒的分子生物学研究 |
| 1.3.1 坦布苏病毒与其他黄病毒属病毒的基因组同源性比较 |
| 1.3.2 黄病毒属病毒主要蛋白研究进展 |
| 1.4 坦布苏病毒诊断方法的研究进展 |
| 1.4.1 坦布苏病毒的分离与鉴定 |
| 1.4.2 坦布苏病毒血清学检测方法 |
| 1.4.3 坦布苏病毒分子生物学检测技术 |
| 1.5 荧光定量检测方法的研究进展 |
| 1.5.1 实时荧光定量 RT-PCR 的定量原理 |
| 1.5.2 实时荧光定量 PCR 的基本概念 |
| 1.5.3 实时荧光定量的探针种类及工作原理 |
| 1.5.4 实时荧光定量的定量方法 |
| 1.5.5 实时荧光定量检测方法在畜牧生产中的应用 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料与试验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 主要溶剂的配置 |
| 2.2.2 坦布苏病毒的分离鉴定 |
| 2.2.3 SYBR GreenⅠ荧光定量 RT-PCR 检测坦布苏病毒 NS5 和 E 基因方法的建立 |
| 2.2.4 坦布苏病毒在雏鸭各组织中的分布情况 |
| 2.2.5 坦布苏病毒在蛋鸡各组织中的分布情况 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 坦布苏病毒分离鉴定结果 |
| 3.1.1 坦布苏病毒 NS3 基因 RT-PCR 扩增结果 |
| 3.1.2 TMUV NS3 基因的克隆测序及序列分析 |
| 3.1.3 坦布苏病毒的培养特性 |
| 3.1.4 坦布苏病毒 SDLZ 株的毒力测定 |
| 3.1.5 动物回归试验 |
| 3.1.6 雏鸭人工感染 TMUV 后的病理组织学研究 |
| 3.2 坦布苏病毒荧光定量 PCR 检测方法的建立与应用 |
| 3.2.1 重组质粒的 PCR 鉴定及其测序鉴定 |
| 3.2.2 荧光定量 PCR 反应条件的优化 |
| 3.2.3 荧光定量 PCR 检测β-actin、NS5、E 基因标准曲线的建立 |
| 3.2.4 特异性试验结果 |
| 3.2.5 敏感性试验结果 |
| 3.2.6 重复性试验结果 |
| 3.2.7 临床样品检测 |
| 3.3 雏鸭各组织中坦布苏病毒表达水平的相对荧光定量 PCR 分析 |
| 3.3.1 攻毒后雏鸭的主要临床症状和剖检病变 |
| 3.3.2 荧光定量 RT-PCR 方法检测 TMUV 在感染雏鸭体内的分布情况 |
| 3.3.3 荧光定量 PCR 方法与地高辛探针检测方法的比较 |
| 3.4 蛋鸡各组织中坦布苏病毒表达水平的相对荧光定量 PCR 分析 |
| 3.4.1 荧光定量 RT-PCR 方法检测 TMUV 在感染蛋鸡体内的分布情况 |
| 3.4.2 荧光定量 PCR 方法与地高辛探针检测方法的比较 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况期间 |
（10）商品肉鸡呼吸道病原体共感染的检测（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1. 前言 |
| 1.1 鸡呼吸道疾病概述 |
| 1.2 肉鸡呼吸道疾病 |
| 1.2.1 H9N2 亚型禽流感 |
| 1.2.1.1 病原学 |
| 1.2.1.2 流行病学 |
| 1.2.2 新城疫 |
| 1.2.2.1 病原学 |
| 1.2.2.2 流行病学 |
| 1.2.3 鸡传染性支气管炎 |
| 1.2.3.1 病原学 |
| 1.2.3.2 流行病学 |
| 1.2.4 禽偏肺病毒病 |
| 1.2.4.1 病原学 |
| 1.2.4.2 流行病学 |
| 1.2.5 鸡大肠杆菌病 |
| 1.2.5.1 病原学 |
| 1.2.5.2 流行病学 |
| 1.2.6 禽败血支原体 |
| 1.2.6.1 病原学 |
| 1.2.6.2 流行病学 |
| 1.2.7 鼻气管鸟杆菌病 |
| 1.2.7.1 病原学 |
| 1.2.7.2 流行病学 |
| 1.3 呼吸道病原体之间的相互作用 |
| 1.4 呼吸道病原体共感染检测方法 |
| 1.4.1 核酸探针检测方法 |
| 1.4.2 核酸探针的种类 |
| 1.4.3 核酸探针的标记 |
| 1.4.4 核酸探针的斑点杂交方法 |
| 1.5 本课题研究的内容、目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 仪器 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 病料 |
| 2.1.4 毒株 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 NDV、IBV、aMPV、MG、ORT 和E. coli 核酸探针的标记和敏感性、特异性检测 |
| 2.2.1.1 菌株DNA 的提取 |
| 2.2.1.2 扩增MG、ORT 和E. coli 目的片段的PCR 反应 |
| 2.2.1.3 尿囊液中病毒RNA 的提取 |
| 2.2.1.4 禽流感H9N2 亚型HA 基因、NDV 的F 基因、IBV51、aMPV F 基因的RT-PCR反应 |
| 2.2.1.5 PCR 产物的克隆及序列分析 |
| 2.2.1.6 核酸片段的定量 |
| 2.2.1.7 探针标记步骤 |
| 2.2.1.8 标记探针的敏感性检测 |
| 2.2.1.9 标记探针的特异性检测 |
| 2.2.2 样品检测 |
| 2.2.2.1 样品组织DNA 的提取及定量 |
| 2.2.2.2 样品组织总RNA 的提取及定量 |
| 2.2.2.3 样品斑点杂交 |
| 2.2.3 NDV 的分离、鉴定及致病性研究 |
| 2.2.3.1 病毒分离与鉴定 |
| 2.2.3.2 鸡胚半数致死量测定 |
| 2.2.3.3 动物回归试验 |
| 2.2.3.4 病毒生物学毒力测定 |
| 2.2.3.5 NDV 分离株F 基因RT-PCR 扩增及序列测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 核酸探针标记结果 |
| 3.1.1 目的片段的PCR 或RT-PCR 扩增结果 |
| 3.1.2 目的片段酶切结果 |
| 3.1.3 PCR 和RT-PCR 扩增产物的序列测定结果 |
| 3.1.4 核酸探针的敏感性试验结果 |
| 3.1.5 核酸探针的特异性试验结果 |
| 3.2 样品斑点杂交结果 |
| 3.2.1 商品肉鸡肺脏中呼吸道病原体的斑点杂交检测结果 |
| 3.2.1.1 肉鸡肺脏样品中禽流感H9N2 亚型、NDV、IBV、aMPV、MG、ORT 和E. coli的斑点杂交检测结果 |
| 3.2.1.2 商品肉鸡肺脏中七种病原共感染的检测结果 |
| 3.2.2 死亡鸡胚内脏中H9N2-AIV、NDV、IBV、aMPV、MG、ORT 和E. coli 的检测结果 |
| 3.2.2.1 死亡鸡胚内脏中H9N2-AIV、NDV、IBV、aMPV、MG、ORT 和E. coli 的斑点杂交结果 |
| 3.2.2.2 死亡鸡胚内脏中七种病原共感染的检测结果 |
| 3.3 NDV 的分离、鉴定及致病性研究结果 |
| 3.3.1 病毒分离、增殖与鉴定 |
| 3.3.2 鸡胚半数致死量测定 |
| 3.3.3 动物回归试验 |
| 3.3.4 生物学毒力指标测定结果 |
| 3.3.4.1 鸡胚最小致死量平均死亡时间(MDT)测定结果 |
| 3.3.4.2 1 日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)测定结果 |
| 3.3.4.3 6 周龄鸡静脉内接种致病指数(IVPI)测定结果 |
| 3.3.5 F 基因RT-PCR 扩增、克隆与鉴定 |
| 3.3.6 PCR 产物序列分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 核酸探针的标记 |
| 4.2 样品检测结果分析 |
| 4.2.1 商品肉鸡肺脏样品中 H9N2、NDV、IBV、aMPV、MG、ORT 和 E. coli 的检测结果分析 |
| 4.2.2 死亡鸡胚内脏样品中 H9N2、NDV、IBV、aMPV、MG、ORT 和 E. coli 的检测结果分析 |
| 4.3 NDV 分离毒株的鉴定及致病性结果分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
四、用地高辛标记的核酸探针从尿囊液和组织中检测传染性支气管炎病毒（论文参考文献）
- [1]IBV S蛋白抗原表位鉴定及与宿主细胞互作的研究[D]. 武奇. 扬州大学, 2021
- [2]江苏地区小鹅瘟流行病学调查及其细胞适应毒研究[D]. 姜煜晨. 扬州大学, 2021
- [3]一株鸡源呼肠孤病毒的分离鉴定及竞争ELISA检测方法的建立[D]. 周雨洁. 山东农业大学, 2021(01)
- [4]禽偏肺病毒四重实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用[D]. 姜楠. 延边大学, 2020(05)
- [5]抗H株小鹅瘟病毒卵黄抗体的研制与质量评估[D]. 胡瑞鸿. 东北农业大学, 2020(07)
- [6]aMPV、IBV、NDV三重RT-PCR以及aMPV N蛋白的表达和间接ELISA方法的建立与应用[D]. 陈基明. 广西大学, 2020(02)
- [7]鹅源减蛋综合征病毒的分离鉴定及其基因组的进化分析[D]. 张琪. 东北农业大学, 2020(04)
- [8]鸡传染性支气管炎病毒实验室检测方法研究进展[J]. 庄金秋,阮震,张颖,梅建国,苗立中. 家禽科学, 2018(07)
- [9]坦布苏病毒的分离鉴定及荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用[D]. 于春梅. 山东农业大学, 2013(05)
- [10]商品肉鸡呼吸道病原体共感染的检测[D]. 孙静. 山东农业大学, 2011(08)