一、星形胶质细胞凋亡途径的研究进展（论文文献综述）
魏延虎[1]（2021）在《COL6A1通过PI3K/Akt通路对大鼠原代脊髓星形胶质细胞氧糖剥夺/复氧复糖后自噬的影响》文中研究表明目的:构建脊髓星形胶质细胞（astrocytes,ASTs）氧糖剥夺/复氧复糖（Oxygen-glucose deprivation/restoration,OGD/R）模型,观察Ⅵ型胶原蛋白A1（ⅥCollagen,COL6A1）在脊髓星形胶质细胞OGD/R后的表达变化及对自噬的影响,进一步探讨敲低COL6A1对大鼠脊髓星形胶质细胞OGD/R损伤后自噬的调节作用及机制。方法:提取培养新生SD大鼠（1-3 d）脊髓星形胶质细胞,免疫荧光染色鉴定其纯度;构建脊髓星形胶质细胞OGD/R模型;RT-qPCR检测COL6A1 m RNA的差异性表达;通过shRNA敲低实验,检测转染shRNA-COL6A1后COL6A1 m RNA的表达水平。实验分为6组:正常对照（Control）组:大鼠脊髓星形胶质细胞正常培养,不予特殊处理;氧糖剥夺/复氧复糖（OGD/R）组:大鼠脊髓星形胶质细胞氧糖剥夺6 h,复氧复糖24 h;OGD/R+shRNA-NC（sh-NC）组:在OGD/R组基础上,转染慢病毒对照;OGD/R+shRNA-COL6A1（sh-COL6A1）组:在OGD/R组基础上,转染慢病毒;OGD/R+shRNA-COL6A1+PI3K抑制剂（LY294002）（sh-COL6A1+LY294002）组:在sh-COL6A1组基础上,加入LY294002共同培养;OGD/R+shRNA-COL6A1+自噬抑制剂（3-MA）（sh-COL6A1+3-MA）组:在sh-COL6A1组基础上,加入3-MA共同培养。CCK-8检测敲低COL6A1对OGD/R后脊髓星形胶质细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测敲低COL6A1对OGD/R后脊髓星形胶质细胞凋亡的影响;透射电镜观察敲低COL6A1脊髓星形胶质细胞OGD/R后自噬小体的变化;RT-qPCR检测敲低COL6A1对脊髓星形胶质细胞OGD/R后自噬相关因子表达的影响;Western blot检测敲低COL6A1对脊髓星形胶质细胞OGD/R后自噬和PI3K/Akt通路相关蛋白表达的影响。结果:1.RT-qPCR结果表明,与正常对照组相比,脊髓星形胶质细胞OGD/R后COL6A1 m RNA表达水平显着提高;敲低COL6A1后,与sh-NC组相比,COL6A1m RNA表达水平明显下降;2.CCK-8实验结果显示,与Control组相比,OGD/R组细胞增殖在72 h内受到明显抑制;与OGD/R组相比,sh-COL6A1组细胞增殖能力在72 h内显着增强;3.流式细胞术结果显示,与Control组相比,OGD/R组细胞凋亡比例显着升高;与OGD/R组相比,sh-COL6A1组细胞凋亡比例明显降低;而加入PI3K抑制剂LY294002和自噬抑制剂3-MA后,细胞凋亡又有所增加;4.透射电镜结果显示,OGD/R组可见少量自噬小体,sh-COL6A1组自噬小体显着增多,而应用PI3K抑制剂LY294002和自噬抑制剂3-MA后自噬小体又减少;5.RT-qPCR结果显示,与Control组相比,OGD/R组中Beclin-1 m RNA、LC3m RNA表达水平上升;敲低COL6A1后Beclin-1 m RNA、LC3 m RNA表达水平进一步上升,而PI3K抑制剂LY294002和自噬抑制剂3-MA抑制了shRNA-COL6A1的作用。6.Western blot检测显示,敲低COL6A1后Beclin-1蛋白表达水平和LC3Ⅱ/Ⅰ比值上升,PI3K抑制剂LY294002和自噬抑制剂3-MA抑制了shRNA-COL6A1的作用。敲低COL6A1后p-PI3K、p-Akt的蛋白表达水平显着升高,应用PI3K抑制剂LY294002和自噬抑制剂3-MA后降低。结论:1.脊髓星形胶质细胞OGD/R后,COL6A1表达增高,细胞凋亡增加;2.敲低COL6A1可以激活OGD/R后大鼠脊髓星形胶质细胞的自噬程度,提高细胞的活力,降低细胞凋亡;3.敲低COL6A1可能通过激活PI3K/Akt信号通路激活自噬减轻大鼠脊髓星形胶质细胞OGD/R损伤。因此,本研究有望在应激状态下通过降低COL6A1,促使自噬小体形成改善细胞生存环境,对SCI治疗有重要的指导意义。
高强[2]（2021）在《星蒌承气汤治疗急性缺血性卒中痰热腑实证机制研究》文中研究指明急性缺血性脑卒中（Acute Ischemic Stroke,AIS）,即急性脑梗死,中医称缺血性中风,是脑组织因局部的血流循环障碍缺血、缺氧而发生的软化、坏死。目前溶栓是治疗缺血性卒中急性期最快、最有效的方法,但由于适应证严格、时间窗短、出血和再灌注损伤风险高,其临床效果受到限制。基础与临床研究证实,中医药治疗中风独具优势。中医认为痰热腑实证是缺血性中风急性期最为常见的证型,而化痰通腑法代表方星蒌承气汤是治疗中风急性期痰热腑实证的代表性方剂。星蒌承气汤“脑病治肠”、“上病治下”的中医理论与现代医学提出的“菌-肠-脑轴”具有异曲同工之妙。诸多临床试验及系统性综述已证实星蒌承气汤治疗缺血性卒中的确切临床疗效与神经保护作用,但是其效应机制研究尚且不足。因此本文基于网络药理学及肠道微生态理论,深入探讨缺血性中风的肠道微生态机制及化痰通腑法代表方星蒌承气汤治疗中风痰热腑实证的效应机理。目的:基于中医“上病治下”理论与现代医学“菌-肠-脑轴”理论,（1）通过中药网络药理学与分子对接技术全面探讨星蒌承气汤治疗缺血性卒中的多组分、多靶点、多通路机制;（2）明确具有“化痰通腑”作用的星蒌承气汤对急性缺血性中风痰热腑实证小鼠模型的神经保护作用,并验证网络药理学研究的关键靶点与通路;（3）探讨星蒌承气汤对急性缺血性中风痰热腑实证小鼠模型肠道菌群的影响,探讨其治疗中风痰热腑实证“通腑”与“通便”差异的肠道微生态机制;（4）观察星蒌承气汤对伪无菌小鼠急性缺血性中风模型菌-肠-脑轴的影响,验证星蒌承气汤通过直接影响肠道菌群而改善脑卒中预后的假说。方法:（1）借助TCMSP、BATMAN-TCM、ETCM及TCMID等数据库收集星蒌承气汤活性成分及作用靶点,并应用STITCH等对未找到靶点的化合物进行靶点预测。通过6个数据库挖掘缺血性卒中的靶点。通过GO和KEGG富集对交集靶点进行高级功能分析,并用cytoscape3.6.0构建PPI、化合物-靶点及药物-靶点-通路网络。最后进行分子对接验证。（2）雄性C57BL/6小鼠随机分为:假手术（Sham）组、模型（MCAO）组、星蒌承气汤（XCD）组、尼莫地平（Nim）组及舒泰清（PGE）组,通过制备高脂低纤维饮食复合线栓法的小鼠急性缺血性中风痰热腑实证模型,采用神经功能评分、除胶实验、TTC和TUNNEL染色,综合评价星蒌承气汤的神经保护作用,并运用ELISA、W estern blot等技术验证网药关键靶点与通路;（3）雄性C57BL/6小鼠随机分为:Sham组、MCAO组、XCD组、Nim组与PG E组,通过制备高脂低纤维饮食复合线栓法的小鼠急性缺血性中风痰热腑实证模型,采用高通量16srDNA基因测序、代谢组学技术、免疫组化、免疫荧光、ELISA及流式多因子技术分别对肠道菌群、短链脂肪酸（SCFAs）及其受体GPR43、神经-内分泌-免疫途径相关指标（NE及TH、血清MTL、脑IBA-1及GFAP、血清炎症因子）进行分析;（4）雄性C57BL/6小鼠在术前14天服用多种抗生素剔除肠道菌群后,随机分为:伪无菌假手术（ABX-Sham）组、伪无菌模型（ABX-MCAO）组以及伪无菌中药（ABX-XCD）组,通过神经功能评分、除胶实验、TTC染色以及高通量16srDNA基因测序、代谢组学技术、免疫组化、免疫荧光、ELISA及流式多因子技术,观察中药对伪无菌小鼠菌-肠-脑轴相关指标的影响。结果:（1）网络药理学及分子对接结果表明,星蒌承气汤包含51个活性成分及44个治疗缺血性卒中的交集靶点。高级功能分析显示星蒌承气汤抗缺血性卒中的机制与脂多糖介导的信号通路、凋亡过程的调控、炎症反应、内皮屏障的建立以及对脂肪酸的反应有关。星蒌承气汤发挥作用的有10条关键KEGG信号通路。PPI网络分析得到AKT 1,PTGS2,TNF,TP53,CASP3,IL1B等关键靶点。分子对接验证了星蒌承气汤活性成分与关键靶点具有良好的对接能力。（2）星蒌承气汤神经保护作用及对网络药理学关键靶点及通路的影响:①神经功能评分:与MCAO组相比,XCD组及Nim组术后48h及72h Longa评分降低（P<0.05）,PGE组未见变化（P>0.05）。②除胶实验:XCD组和Nim组术后48和72h的接触和去除胶带时间缩短（P<0.05）,PGE组未见变化（P>0.05）。③TTC染色:XCD组梗死面积下降（P<0.05）,Nim组及PGE组未见变化。④TUNNEL:MCAO组梗死区细胞凋亡明显增加,XCD组和Nim组TUNEL阳性染色减少（P<0.05）。⑤网络药理学验证:XCD组及Nim组TNF-α含量具有下降趋势（P>0.05）;XCD组p-AKT、PI3K及NF-κB蛋白表达具有升高趋势。AKT蛋白表达组间未见明显变化（P>0.05）。（3）星蒌承气汤对中风急性期痰热腑实证小鼠菌-肠-脑轴影响:①肠道菌群:与MCAO组相比,XCD组α多样性有升高趋势,Nim组及PGE组无显着变化。β多样性显示MCAO组与Sham组PCoA曲线有显着差异（P<0.05）。MCAO组拟杆与变形杆菌门显着增加,厚壁菌门显着减少;XCD组拟杆菌比例显着降低,疣微菌门显着增加,Nim组变形菌门显着增加,厚壁菌门进一步降低,PGE组菌群组成与MCAO相似,变形杆菌略降低。此外,XCD组Akkermansia比率增加,Nim组Klebsiella增加最为显着,而 PGE 组 Parabacteroides 和Escherichia/Shigella增加较为显着。②SCFAs 及GPR43:MCAO组的SCFAs含量显着降低（P<0.05）,XCD组丁酸含量增加（P<0.05）。XCD组及Nim组GPR43表达显着降低（P<0.05）。③自主神经途径:XCD组NE有下降趋势,PGE组NE有上升趋势（P>0.05）。MCAO组及PGE组TH蛋白表达上升（P<0.05）,XCD组及Nim组TH表达未见显着变化趋势（P>0.05）。④神经内分泌途径:MCAO组MTL显着升高（P<0.05）,PGE组有升高趋势（P>0.05）,XCD组及Nim组MTL显着下降（P<0.05）。⑤免疫途径:MCAO组星形胶质细胞增生、肥大,显着活化,小胶质细胞迅速从“静息态”转变为“激活态”,从梗死周边区域向病变部位募集,而XCD组星形胶质细胞及小胶质细胞活化较MCAO组降低。MCAO 组 TNF-α、IL-17A、IL-22 升高（P<0.05）,而 XCD 和 Nim 组的 IL-10显着升高（P<0.05）,TNF-α、IL-17A 和 IL-22 降低。（4）星蒌承气汤对中风急性期痰热腑实证伪无菌小鼠菌-肠-脑轴影响:①神经保护作用:与ABX-MCAO组相比,ABX-XCD组在Longa评分、除胶实验及TTC染色等方面未见显着变化（P>0.05）。②肠道菌群:ABX-MCAO和ABX-XCD组的α多样性低于ABX-Sham,PCoA分析显示ABX-XCD组肠道菌群的β多样性和组成与AB X-MCAO组相似。相对丰度结果显示,在ABX组中,小鼠的微生物区系均以变形杆菌为特征,这与正常小鼠有显着差异。LEfSe分析显示MCAO组富集了更多的病原体或机会性病原体,包括Bacteroidetes,EscherichiaShigella与Helicobacter,而 XCD富集了Verrucomicrobia和Akkermansia等有益菌群。条件致病菌如Streptococcus,Lact ococcus,Morganella,Klebsiella,Proteobacteria,Enterobacteriaceae 等在 ABX-XCD组富集显着增多。PGE组富集菌群主要有oSelenomonadales、cNegativicutes、gRomboutsia及fPeptostreptococcaceae。③SCFAs 及 GPR43:ABX-XCD 的丙酸显着下降（P<0.05）。ABX-MCAO 组 GPR43 表达显着上调（P<0.05）,ABX-XCD 组 G PR43表达显着降低（P<0.05）。④自主神经途径:ABX-XCD组NE含量未见显着变化（P>0.05）,TH蛋白表达未见显着变化（P>0.05）。⑤神经内分泌途径:ABX-MCAO组MTL升高趋势（P>0.05）,ABX-XCD组MTL未见显着变化（P>0.05）。⑥免疫途径:ABX-XCD组IL-22显着升高（P<0.05）,IL-17A有降低趋势（P>0.05）,余未见显着变化趋势（P>0.05）。ABX-MCAO组星形胶质细胞表达显着升高,小胶质细胞显着活化,ABX-XCD组星形胶质细胞及小胶质细胞活化较ABX-MCAO组有降低趋势。结论:星蒌承气汤对急性缺血性中风痰热腑实证小鼠具有一定神经保护作用,其效应机制具有多成分、多靶点、多通路特点。其对伪无菌小鼠中风模型则未发现确切的脑保护效应,说明其脑保护的部分机制是通过改善肠道微生态实现的。其具体机制包括提高肠道短链脂肪酸,尤其是丁酸含量,增强肠道短链脂肪酸受体GPR43表达,增加血液IL10、减少TNF-α等炎性因子及MTL水平,最终减少梗死区域胶质细胞活化和神经细胞凋亡,从而达到中风脑保护的作用。本研究成果对中风病的临床治疗具有重要的指导意义——对于中风后便秘患者,仅仅“通便”治疗是不够的,需要结合患者的证候特点进行中医药“化痰通腑”治疗,才能取得好的临床效果。
朱晓婷[3]（2021）在《解毒益智方对阿尔茨海默病双转基因小鼠行为学及大脑皮层内β-淀粉样蛋白沉积及BACE1表达影响的研究》文中研究说明选题依据:阿尔茨海默病（AD）致残、致死率高,发病机制复杂,大脑内Aβ异常沉积是AD发生发展的重要病理变化及核心环节,前期研究已证实了解毒益智方具有抑制AD线虫头部Aβ斑块沉积及相关基因表达的作用,随之开展的随机对照临床研究证实解毒益智方应用6个月后MMSE、MoCA、ADL评分变化明显优于口服尼莫地平片的对照组。黄连为解毒益智方中的君药,为该方的主要成分,在本方中发挥“解毒”的重要功效。经查阅国内外文献发现黄连中发挥“解毒”作用的主要物质为黄连多糖（CCP）,因此设计体外细胞实验探究解毒益智方中的君药黄连的主要有效成分CCP对Aβ25-35损伤PC12的保护作用,为“毒损”的病机及“解毒”的治法提供理论依据,为后续研究提供研究基础。因前期开展的研究均是以单基因单细胞的生物为研究对象,不能很好地模拟AD的疾病特点,因此选用APP/PS1双转基因小鼠作为研究对象,该小鼠很好的模拟了中枢神经系统Aβ异常沉积的状态,通过对小鼠的行为学研究及分子生物学研究,进一步评价解毒益智方的治疗作用。目的:通过体外细胞实验探讨基于“补肾益髓、活血化痰解毒”法形成的解毒益智方其中君药的有效成分CCP对Aβ25-35损伤PC12的保护作用。通过行为学、分子生物学等研究手段,对APP/PS1小鼠的认知功能、Aβ沉积、BACE1表达的相关蛋白、基因等方面进行检测和分析,探讨解毒益智方对APP/PS1小鼠的作用机制,为中药治疗AD的推广应用提供可靠的研究证据。方法:1.本研究分别从体外实验、动物实验探究解毒益智方的作用机制。体外实验部分采用MTT还原法、Hoechst33258荧光染色等方法对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤模型进行线粒体活性、细胞活力、细胞凋亡的测定,探究CCP对PC12细胞的保护作用。动物实验部分选用APP/PS1双转基因小鼠为研究对象,随机分为5组,分别是模型组（APP/PS1组）、盐酸多奈哌齐组（Donepezil组）、解毒益智方低剂量组（JDYZFL组）、解毒益智方中剂量组（JDYZFM组）、解毒益智方高剂量组（JDYZFH组）,每组16只小鼠,另选用16只C57小鼠作为正常对照组（Control组）,于每日早晨8:30进行灌胃治疗,各组每日灌胃药物及剂量分别是,正常组和模型组0.5%CMC溶液0.20g·kg-1·d-1;阳性对照组:盐酸多奈哌齐溶液0.30g·kg-1·d-1;解毒益智方高、中、低剂量组药物浓度依次为0.60g·kg-1·d-1,0.3g·kg-1·d-1,0.15g·kg-1·d-1。持续6个月治疗结束。2.以Aβ25-35损伤的PC12细胞为研究对象,通过测定细胞活力、LDH释放率、细胞凋亡率、和线粒体膜电位的水平等评价CCP的神经保护作用。3.通过水迷宫实验,记录解毒益智方对APP/PS1小鼠学习记忆能力的影响。4.通过ELISE及免疫荧光法检测APP/PS1小鼠脑内Aβ水平的变化,观察解毒益智方对APP/PS1小鼠脑内Aβ沉积的影响。5.采用PCR方法检测脑组织SIRT1、NF-κB、BACE1基因量变化,并进一步采用Western blot方法检测大脑皮层内SIRT1、BACE1、NF-κB蛋白的变化,观察解毒益智方对APP/PS1小鼠脑内AMPK/SIRT1-PPARγ-PGC1α-BACE1转运蛋白通路SIRT1、BACE1、NF-κB的影响。结果:1.通过体外研究观察CCP对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤的影响PC12细胞活力测定结果显示:PC12细胞经过浓度为5-50μM的Aβ25–35处理24h后,细胞活力随着Aβ25–35浓度的增加从24%下降至61%。当Aβ25–35在浓度范围为5至50μM时引起PC12细胞中LDH释放增加至对照组的约130-160%。在用不同浓度的CCP（5至200μg/ml）处理PC12细胞24h后,未观察到显着的细胞损失。通过Hoechst33258染色及FCM测定细胞凋亡结果显示:细胞核在荧光显微镜下具有显着的浓缩核和凋亡的细胞形成。与在未处理的PC12细胞中观察到的完整,圆形和相对大的细胞核相比,暴露于50μMAβ25–35 24h的细胞显示出典型的细胞凋亡特征,包括染色质浓缩,核碎裂和凋亡小体的出现。用CCP不同浓度（5,25,50,100,200μg/ml）处理后可有效逆转细胞凋亡,其中100μg/ml效果最明显,FCM分析显示单独暴露于50μMAβ25–35 24h导致58.88±6.12%的凋亡率,这与正常对照组中的7.21±0.82%的值显着不同（P<0.01）。加入100μg/ml的CCP后,细胞凋亡下降至12.51±1.32%。通过JC-1红色荧光与JC-1绿色荧光的比率的变化来检测Aβ诱导的线粒体功能障碍结果显示:当PC12细胞暴露于50μM的Aβ25–35中24h后,与正常对照组相比,显着减弱了JC-1的红色荧光比例,提高了JC-1绿色荧光比例（P<0.01）。用CCP（100μg/ml）预处理Aβ25–35处理的PC12细胞显着抵消了Aβ25–35损伤引起的膜电位损失,JC-1从Aβ25–35处理的PC12细胞中的22.1%变为绿色荧光至84.3%,与正常对照组相近（P>0.05）。通过蛋白质印迹法检测细胞色素C结果显示:经50μMAβ25–35处理PC12细胞24h后细胞色素C在细胞质中的蛋白质表达增加,而预先用CCP（100μg/ml）处理的PC12细胞显着减弱线粒体释放的胞质细胞色素C。2.观察JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力的影响。水迷宫实验结果显示:随着实验天数的后移,各组小鼠潜伏期、路径长度、游泳距离均有所缩短,表明随着训练次数的增加各组小鼠对象限平台的定位记忆能力随之有所提升。与Control组相比,APP/PS1组逃避潜伏期、路径长度、游泳距离均明显延长,差异显着（P<0.01）。首次到达平台的时间明显延长,目标停留次数明显减少,差异显着（P<0.01）。与APP/PS1组相比,Donepezil组、JDYZFL组、JDYZFM组逃避潜伏期、路径长度、游泳距离有所缩短,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。首次到达平台的时间缩短,目标停留次数增多,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。与Donepezil组相比,JDYZFL组作用与其相当,JDYZFM组略优于Donepezil组,差异有统计学意义（P<0.05）。干预治疗6个月的12月龄小鼠的定位航行实验及空间搜索实验结果优于干预治疗3个月的9月龄小鼠,差异有统计学意义（P<0.05）。3.观察JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠脑内Aβ沉积的影响。各组小鼠结果如下:与Control组比较,APP/PS1组大脑皮层内可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42沉积极数量明显增多,具有极显着统计学意义（P<0.01）。与APP/PS1组相比,JDYZFL组、JDYZFM组及Donepezil组大脑皮层内可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42沉积数量不同程度降低,具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。与Donepezil组比较,JDYZFM组大脑皮层内可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42沉积数量有所降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。通过免疫荧光法测得小鼠大脑皮层内Aβ表达发现,Control组只产生微量Aβ,而APP/PS1组Aβ表达量明显增高,经过用药干预后,12月龄干预组小鼠可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42沉积数量较9月龄小鼠明显减少,免疫荧光标记从宏观上可以发现干预组Aβ沉积明显减少,APP/PS1组Aβ沉积明显增多。4.调控BACE1表达的相关因子结果（1）PCR检测结果各组小鼠进行的PCR检测结果显示:与Control组相比,APP/PS1组小鼠大脑皮层内BACE1/GAPDH、NF-κB/GAPDH表达含量明显增高,SIRT1/GAPDH明显降低,差异有显着统计学意义(（P<0.01）。与APP/PS1组相比,Donepezil组、JDYZFL组及JDYZFM组小鼠海马体内BACE1/GAPDH、NF-κB/GAPDH表达含量不同程度降低,SIRT1/GAPDH表达含量不同程度增高,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。JDYZFH组在NF-κB/GAPDH表达上无统计学差异。与Donepezil组相比,JDYZFL组及JDYZFM组BACE1/GAPDH、NF-κB/GAPDH表达含量不同程度降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。PCR结果证实药物干预组可通过提高SIRT1mRNA的含量降低NF-κBmRNA、BACE1mRNA的表达,从而抑制Aβ的产生而起到神经保护的作用。各治疗组大脑皮层Aβ的表达均有所降低。连续灌胃6个月的各组小鼠与连续灌胃3个月的小鼠相比,除APP/PS1组及Control组,其他各组SIRT1mRNA的表达均有所提高,NF-κBmRNA、BACE1mRNA的表达均有所降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）Westorn blot检测结果各组小鼠的Western blot检测结果显示:与Control组相比,APP/PS1组小鼠大脑皮层SIRT1的蛋白表达明显降低,NF-κB、BACE1蛋白表达显着升高（P<0.01）。与APP/PS1相比,Donepezil组、JDYZFL组、JDYZFM组BACE1、NF-κB表达降低,SIRT1蛋白表达增高差异有统计学意义（P<0.05）。与Donepezil比较,JDYZFL组、JDYZFM组NF-κB蛋白表达有所降低,差异有统计学意义（P<0.05）。JDYZFL组SIRT1、BACE1蛋白表达无显着差异,JDYZFM组SIRT1表达有所提高,BACE1蛋白表达量略有降低,差异有统计学意义（P<0.05）。经过为期3个月及6个月的干预后,各治疗组大脑皮层Aβ的表达均有所降低。连续灌胃6个月的各组小鼠与连续灌胃3个月的小鼠相比,除APP/PS1组及Control组,其他各组SIRT1的蛋白表达均有所提高,NF-κB、BACE1蛋白的表达均有所降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1 CCP能够保护Aβ25-35损伤的PC12细胞,其机制可能与提高细胞活力、抑制细胞凋亡、减少LDH释放、阻断膜电位的丧失,并阻止线粒体细胞色素C释放,修复线粒体功能障碍有关。2 JDYZF各剂量组可不同程度提高APP/PS1双转基因小鼠定位航行实验及空间搜索实验的成绩,说明JDYZF可改善小鼠空间学习及记忆能力。3 JDYZF可不同程度降低APP/PS1双转基因小鼠大脑皮层内Aβ的异常沉积。4 JDYZF抑制BACE1的异常表达,其作用机制可能是通过调控大脑内AMPK/SIRT1-PPARγ-PGC1α-BACE1信号通路的相关因子表达实现的。
杜欣[4]（2021）在《牛黄及其有效成分对神经血管单元的保护作用研究》文中研究指明目的:观察牛黄及其有效成分对体外脑神经血管单元的保护作用,阐明牛黄及其有效成分治疗缺血性中风的内在生物学机制。方法:1.体外脑神经血管单元模型的建立以及缺氧/复氧模型的建立（1）利用体外原代细胞培养技术,提取大脑皮质神经元、星形胶质细胞和微血管内皮细胞,进行细胞鉴定;（2）利用transwell板将三种细胞共培养,构建体外脑神经血管单元的模型,利用TEER值,判定模型是否成功;（3）采用缺氧1h,复氧24h,构建OGD/R模型,利用TEER值、荧光素钠渗透系数判定模型是否成功。2.牛黄及其有效成分对三种细胞的毒性利用不同浓度的牛黄（Bezoar）、牛磺酸（Taurine）、牛黄熊去氧胆酸（TUDCA）和熊去氧胆酸（UDCA）,作用于神经元、星形胶质细胞和内皮细胞,分别干预24h和48 h,利用CCK8检测细胞活力,检测每种不同浓度的药物对细胞的毒性。3.牛黄及其有效成分对脑神经血管单元的保护作用（1）通过OGD/R模型,检测牛黄、牛磺酸、TUDCA和UDCA的不同剂量对细胞的作用,利用CCK8法检测细胞活力,确定每种药物的最佳剂量;（2）利用药物的最佳剂量进行干预,通过检测血脑屏障的通透性:TEER值、荧光素钠渗透系数和γ-GT;炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β;氧化应激指标SOD、NO、MDA以及神经元凋亡率。（3）牛黄对脑神经血管单元的保护机制研究加入抑制剂LY294002,检测牛黄对细胞的干预是通过PI3K/AKT通路实现的;检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3,金属蛋白酶MMP2、MMP9,紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5 以及 HIF-1α、VEGF、PI3K、AKT、p-AKT。4.不同配伍组分对脑神经血管单元的保护作用（1）利用OGD/R模型,筛选牛磺酸+牛磺熊去氧胆酸（T+T）,牛磺酸+熊去氧胆酸（T+U）的最佳剂量;（2）利用药物的最佳剂量进行干预,通过检测血脑屏障的通透性:TEER值、荧光素钠渗透系数和γ-GT;炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β;氧化应激指标SOD、NO、MDA以及神经元凋亡率。5.配伍组分牛磺酸和熊去氧胆酸对脑神经血管单元的作用机制利用T+U的最佳剂量,进行OGD/R的造模,检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3,金属蛋白酶 MMP2、MMP9,紧密连接蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 以及 NF-κBp65,p-P65,IKBα,p-IKBα 蛋白表达。6.配伍组分牛磺酸和牛磺熊去氧胆酸对脑神经血管单元的作用机制利用T+T的最佳剂量,进行OGD/R的造模,检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3,金属蛋白酶MMP2、MMP9,紧密连接蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5,CA43、AQP4以及 P38MAPK,P-P38MAPK。结果1.获得了纯度较高的神经元、星形胶质细胞和内皮细胞（1）神经元培养7d后成熟,经MAP2免疫荧光鉴定,纯度大于95%;（2）星形胶质细胞培养7d后成熟,经GFAP免疫荧光鉴定,纯度大于95%;（3）内皮细胞培养7d后成熟,经Ⅷ因子免疫荧光鉴定,纯度大于95%。2.利用transwell,建立了脑神经血管单元的模型（1）该模型的电阻值在3-5天趋于平稳;（2）三细胞共培养,三种细胞的状态和单细胞相比,更佳。3.成功复制OGD/R模型利用缺氧1h,复氧24h,能够成功复制OGD/R模型,和正常组相比,模型组电阻值降低,荧光素钠渗透系数升高,能够进行下一步的实验研究。4.筛选药物毒性利用不用浓度的牛黄、牛磺酸、牛磺熊去氧胆酸和熊去氧胆酸分别干预24h和48h,筛选药物的毒性。5.筛选药物的保护剂量利用无毒性的各种药物浓度,通过OGD/R造模方法,检测细胞活力,筛选出保护作用的最佳剂量。6.牛黄及其有效成分对体外脑神经血管单元的保护作用（1）牛黄及其有效成分降低LDH,升高γ-GT,提高TEER值和降低荧光素钠渗透系数;（2）牛黄及其有效成分减少炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1 β的水平;（3）牛黄及其有效成分降低NO、MDA的水平,升高SOD的水平;（3）牛黄及其有效成分抑制神经元的凋亡;（4）牛黄降低MMP2、MMP9的蛋白表达;（5）牛黄能升高紧密连接蛋白的表达,提高ZO-1、Occludin、Claudin-5的蛋白表达;（6）牛黄通过HIF-α/VEGF,PI3K/AKT通路,发挥保护NVU的作用,牛黄降低HIF-1α、VEGF的蛋白表达水平,升高PI3K、AKT的蛋白表达水平。7.不同配伍组分对脑神经血管单元的保护作用（1）筛选了配伍组分的最佳剂量,T+T的最佳剂量1mM Taurine和1μM TUDCA,T+U的最佳剂量1mM Taurine和1μM UDCA;（2）T+T、T+U有效保护血脑屏障,降低TEER值,降低荧光素钠渗透系数,升高γ-GT;（3）T+T、T+U有效减轻细胞损伤,降低LDH的水平;（4）T+T、T+U有效减轻炎症反正,降低TNF-α、IL-6、IL-1β的值;（5）T+T、T+U有效抑制氧化反应,降低NO、MDA的水平,升高SOD的活力;（6）T+T、T+U抑制神经元的凋亡率。8.配伍组分牛磺酸和熊去氧胆酸对脑神经血管单元的作用机制（1）T+U抑制神经元的凋亡率;（2）T+U 提高 ZO-1、Occludin、Claudin-5 的蛋白表达;（3）T+U降低MMP2、MMP9的蛋白表达;（4）T+U降低Bax、Caspase-3蛋白表达,升高Bcl-2蛋白表达;（5）T+U降低MyD88、P-P65、P-IKB α的蛋白表达,通过MyD88/NF-κB信号通路发挥脑保护作用。9.配伍组分牛磺酸和牛黄熊去氧胆酸对脑神经血管单元的作用机制（1）T+T抑制神经元的凋亡率;（2）T+T 提高 ZO-1、Occludin、Claudin-5 的蛋白表达;（3）T+T降低MMP2、MMP9的蛋白表达;（4）T+T降低Bax、Caspase-3蛋白表达,升高Bcl-2蛋白表达;（5）T+U降低AQP4、P38MAPK,升高CX43的蛋白表达。结论（1）牛黄、牛磺酸、TUDCA和UDCA能够减轻炎症反应,降低氧化应激的水平,抑制神经元的凋亡发挥神经保护的作用;（2）牛黄通过HIF-1α/VEGF和PI3K/AKT通路发挥脑保护作用;（3）牛磺酸和牛磺熊去氧胆酸,牛磺酸和熊去氧胆酸配伍,发挥协同作用,比单独使用牛磺酸药效更好;（4）牛磺酸和熊去氧胆酸1000:1的配伍能够抑制炎症反应,降低氧化应激的水平,保护血脑屏障,抑制神经元的凋亡,能够抑制通路MyD88/NF-κB通路发挥脑保护作用（5）牛磺酸和牛磺熊去氧胆酸1000:1的配伍能够抑制炎症反应,降低氧化应激,保护血脑屏障,能够抑制P38MAPK通路,发挥脑保护作用;
欧阳波[5]（2021）在《冰片配伍黄芪甲苷和三七总皂苷对脑缺血/再灌注损伤后神经血管单元保护作用的研究》文中研究说明目的:研究冰片配伍黄芪甲苷（Astragaloside Ⅳ,AST Ⅳ）和三七总皂苷（Panax notoginseng saponins,PNS）对大鼠脑缺血/再灌注损伤（Cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI）后脑组织损伤、神经血管单元主要组分（神经元、星形胶质细胞和微血管）的结构、主要组分特异蛋白--胶质纤维酸性蛋白（Glialfibrillary acidic protein,GFAP）、神经元特异性核蛋白（Neuron specific nuclear,Neu N）、层黏连蛋白（Laminin,LN）、内皮屏障抗原蛋白（Endothelial barrier antigen,EBA）及相关功能蛋白--αII-血影蛋白（αII-Spectrin,αII-SP）、水通道蛋白4（Aquaporin 4,AQP-4）、基质金属蛋白酶9（Matrix metalloproteinase-9,MMP-9）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）表达的影响,探讨其通过Notch信号通路对神经血管单元的保护机制。方法:成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为假手术组（Sham Operation Group,SOG）、模型组（Model Group,MG）、冰片组（Borneol Group,BG）、AST Ⅳ组（AST Ⅳ Group,AG）、PNS组（PNS Group,PG）、AST Ⅳ+PNS组（AST Ⅳ+PNS Group,APG）、冰片+AST Ⅳ+PNS低剂量组（Borneol+AST Ⅳ+PNS Low-dose Group,LDG）、冰片+AST Ⅳ+PNS高剂量组（Borneol+AST Ⅳ+PNS High-dose Group,HDG）、依达拉奉组（Edaravone Group,EG）。EG腹腔注射给药,其他组灌胃给药,2次/d。采用线栓法阻断右侧大脑中动脉（Middle cerebral artery,MCA）,建立大鼠CIRI模型。缺血2h,再灌注后22h,行神经功能缺损评分,TTC染色测定脑梗死体积,HE染色观察大脑缺血皮质区病理形态;免疫组化法检测大脑缺血皮质区GFAP、Neu N、LN、EBA的表达;免疫荧光三标法检测大脑缺血皮质区GFAP、神经丝蛋白200（neurofilament-200,NF-200）、LN的蛋白表达;Westrn blot检测大脑缺血皮质区αII SP、AQP-4、MMP-9、VEGF、Notch1、Notch胞内域（Intracellular domain of Notch,NICD）、Hes1、Delta-like ligand 4（DLL4）蛋白的表达。结果:缺血2h,再灌注22h后,MG出现神经功能缺损、右侧局灶性脑梗死、神经细胞损伤。各药物组神经功能缺损评分、脑梗死体积和神经细胞损伤率显着降低（P<0.05、0.01）,且冰片+AST Ⅳ+PNS的效应强于各药物单用及AST Ⅳ+PNS（P<0.05、0.01）。缺血2h,再灌注22h后,免疫组化结果显示,MG的Neu N、LN、EBA阳性细胞显着减少（P<0.01）,GFAP阳性细胞显着增加（P<0.01）;冰片、PNS、AST Ⅳ、AST Ⅳ+PNS与冰片+AST Ⅳ+PNS能显着增强Neu N、LN、EBA蛋白表达（P<0.05、0.01）,显着降低GFAP蛋白表达（P<0.05、0.01）,且冰片+AST Ⅳ+PNS的作用强于各药物单用及AST Ⅳ+PNS（P<0.05、0.01）。免疫荧光三标结果显示,MG的NF-200、LN阳性细胞显着减少（P<0.01）,GFAP阳性细胞显着增加（P<0.01）;冰片、AST Ⅳ、PNS、AST Ⅳ+PNS与冰片+AST Ⅳ+PNS能显着降低GFAP蛋白表达（P<0.05、0.01）,且冰片+AST Ⅳ+PNS的作用强于各药物单用及AST Ⅳ+PNS（P<0.05、0.01）。冰片、AST Ⅳ+PNS与冰片+AST Ⅳ+PNS能显着增强LN蛋白表达（P<0.05、0.01）,且冰片+AST Ⅳ+PNS的作用强于各药物单用及AST Ⅳ+PNS（P<0.05、0.01）。冰片+AST Ⅳ+PNS能显着增强NF-200蛋白表达（P<0.01）,且冰片+AST Ⅳ+PNS的作用强于AST Ⅳ+PNS（P<0.05）。Westrn blot结果显示,MG大鼠缺血皮质区AQP-4、MMP-9蛋白表达显着增加（P<0.05）,αII SP蛋白表达水平显着降低（P<0.05）,而VEGF、NICD、Notch1、Hes1、DLL4蛋白表达无显着变化（P>0.05）,冰片+AST Ⅳ+PNS能显着上调αII SP、VEGF、NICD、Notch1、Hes1、DLL4蛋白的表达（P<0.01）,且冰片+AST Ⅳ+PNS的效应强于各药物单用及AST Ⅳ+PNS（P<0.05、0.01）。冰片+AST Ⅳ+PNS能显着下调AQP-4、MMP-9蛋白的表达（P<0.01）,且冰片+AST Ⅳ+PNS的效应强于各药物单用及AST Ⅳ+PNS（P<0.05、0.01）。结论:1.冰片配伍AST Ⅳ和PNS对大鼠CIRI后具有脑保护作用,能改善神经功能缺损、降低神经细胞损伤率、减少脑梗死体积,且冰片+AST Ⅳ+PNS的作用强于各药物单用及AST Ⅳ+PNS。2.冰片配伍AST Ⅳ和PNS对大鼠CIRI后神经血管单元具有保护作用,可减轻神经元和微血管基底膜损伤、抑制星形胶质细胞过度活化、减轻脑水肿,且冰片+AST Ⅳ+PNS的作用强于各药物单用及AST Ⅳ+PNS。维持神经血管单元结构完整性,且冰片+AST Ⅳ+PNS的作用强于AST Ⅳ+PNS。3.冰片配伍AST Ⅳ和PNS对大鼠CIRI后的脑保护作用机制可能与激活Notch信号通路,上调NICD、Notch1、Hes1、VEGF、DLL4表达,从而发挥对缺血脑组织的保护作用有关。
尹赛格[6]（2021）在《活性肽OM-LV20通过色氨酸羟化酶1介导的促脑缺血损伤修复作用和机制研究》文中研究指明[目 的]中风导致严重的神经损伤并造成严峻的社会、经济负担,由于损伤后修复机制的高度复杂性与目前被批准使用的药物极度稀缺,使得新型抗中风药物的发现、新的机制解析及新药物靶标发现具有重要意义。目前,肽类分子已经成为发现与确认新药靶点的有力工具,并且是新药创制先导化合物的重要来源。在基础科学研究、新型生物产业和创新药物研发中具有独特、不可替代的作用。色氨酸羟化酶1（Tryptophan hydroxylase 1,TPH1）参与多种精神、神经等相关疾病进程,但其对中风的作用却未见报道。本研究旨在细胞和动物水平上明确外源性应用OM-LV20对大鼠脑缺血再灌注模型及在对氧化应激下大鼠星形胶质细胞损伤的神经保护作用与机制,并以OM-LV20为分子探针探索内源性TPH1作为抗中风药物靶标的可能性。为后续神经系统疾病,特别是脑缺血再灌注的治疗与预防提供分子生物学依据。[方 法]1)利用HPLC系统检测活性肽OM-LV20在4℃、37℃及血浆中的半衰期。2)以Sprague-Dawley大鼠为研究对象,以腹腔注射的方法连续给药（OM-LV20）7天后建立大鼠脑缺血再灌注（Ischemia/Reperfusion,I/R）模型,即大脑中动脉栓塞2 h/再灌注24 h。通过利用mNSS行为学评分、TTC染色与脑梗死面积量化,初步评估OM-LV20的神经保护作用;利用H&E染色和Nissl染色评估OM-LV20对脑内细胞和神经元形态及存活状态的保护作用。3)OM-LV20对I/R大鼠神经保护机制研究（动物水平）:利用分子对接模拟、高通量胰高血糖素样肽受体1（Glucagon like peptide-1 receptor,GLP-1R）激动实验和转录组学测序分析研究OM-LV20对I/R大鼠的神经保护机制;利用Western蛋白印迹、实时定量聚合酶链反应（Real Time-quantitative Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR）和环磷酸腺苷（cyclic Adenosine monophosphate,cAMP）检测研究OM-LV20是否通过直接激动GLP-1R、激活有丝分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPKs）信号通路与 BDNF/AKT 信号通路和调节垂体腺苷酸环化酶激活肽受体（Type 1 Pityitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide Receptor,PAC1R）、cAMP 及 TPH1 水平对 I/R 大鼠进行神经保护。4)利用大鼠海马区星形胶质细胞的原代培养、大鼠脑组织冰冻切片、免疫荧光三标、qRT-PCR、序列比对与Western免疫印迹研究TPH1在大鼠星形胶质细胞上的表达情况。5)OM-LV20对氧化应激下大鼠星形胶质细胞的神经保护作用（细胞水平）:以大鼠星形胶质细胞株CTX-TNA2为研究对象,通过利用不同时间点（2h,4h,6h,12 h和24h）过氧化氢（Hydrogenperoxide,H2O2）（300 μM）刺激制造氧化应激模型以研究TPH1水平的变化;以活性肽OM-LV20为分子探针,利用Western免疫印迹方法和qRT-PCR探索活性肽对H2O2刺激下CTX-TNA2细胞的神经保护机制是否通过“PAC1R-MAPKs-TPH1”分子轴。6)通过慢病毒转染CTX-TNA2细胞构建与筛选稳定过表达细胞株;利用H2O2刺激2 h制造氧化应激模型和检测细胞活力、过氧化氢酶（Catalase,CAT）和乳酸脱氢酶（Lctate dehydrogenase,LDH）水平变化以探索TPH1的神经保护作用。[结 果]（1）活性肽OM-LV20在4℃与37℃条件下均展示出良好的稳定性,并且在血浆中的半衰期为2.834 h。（2）OM-LV20有效逆转由I/R导致的神经功能损伤、改善大鼠神经行为异常、显着挽救脑梗死体积、有效提高大鼠海马区（p<0.05）和皮质区（p<0.0001）神经元存活率（20 ng/kg）,并改善由I/R所致的细胞胞质染色加深、胞体皱缩、细胞间隙增大并有空泡形成及海马CA1区结构紊乱等一系列神经细胞和组织状态的改变。（3）分子对接模拟实验提示OM-LV20可能与GLP-1R通过Ile-19、Asp-12、Lys-7、Lys-4和Leu-1位点结合;GLP-1R激动实验提示OM-LV20并不是GLP-1R的直接激动剂。（4）I/R组和OM-LV20组大鼠梗死区域脑组织转录组测序提示:OM-LV20与I/R组共有3089个显着差异基因,并主要富集于MAPKs信号通路、cAMP信号通路和内质网蛋白加工等信号通路。通过实验验证发现,OM-LV20对大鼠脑I/R损伤的神经保护机制可能通过抑制MAPK信号通路磷酸化、激活BDNF/AKT信号通路、促进TPH1和PAC1R水平、及调节cAMP水平相关。（5）TPH1明显分布于海马区域、丘脑区域和中缝区域,特别是海马CA1区有明显表达,并在大鼠海马CA1区星形胶质细胞及DI-TNC1和CTX-TNA2两种大鼠星形胶质细胞株中均有表达。（6）TPH1在不同时间H2O2刺激下的变化:TPH1的mRNA和蛋白水平均呈先下降（2h降低）后上升（12h达到高峰）的趋势。（7）OM-LV20 以浓度依赖（10pM、100 pM、1nM）升高 CTX-TNA2 细胞中TPH1的mRNA和蛋白水平。（8）OM-LV20对H2O2刺激下大鼠CTX-TNA2细胞的神经保护作用:OM-LV20可能通过保护细胞活力（p<0.01）、抑制MAPK信号通路磷酸化（p<0.05）、升高PAC1R（p<0.001）、TPH1（p<0.05）和 CAT水平（p<0.05）,与减少LDH释放（p<0.0001）改善氧化应激下的细胞损伤。（9）OM-LV20通过抑制JNK磷酸化水平升高TPH1水平:OM-LV20的应用降低JNK磷酸化水平并升高TPH1水平（p<0.05）。同时应用OM-LV20和Anisomycin后,TPH1水平有所下降（p<0.01）;SP600125的单独应用会升高TPH1水平（p<0.05）。说明OM-LV20通过调控JNK信号通路磷酸化对TPH1水平进行调控、p-JNK水平与TPH1水平呈负相关趋势。（10）OM-LV20可能通过结合PAC1R对TPH1水平进行调控:分子对接模式实验提示,OM-LV20与PAC1R有结合的潜能。单独应用OM-LV20能提高CTX-TNA2细胞的TPH1水平（p<0.01）,联合应用PACAP6-38后,升高的TPH1水平有所下降（p<0.05）。（11）过表达TPH1对H2O2刺激下的CTX-TNA2细胞活力损伤无保护作用,但有抗氧化应激损伤作用:过表达TPH1逆转了异常的CAT水平降低（升高25.01%±12.62%）与 LDH 水平升高（313.53%±65.39%）。[结 论]体内实验结果提示,对脑缺血再灌注模型大鼠腹腔注射活性肽OM-LV20可显着减少大鼠脑梗死体积、改善大鼠神经行为异常,并对I/R造成的梗死区域皮层和海马神经元的存活有保护作用。OM-LV20介导的潜在分子机制涉及MAPKs和BDNF/AKT信号通路的激活,与TPH1、cAMP和PAC1R的水平变化。体外实验结果提示,OM-LV20对氧化应激下大鼠星形胶质细胞的神经保护机制可能通过“PAC1R-MAPKs-TPH1”分子轴进行。此外,本研究首次报道了 TPH1在大鼠星型胶质细胞上的表达、探索了在不同时间点H2O2刺激下CTX-TNA2细胞中TPH1水平的表达,并发现TPH1可能通过提高CAT水平和减少LDH的释放以保护星形胶质细胞抵抗氧化应激损伤。本研究首次报道了两栖类动物皮肤分泌源性肽OM-LV20对I/R大鼠的神经保护作用。为新型抗卒中药物先导分子提供候选模版;为靶向TPH1及抗氧化应激途径提供了一种可能的减轻脑I/R损伤的相关机制,也为脑I/R的神经保护药物研发提供了潜在靶点。
朱雄[7]（2020）在《EMC3基因视网膜和小脑神经退行性疾病发病机制的功能研究》文中认为神经退行性疾病（Neurodegenerative Diseases）是一类以中枢神经系统（神经元）和（或）外周神经系统（髓鞘）的变性、凋亡所导致的结构和功能的进行性退化为特征的异质性疾病。随着人口老龄化问题日益突出,神经退行性疾病已成为世界范围内危害人类健康最严重的疾病之一。神经退行性疾病的发病机理极其复杂,至今尚不能被完全解释清楚,到目前为止缺少有效的诊断和治疗方法。目的:在神经退行性疾病中,脑和视网膜神经退行性病变是目前研究的热点。此类疾病引起损害的病理是神经元细胞的不可逆性损伤,目前临床上对此缺乏行之有效的治疗手段。视网膜营养不良（Retinal dystrophy）是一类因光感受器功能丧失而引起的异质性遗传性疾病。在全球尤其是工业化国家中,视网膜变性疾病是致盲的重要原因之一。这些疾病的临床表型复杂性和等位基因的异质性给疾病的正确诊断带来困难。内质网膜蛋白复合物（endoplasmic reticulum membrane protein complex,EMC）首先在酿酒酵母中被鉴定为内质网中蛋白质折叠所需的6亚单位跨膜蛋白复合物。EMC亚基的丢失会导致错误折叠的膜蛋白的积累和未折叠蛋白反应（UPR）的诱导。有研究报道,EMC1基因突变与视网膜营养不良及小脑发育退化综合征相关。在真核生物中,d Pob/EMC3定位于内质网,并与EMC1和钙连蛋白（calnexin）结合并相互作用。此外,内质网膜蛋白复合物（EMC）是其他多通道跨膜蛋白的稳定表达所必需的,如视紫红质和Na+K+-ATP酶等。另外,d Pob/EMC3缺失会导致果蝇单眼细胞的变性。这些结果共同表明,EMC是包括视紫红质1在内的多通道跨膜蛋白生物发生过程中的一个关键因素,其缺失会导致视网膜变性。EMC1和EMC3组成复合物参与内质网相关降解（ERAD）途径,表明EMC与ERAD途径之间存在密切联系。内质网结构和功能的紊乱在神经退行性疾病中已被广泛观察到,但内质网功能障碍是神经退行性疾病病变的原因,还是仅仅是神经元死亡的表现,目前尚不清楚。本论文重点研究EMC3在小脑和视网膜中的功能。方法:构建EMC3、EMC1等表达质粒载体（包括野生型和突变型）,分别进行细胞转染,结合免疫组化等方法,通过高分辨激光共聚焦显微镜、荧光共定位等分析其在细胞中的表达及定位情况,分析EMC1突变是否引起细胞中定位发生变化。研究EMC3与EMC其他亚基的表达及定位分析。在前期工作中,本研究发现小鼠Emc3基因胚胎敲除导致早期胚胎死亡。因此使用Pcp2-cre转基因小鼠和Emc3条件性敲除小鼠建立了一个在小脑浦肯野神经细胞和视网膜双极细胞中特异敲除Emc3基因的动物模型。本论文综合运用分子生物学,细胞生物学和免疫组化等方法,详细研究Emc3在双极细胞和小脑浦肯野细胞中的功能。利用双极细胞和小脑浦肯野细胞中特异蛋白标志物,对Emc3缺失的小鼠视网膜和小脑冰冻切片进行免疫染色,使用高分辨率激光共聚焦显微镜,详细分析这些关键蛋白的运输和定位。结果:EMC3由小鼠Tmem111基因编码,是高度保守的内质网膜蛋白复合物（EMC）的一个亚基。本研究发现Emc3的靶向缺失导致了小鼠严重的神经病变表型。同时Emc3lox P/lox P;Pcp2-Cre小鼠是可以长期存活并是可育的,但行为学上表现出类似于小脑共济失调的表型。与野生型小鼠相比较,三月龄的成年Emc3突变小鼠小脑中浦肯野细胞的树突发育有明显减少。本研究进一步发现,浦肯野细胞中Emc3的选择性缺失导致内质网错误折叠的膜蛋白的积累,阻碍了浦肯野细胞的分泌运输,并导致了树突萎缩。这些表型表现为小脑体积变小和浦肯野细胞数量减少,导致共济失调。浦肯野细胞丢失和共济失调最初出现在出生后两个星期左右,但随着年龄的增长逐渐恶化。Emc3的缺失导致浦肯野细胞缺失区域神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达增加和星形胶质细胞增生。C/EBP同源蛋白（CHOP）和葡萄糖调节蛋白78（GRP78/BIP）表达水平升高表明浦肯野细胞在可见细胞丢失之前存在内质网应激（ER Stress）。TUNEL（Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling）分析表明,小脑浦肯野细胞出现细胞凋亡。本文的数据表明,浦肯野细胞中Emc3的缺失导致蛋白质折叠和运输缺陷,树突密度显着降低,星形胶质细胞增生和浦肯野细胞死亡。此外,本研究发现Emc3突变小鼠视网膜中视杆双极细胞与野生型小鼠相比有进行性病变,这表明Emc3在小鼠的视网膜结构和功能维持发挥重要作用。结论:研究结果表明了Emc3在小鼠浦肯野细胞和视网膜双极细胞的发育和功能维持发挥重要作用。本文的研究揭示了EMC3蛋白在小脑浦肯野细胞和视网膜中的重要作用,为研究小脑共济失调和视网膜神经退行性疾病提供了新方向与思路。
吴春晓[8]（2020）在《电针结合NeuroD1基因疗法修复缺血性脑中风的机制研究》文中认为背景与目的:目前缺血性脑中风的治疗在一定程度上能改善患者的神经功能缺损症状和抑制炎症反应。然而,对于神经细胞死亡后无法再生的难题仍无法解决。本研究通过将神经转录因子NeuroD1微量注射到大脑中动脉损伤脑区,观察NeuroD1能否将大脑中动脉损伤脑区的应激星形胶质细胞重编为功能性神经元,同时运用改善运动功能较佳的电针疗法,两者的结合治疗是否能优化缺血性脑中风的治疗方案;能否进一步改善动物行为学障碍,提高神经元转化率,降低脑损伤炎症反应,进一步提高脑修复作用。探究电针结合神经转录因子NeuroD1调控缺血性脑中风的潜在机制。方法:将9只SPF级C57BL/6成年雄性小鼠制作MCAO模型后随机分为3组,分别为造模后（3天）组、（14天）组和（30天）组,通过激光散斑脑血流成像以及TTC染色观察脑梗死区域验证梗塞模型是否成功。同时,运用免疫荧光染色观察星形胶质细胞、小胶质细胞的病理变化。选用SPF级C57BL/6成年雄性小鼠（8-12周）9只,纹状体和皮层注射AAV病毒hGFAP::Cre/FLEX-CAG::NeuroD1-P2A-GFP分别于注射后第7天、14天和30天进行免疫荧光染色,观察在正常机体（小鼠）大脑不同脑区（纹状体以及皮层）不同时间点NeuroD1将应激星形胶质细胞重编成神经元的转化率情况。同时,运用电生理膜片钳全细胞记录技术观察重编的神经元是否具有正常的电生理功能。SPF级C57BL/6成年雄性小鼠（8-12周）35只随机分为假手术组、模型空载病毒组和NeuroD1治疗组三组,基因疗法干预后4天、14天、28天、60天和90天,分别进行动物行为学实验,主要包括黏纸实验、走格子实验、爬杯试验以及足迹分析。通过免疫荧光染色评估应激星形胶质细胞重编成NeuN神经元的转化情况,观察不同处理组脑梗死面积,应激星形胶质细胞、小胶质细胞的荧光强度变化及形态变化。将55 SPF级C57BL/6成年雄性小鼠（8-12周）采用随机数字表法随机分为4大组,分别为假手术（Sham）组,脑缺血再灌注损伤（I/R组）+mCh组,I/R+NeuroD1组和I/R+电针+NeuroD1组。分别于干预后第4天、14天、28天、60天和90天进行动物行为学实验测试。通过免疫荧光染色评估应激星形胶质细胞重编成NeuN神经元的转化情况,不同处理组脑梗死面积,应激星形胶质细胞、小胶质细胞的荧光强度及形态变化。结果:1.模型评价部分（1）MCAO模型小鼠在3d、14d和28d时神经功能缺损症状评分均为1分;（2）线栓插入后进行激光散斑血流量监测,可观察到线栓堵塞侧（左侧）灌注血流量与健侧相比,显着降低（分别为101.92±42.44和268.51 ±80.70）。（3）将造模后的MCAO小鼠进行TTC和神经元NeuN的染色,可观察到小鼠损伤脑区主要分布在纹状体以及纹状体附近皮层,并且出现大量的神经元丢失情况。（4）小鼠MCAO造模第3d、14d和30d后患侧脑区与正常健侧脑区星形胶质细胞（GFAP 标记）光强度分别为（21.98±2.44;7.92±0.69）、（19.47±3.05;6.15±1.35）和（22.38±3.61;5.98±1.27）。小胶质细胞（IBA1）平均光强度分别为（21.98±2.44;7.92±0.69）、（19.47±3.05;6.15±1.35）、（22.38±3.61;5.98±1.27）。2.在正常动物不同脑区,神经转录因子N euroD1将星形胶质细胞重编为功能性神经元的情况（1）皮层脑区:观察注射AAV 病毒 hGFAP::Cre/FLEX-CAG::NeuroD1-P2A-GFP 第7d、14d 和 30d 神经元的转化率分别为 4.06±2.33%、16.85± 6.75%和 84.42±1.07%。病毒注射14d和30d后,NeuroD1将皮层星形胶质细胞重编为神经元的转化率与7d相比,显着增加（P<0.05）。（2）纹状体脑区:注射AAV 病毒 hGFAP::Cre/FLEX-CAG::NeuroD1-P2A-GFP 第 7d、14d和30d后纹状体神经元的转化率分别为5.24±2.11%、31.48±11.10%和85.18±0.47%,纹状体星形胶质细胞在病毒侵染14d,30d后重编为神经元的转化率较7d的高,差异有统计学意义（P<0.05）。（3）全细胞膜片钳记录:NeuroD1表达7天时,随着注入电流的增加,电压呈线性变化,表明侵染的细胞仍旧是星形胶质细胞不表达钠离子通道,存在有一定的阻抗,尚未重编成神经元;NeuroD1表达21天时,记录纹状体标记的细胞发现其具有钠离子和钾离子电流信号,并且具有动作电位。说明NeuroD1重编的细胞表达钠通道,具有神经元的特性,且拥有神经元功能。3.神经转录因子NeuroD1将MCAO小鼠应激星形胶质细胞转化功能性神经元部分（1）动物行为学黏纸实验去除黏纸时长、走格子实验患肢踩空率、爬杯试验患侧肢体拖拽率和足迹分析患侧前后肢步长,三组均显示总体差异具有统计学意义（P<0.05）。进一步观察每一个干预时间点不同组别改善肢体运动功能的差别,N euroD1病毒注射后28天,60天,90天NeuroD1治疗组黏纸去除时长减少,走格子踩空率以及爬杯拖拽率减少,与模型组比较均具有统计学差异（P<0.01）;足迹分析在病毒注射后28天,60天,NeuroD1治疗组与模型空载组比较,NeuroD1治疗组能较好的改善MCAO小鼠患侧前肢、后肢的步长,差异均具有统计学意义（均P<0.05）。（2）NeuroD1将MCAO小鼠应激星形胶质细胞重编为功能性神经元相关病毒注射7天后,NeuroD1将皮层以及纹状体中应激星形胶质细胞重编为神经元的转化率分别为9.1%和10%;注射30天后,NeuroD1病毒治疗组将皮层和纹状体应激星形胶质细胞重编为神经元的转化率大约为80.86%和82.08%,与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.01）。（3）NeuroD1降低MCAO小鼠脑梗死面积NeuroD1干预30天和120天后,结果发现,三组脑梗死面积总体比较,差异具有统计学意义（P<0.01）;NeuroD1与模型空载组比较,差异均具有统计学意义（P<0.05）。（4）NeuroD1对MCAO小鼠炎症胶质细胞的影响NeuroD1治疗30天和120天后,结果显示三组应激星形胶质细胞以及小胶质细胞荧光强度比较差异均具有统计学意义（P<0.01）。NeuroD1治疗组应激星形胶质细胞以及小胶质细胞荧光强度均比模型组弱（均P<0.01）。（5）NeuroD1对MCAO小鼠炎症小胶质细胞形态结构的影响治疗干预30天和120天后,三组比较,损伤脑区小胶质细胞数量、平均末端数量和突起长度均具有统计学差异（均P<0.01）;NeuroD1治疗组与模型组比较,能减少MCAO小鼠应激小胶质细胞数量,增加小胶质细胞平均末端数量和突起长度,差异均具有统计学意义（P<0.05）。4.电针结合神经转录因子NeuroD1将应激星形胶质细胞重编成神经元修复缺血性脑中风部分（1）动物行为学黏纸实验去除黏纸时长、走格子实验踩空率、爬杯试验患侧肢体拖拽率和足迹分析患侧前后肢步长,Sham,mCherry,NeuroD1,NeuroD1+EA四组比较均显示总体差异具有统计学意义（P<0.05）。观察每一个干预时间点不同组别改善肢体运动功能的差别。结果在干预后14天、28天、60天和90天,EA+NeuroD1治疗组黏纸去除时长减少,走格子踩空率以及爬杯拖拽率减少,与模型组比较均具有统计学差异（P<0.01）;足迹分析在病毒注射后28天、60天和90天,EA+NeuroD1治疗组与模型空载组比较,EA+NeuroD1组能较好的提高MCAO小鼠患侧前肢、后肢的步长,差异均具有统计学意义（均P<0.05）。在干预后14天,28天NeuroD1+EA组与单纯NeuroD1治疗组进行比较,NeuroD1+EA组出现较低的踩空率,具有统计学差异（P<0.05）;在干预90天,EA+NeuroD1能较好的提高患侧肢体下肢的步长,与单纯NeuroD1比较患侧下肢步长的改变具有统计学差异（P<0.05）。（2）电针结合NeuroD1将应激星形胶质细胞重编为功能性神经元7天后EA+NeuroD1将皮层以及纹状体应激星形胶质细胞重编为神经元的转化率分别为6.4%和9.2%,30天后EA+N euroD1治疗组将皮层和纹状体应激星形胶质细胞重编成神经元的转化率分别为89.74%和90.18%,与对照组相比,差异均具有统计学意义（均P<0.01）。（3）电针结合NeuroD1降低MCA0小鼠脑梗死面积EA+NeuroD1组干预30天和120天后MCAO小鼠脑梗死面积的变化:4组进行比较,总体脑梗死面积比较具有统计学差异（P<0.01）,EA+NeuroD1能较好的减小MCAO小鼠脑梗死面积,与模型组比较具有统计学差异（P<0.01）。并且120天,EA+NeuroD1与单纯NeuroD1比较,EA+NeuroD1组能较好的减少脑梗死面积,具有统计学差异（P<0.01）。（4）电针结合NeuroD1对MCAO小鼠炎症胶质细胞的影响EA+NeuroD1干预30天和120天后,结果显示4组中应激星形胶质细胞（GFAP标记）和小胶质细胞（IBA1标记）荧光强度比较差异均具有统计学意义（P<0.01）。EA+NeuroD1组的GFAP和IBA1荧光强度均比模型组弱,具有统计学差异（均P<0.01）。120天后,EA+NeuroD1能较好的降低应激IBA1的荧光强度表达,与单纯NeuroD1组比较具有统计学意义（P<0.01）。（5）电针结合NeuroD1对MCAO小鼠炎症小胶质细胞形态结构的影响干预30天和120天后,4组比较,损伤脑区小胶质的细胞数量,平均末端数量,突起长度均具有统计学差异（均P<0.01）;EA+NeuroD1治疗组与模型组比较,能减少MCAO小鼠应激小胶质细胞数量,增加小胶质细胞平均末端分支数量和突起长度,差异均具有统计学意义（P<0.05）;EA+NeuroD1组与NeuroD1组比较,EA+NeuroD1组能较好的提高小胶质细胞突起长度（P<0.01）。结论:1.大脑中动脉梗塞模型成功制作的主要特征为:出现神经缺损症状、梗塞一侧脑区血流明显减少甚至消失、损伤脑区TTC染色变白、梗死脑区主要为皮层和纹状体。并且,炎症胶质细胞从脑缺血再灌注损伤第3天起出现持续的胶质细胞应激反应,形成胶质细胞“疤痕组织”阻碍脑损伤的修复。2.NeuroD1神经转录因子在正常小鼠上能将大脑中星形胶质细胞重编成功能性神经元。病毒侵染7天后大部分仍是星形胶质细胞的形态,转化率大约10%;14天后皮层以及纹状体脑区开始有部分星形胶质细胞被重编为神经元,转化率达到40%;而在侵染1个月后,星形胶质细胞被重编为神经元的转化率则高达80%。从实验中推测神经转录因子NeuroD1将星形胶质细胞重编为成熟的神经元大约需要1个月的时间,并且在纹状体以及皮层具有较高的神经元转化率。3.NeuroD1能改善MCAO小鼠运动感觉以及平衡功能等行为障碍,将MCAO损伤脑区（皮层和纹状体）应激的星形胶质细胞重编成功能性神经元,重编的细胞形态以及功能均与正常神经元一致,并且NeuroD1的治疗可减轻脑中风小鼠的梗死面积,减轻脑区的炎症反应和保护损伤神经元。4.电针“百会穴”,“大椎穴”,“足三里穴”,“曲池穴”四个穴位结合神经转录因子NeuroD1可较好的挽救MCAO小鼠运动感觉以及平衡功能等行为学障碍,提高NeuroD1将应激星形胶质细胞重编成神经元的转化率,同时降低损伤的脑梗死面积,减轻损伤脑区应激胶质细胞的炎症反应,改变具有吞噬免疫功能的小胶质细胞的形态结构,使其趋向正常。5.电针的早期干预具有优化脑内微环境,提高再生神经元转化率和存活率以及改善动物行为障碍等优势,结合NeuroD1将应激星形胶质细胞原位重编成功能性神经元的作用,两者的结合治疗能较好的提高MCAO小鼠短期以及远期的神经功能恢复的脑保护作用。
田方泽[9]（2020）在《通络清脑方对缺血性卒中急性脑水肿的影响及星形胶质HMGB1/TLR4机制研究》文中指出缺血性脑卒中是全球高发病率和高死亡率的主要疾病之一。脑水肿是缺血性脑卒中最大的并发症之一,是大面积缺血性脑卒中患者急性期恶化和死亡的主要原因。星形胶质细胞是脑水肿的重要参与细胞,其与脑血管功能变化,与水转运蛋白的活性改变密切相关,且在脑水肿的稳态中起到重要的作用。高迁移率组1（High-mobility group box 1,HMGB1）/Toll样受体4（Toll-likereceptor4,TLR4）通路作为炎性的标志性通路,在缺血性脑卒中早期脑水肿的病程发展中起了十分重要的作用。HMGB1是炎症级联反应的有效诱导物,主要在胶质细胞上表达,引起神经水肿和诱导巨噬细胞合成肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor α,TNF-α）、白介素-6（inter-leukin-6,IL-6）、白介素 1β（inter-leukin-β,IL-1β）,导致炎症细胞的聚集和渗透,同时诱发炎症和一系列继发性组织损伤。因此,在缺血性脑水肿的研究中,星形胶质细胞HMGB1/TLR4通路对AQP4和血脑屏障的影响具有重要的意义。通络清脑方（Tong LuoQingNao,TLQN）是本实验室前期研究用来治疗缺血性脑卒中急性期脑水肿的中药新药,其主要由三七总皂苷（Panax Notoginseng Saponins,PNS）、栀子苷（Geniposide,GE）,黄芩苷（Baicalin,BA）三类有效成分组成,对脑缺血的炎性反应有明显的抑制作用,具有缓解脑水肿,能降低水通道蛋白（Aquaporin-4,AQP4）的表达的作用。本课题研究TLQN及其有效组分对星形胶质细胞HMGB1/TLR4炎性通路对AQP4和血脑屏障影响,从而探寻TLQN抑制缺血性卒中脑水肿的作用机制。第一部分通络清脑方对缺血再灌注大鼠脑水肿及星形胶质HMGB1/TLR4通路和血脑屏障的影响目的:应用大鼠脑缺血再灌注模型,观察TLQN及其有效组分对缺血再灌注大鼠急性期脑水肿的影响和对星形胶质细胞HMGB1/TLR4通路及血脑屏障的影响。方法:线栓法复制大鼠脑缺血再灌注模型,随机分为假手术组（Sham）,再灌注组（Cerebralischemia-reperfusion,CIR）,通络清脑方（TLQN）42mg/kg 组（其中黄芩苷:栀子苷:三七总皂苷=1:12:6）,三七总皂苷（PNS）13.3mg/kg组、栀子苷+黄芩苷（BA+GE）26.5mg/kg+2.2mg/kg组,手术当天给药,尾静脉注射给药2d,1次/d。设立再灌注24h、48h为观察期。1.通过体重、神经功能评分、脑干湿重和功能性核磁共振的方法;观察TLQN对脑缺血再灌注大鼠急性期脑水肿的影响;2.采用生化法检测CIR大鼠脑缺血侧皮层和血液中IL-6,IL-1β,TNF-α浓度含量;3.采用Western Blot和免疫荧光的方法,检测TLQN及其有效组分对缺血再灌注大鼠24h,48h皮层AQP4、HMGB1、TLR4、NF-κB、p-NF-κB表达及蛋白水平的变化。4.采用透射电镜和免疫组化的方法,检测TLQN及有效组分对缺血再灌注大鼠细胞肿胀及血脑屏障的影响。结果:1.体重和神经功能评分结果显示,再灌注大鼠出现明显的神经功能缺损症状,TLQN组大鼠神经功能缺损评分在24h,48h明显降低（P<0.05）,PNS组和BA+GE组在48h大鼠神经功能缺损评分出现明显降低（P<0.05）。2.脑含水量结果显示:与Sham组相比,缺血再灌注24 h大鼠,脑含水量明显增加（P<0.05）;TLQN组大鼠24 h后脑含水量明显降低（P<0.05）;再灌注48 h后,TLQN、BA+GE组和PNS组脑含水量明显降低（P<0.05）。核磁共振结果显示:再灌注24h后CIR大鼠大脑海马、胼胝体和前皮层三个区域ADC信号明显降低（P<0.01）,TLQN组、PNS组和BA+GE组大鼠前皮层和胼胝体ADC明显高于CIR组（P<0.05）,而海马区域有上升趋势（P>0.05）。3.生化检测显示,CIR组大鼠缺血侧大脑皮层IL-6,IL-1β,TNF-α明显上升（P<0.01）;分别给予TLQN、PNS、BA+GE,24h和48h干预后,大鼠缺血侧大脑皮层IL-6,IL-1β,TNF-α明显下降（P<0.05）4.免疫荧光结果与Western-Blots相似,与Sham组相比,CIR组大鼠缺血侧大脑皮层AQP4浓度明显升高（P<0.01）,GFAP激活（P<0.01）,并且HMGB1、TLR4、p-NF-κB也明显上升（P<0.01）;分别给予TLQN、PNS、BA+GE,24h和48h干预后,大鼠缺血侧大脑皮层AQP4浓度显着降低（P<0.05）;GFAP明显收到抑制（P<0.05）,HMGB1、TLR4、p-NF-κB 含量也明显下调（P<0.05）5.透射电镜、GFAP的周长、和免疫组化Claudin-5的检测中显示,TLQN、PNS和BA+GE对缺血再灌注大鼠内皮细胞星形胶质细胞肿胀有明显的缓解作用,并且能够改善血脑屏障的紧密连接使其屏障功能得以修复。第二部分通络清脑方及其有效成分对氧糖剥夺/再复氧（Oxygen-glucose deprivation/Reperfusion,OGD/R）星形胶质细胞神经炎症及HMGB1/TLR4通路的影响目的:应用离体培养人脑星形胶质细胞与星形胶质细胞/微血管内皮细胞共培养实验方法,观察TLQN及单体对OGD/R损伤星形胶质细胞HMGB1/TLR4通路及内皮细胞紧密连接的影响。方法:1.使用正常的星形胶质细胞检测TLQN及其各有效成分（PNS、BA、GE）的药物毒性浓度,以备后续的药效实验做基础。采用CCK-8法检测星形胶质细胞活力,观察细胞形态。2.构建OGD/R细胞模型,氧糖剥夺6h/复氧复糖12h（OGD/R6/12）,星形胶质细胞分为正常（Control）组和OGD/R组,药物组（TLQN、PNS、BA、GE）分别在2.5～50 μg/ml进行干预,探索TLQN及单体对OGD/R损伤的星形胶质细胞的药效及给药浓度。采用CCK-8法检测星形胶质细胞活力,观察细胞形态。3.采用生化法检测细胞培养有液IL-6,IL-1β,TNF-α的含量;Western Blot、免疫细胞荧光法检测细胞GFAP、AQP4、HMGB1、TLR4、p-NF-κB表达的变化。4.采用免疫荧光和透射电镜技术,在HA/BMECs共培养体系中发现,检测OGD/R后HA细胞的培养液可降低BMECs细胞的存活率,降低细胞间的紧密连接蛋白Claudin-5、ZO-1和影响细胞内部的影响。结果:1.通过药物毒性结合药效学实验可以看出,TLQN及其有效成分PNS、BA、GE在2.5～50μg/ml浓度内无明显毒性。2.与 OGD/R 后的 HA 细胞对比,TLQN（5μg/mL）和 PNS（10 μg/mL）干预后,细胞活力明显增强（P<0.05）且作用最佳,能够明显改善细胞状态。3.免疫荧光结果与Western-Blots结果相似:1)与Control组相比,OGD/R组HA细胞AQP4浓度明显升高（P<0.01）,,并且HMGB1、TLR4、p-NF-KB也明显上升（P<0.01）;给予 TLQN（5mg/kg）和 PNS（10mg/kg）干预后,HA 细胞 AQP4 浓度显着降低（P<0.05）;HMGB1、TLR4、p-NF-κB含量也明显下调（P<0.01）,且加入丙酮酸乙酯（EP）后,抑制了 OGD/R 组 HA 细胞 AQP4、HMGB1、TLR4、p-NF-κB 的表达。4.CCK8结果显示,GD/R后HA细胞外液对BMECs的存活率有显着的降低（P<0.05）;免疫荧光结果显示,BMECs细胞间的紧密连接蛋白Claudin-5、ZO-1有明显的下降。在TLQN和PNS干预之后,BMECs的存活率上升,细胞间的Claudin-5、ZO-1的数量增加,上述结果与EP干预后的结果有一致的趋势,表明TLQN具有通过星形胶质细胞抑制内皮细胞损伤的功能。结论:通过体内和体外实验研究表明,基于“神经血管单元”理论,通络清脑可以减轻缺血再灌注大鼠急性期脑水肿,尤其是皮层水肿的作用。其机制是通过星形胶质细胞HMGB1/TLR4通路抑制AQP4表达和星形胶质细胞肿胀,同时减少水肿相关炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达,;通络清脑方通过星形胶质细胞HMGB1/TLR4通路增加内皮细胞的紧密连接程度,改善血脑屏障功能。其作用的有效组分是活血组（三七总皂苷）。
徐梦[10]（2020）在《人参皂苷Rb1和Rg1对OGD/R损伤星形胶质细胞线粒体的影响及其机制研究》文中认为脑缺血再灌注损伤（Cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI）是当今社会数百万人死亡或残疾的主要原因之一。当大脑局部缺血时,血栓形成,大脑血流部分中断,造成缺血损伤。当血管再通,血液灌注时,会伴随着大量氧气,产生活性氧（Reactive oxygen species,ROS）分子,过量的ROS堆积,对机体造成二次损伤,凋亡相关信号通路被激活,导致细胞死亡或凋亡。星形胶质细胞（Astrocyte,AS）平铺在整个中枢神经系统,是脑组织中最丰富的一种神经胶质细胞,对于神经回路功能、突触形成、神经传递、代谢调节、血脑屏障的形成和维持以及中枢神经系统正常生物学功能的运行至关重要,参与执行生命活动中的多项功能并在任何地方都起着基本支持作用。脑缺血再灌注过程中,神经元最先遭受损伤,线粒体氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation,OXPHOS）也受到不同程度的损伤,产生的能量不足以供神经元所需。此时,星形胶质细胞线粒体产生的三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）可以被神经元所摄取,从而减少神经元遭受脑缺血再灌注造成的损伤。人参皂苷 Rb1（20-S-protopanaxadiol aglycon,Rb1）和人参皂苷 Rg1（20-S-protopanaxatriol aglycon,Rg1）是人参皂苷含量最多的有效成分。研究发现人参皂苷对免疫系统疾病、癌症、心脑血管疾病、肿瘤、神经系统疾病等方面均有一定的治疗作用。本实验拟建立氧糖剥夺/再灌注（Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）细胞模型模拟脑缺血再灌注损伤,以研究人参皂苷Rb1和Rg1对OGD/R损伤星形胶质细胞的保护作用以及对线粒体功能的改善作用。目的本实验探讨人参皂苷Rb1和Rg1的神经保护作用以及其可能的作用机制。方法将出生1 d的ICR小鼠处死,原代培养小鼠大脑星形胶质细胞并传代,取第3代细胞用于实验。实验分组为Control组、OGD/R组、OGD/R+Rb1组、OGD/R+Rg1组,造模成功后,制备细胞样品并检测相关指标。1.人参皂苷Rb1和Rg1对OGD/R损伤星形胶质细胞的影响（1）通过 GFAP（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）免疫荧光染色鉴定星形胶质细胞的纯度;（2）通过CCK-8实验检测细胞活力评价人参皂苷Rb1和Rg1对OGD/R损伤星形胶质细胞活力的影响;（3）通过检测ROS水平和过氧化氢酶（Catalase,CAT）活性评价人参皂苷Rb1和Rg1对OGD/R损伤星形胶质细胞氧化应激水平的影响;2.人参皂苷Rb1和Rg1对OGD/R损伤星形胶质细胞线粒体的保护作用机制研究（1）通过检测线粒体DNA（Mitochondrial DNA,mtDNA）拷贝数和线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）评价人参皂苷 Rb1 和 Rg1 对OGD/R损伤星形胶质细胞线粒体功能的影响;（2）通过检测线粒体呼吸链复合物Ⅰ-Ⅴ的活性和ATP水平评价人参皂苷Rb1和Rg1对OGD/R损伤星形胶质细胞线粒体氧化磷酸化水平的调控作用。结果1.人参皂苷Rb1和Rg1对OGD/R损伤的星形胶质细胞有一定的保护作用（1）激光共聚焦显微镜观察星形胶质细胞GFAP免疫荧光染色,显示原代培养星形胶质细胞纯度较高,细胞胞浆丰富,有许多长而突起的分支,细胞状态良好。（2）与Control组相比,星形胶质细胞经OGD/R损伤后,细胞活力明显下降（P<0.01）,细胞出现圆缩或脱壁现象,且折光性减弱。与OGD/R组相比,给予人参皂苷Rb1（2、5、10 μmol/L）和Rg1（2、5、10 μmol/L）干预后,星形胶质细胞活力有明显上升趋势,其中5 μmol/L人参皂苷Rb1和10 μmol/L人参皂苷Rg1效果较明显（P<0.01）,细胞折光性增强,突起变长,明显改善细胞状态。2.人参皂苷Rb1和Rg1通过抗氧化应激减少OGD/R对星形胶质细胞的损伤与Control组相比,星形胶质细胞经OGD/R损伤后,随着复氧时间的增加,星形胶质细胞ROS的产生也逐渐增加（P<0.01）,CAT活性逐渐下降（P<0.01）,经人参皂苷Rb1（5 μmol/L）和Rg1（10 μmol/L）干预后,可见星形胶质细胞ROS水平明显下降（P<0.01）,CAT活性上升（P<0.05）,表明人参皂苷Rb1和Rg1可通过抗氧化应激减少OGD/R对星形胶质细胞的损伤。3.人参皂苷Rb1和Rg1通过调节线粒体氧化磷酸化水平改善OGD/R损伤星形胶质细胞的线粒体功能（1）与Control组相比,OGD/R损伤星形胶质细胞后,随着复氧时间的增加,星形胶质细胞MMP持续去极化（P<0.01）,mtDNA拷贝数明显下降（P<0.01）,与 OGD/R 组相比,人参皂苷 Rb1（5 μmol/L）和 Rg1（10μmol/L）可以增加mtDNA的拷贝数（P<0.05）,同时抑制MMP去极化（P<0.01）,表明人参皂苷Rb1和Rg1可以改善OGD/R损伤的星形胶质细胞线粒体功能。（2）与Control组相比,星形胶质细胞经OGD/R损伤后,随着复氧时间的增加,线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ活性和ATP水平明显下降（P<0.05）,人参皂苷Rb1（5 μmol/L）和Rg1（10μmol/L）干预后,星形胶质细胞线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ活性和ATP水平有明显的上升趋势（P<0.05）,表明人参皂苷Rb1和Rg1可以通过调节氧化磷酸化水平减少OGD/R对星形胶质细胞线粒体的损伤。结论综上所述,随着复氧时间的增加,OGD/R会加剧星形胶质细胞的损伤。人参皂苷Rb1和Rg1可以通过调节线粒体氧化磷酸化水平,增加ATP的产生,抗氧化应激,改善线粒体功能,减少OGD/R对星形胶质细胞造成的损伤,具有一定的神经保护作用。
二、星形胶质细胞凋亡途径的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、星形胶质细胞凋亡途径的研究进展（论文提纲范文）
（1）COL6A1通过PI3K/Akt通路对大鼠原代脊髓星形胶质细胞氧糖剥夺/复氧复糖后自噬的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 原代脊髓星形胶质细胞的培养鉴定及OGD/R模型的建立 |
| 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验细胞 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要抗体 |
| 1.5 主要仪器与设备 |
| 实验方法 |
| 2.1 体外脊髓星型胶质细胞培养实验 |
| 2.2 免疫荧光染色鉴定原代星形胶质细胞的纯度 |
| 2.3 原代脊髓星形胶质细胞OGD/R模型的建立 |
| 2.4 统计学方法 |
| 实验结果 |
| 3.1 脊髓星形胶质细胞形态学特征 |
| 3.2 脊髓星形胶质细胞免疫荧光染色 |
| 3.3 脊髓星形胶质细胞纯度分析 |
| 3.4 OGD/R后脊髓星形胶质细胞形态学变化 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 敲低COL6A1对大鼠脊髓星形胶质细胞OGD/R后自噬和PI3K/Akt通路的影响 |
| 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要抗体 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 实验方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 细胞总RNA的提取 |
| 2.4 RNA逆转录及实时荧光定量PCR实验(RT-qPCR) |
| 2.5 细胞增殖实验 |
| 2.6 细胞凋亡实验 |
| 2.7 透射电镜检测 |
| 2.8 蛋白免疫印迹实验 |
| 2.9 统计学方法 |
| 实验结果 |
| 3.1 RT-qPCR验证脊髓星形胶质细胞OGD/R后COL6A1的差异性表达 |
| 3.2 RT-qPCR验证shRNA-COL6A1转染效率 |
| 3.3 CCK-8检测敲低COL6A1对细胞增殖能力的影响 |
| 3.4 流式细胞术检测敲低COL6A1对脊髓星形胶质细胞凋亡的影响 |
| 3.5 透射电镜观察敲低COL6A1对脊髓星形胶质细胞OGD/R后自噬小体的影响 |
| 3.6 RT-qPCR检测敲低COL6A1后各组COL6A1 mRNA、Beclin-1 mRNA、LC3 mRNA表达水平 |
| 3.7 Western blot检测COL6A1对脊髓星形胶质细胞OGD/R后自噬和PI3K/Akt通路相关蛋白的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 脊髓胶质细胞在神经病理性痛作用机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间研究成果 |
（2）星蒌承气汤治疗急性缺血性卒中痰热腑实证机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 星蒌承气汤药效物质基础及对缺血性卒中神经保护机制研究进展 |
| 1 大黄 |
| 1.1 中医认识 |
| 1.2 化学成分及神经保护作用 |
| 2 胆南星 |
| 2.1 中医认识 |
| 2.2 化学成分及神经保护作用 |
| 3 瓜蒌 |
| 3.1 中医认识 |
| 3.2 化学成分及神经保护作用 |
| 4 羌活 |
| 4.1 中医认识 |
| 4.2 化学成分及神经保护作用 |
| 5 芒硝 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于肠道微生态理论的缺血性卒中病因与发病机制研究进展 |
| 1 肠道微生态与肠道微生态失调 |
| 2 菌-肠-脑轴 |
| 3 从肠到脑的上行通路 |
| 4 从脑到肠的下行通路 |
| 5 脑卒中相关危险因素与肠道菌群 |
| 6 卒中并发症的肠道微生态机制 |
| 7 结论 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 基于网络药理学与分子对接的星蒌承气汤治疗缺血性卒中的机制研究 |
| 1 研究资料 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 星蒌承气汤化学活性成分的检索与筛选 |
| 2.2 星蒌承气汤化学成分及缺血性卒中靶点筛选 |
| 2.3 交集基因蛋白互作网络(PPI)分析 |
| 2.4 基因本体论(Gene ontology,GO)功能富集和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 |
| 2.5 可视化网络构建与分析 |
| 2.6 分子对接 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 星蒌承气汤潜在化学活性成分的检索与筛选结果 |
| 3.2 星蒌承气汤活性成分靶点及缺血性卒中靶点预测结果 |
| 3.3 GO富集分析及KEGG代谢通路富集分析结果 |
| 3.4 可视化网络构建与分析 |
| 3.5 分子对接 |
| 4 讨论 |
| 4.1 网络药理学在中医药现代化研究中的应用 |
| 4.2 基于网络药理学方法探讨星蒌承气汤活性成分 |
| 4.3 基于网络药理学方法探讨星蒌承气汤效应机制 |
| 5 小结 |
| 第三部分 实验研究 |
| 实验一 星蒌承气汤对中风急性期痰热腑实证小鼠神经保护作用及网络药理学关键靶点及通路实验验证 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器设备与耗材 |
| 1.4 实验药物的配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 分组与给药 |
| 2.2 模型制备 |
| 2.3 神经功能评分 |
| 2.4 除胶实验 |
| 2.5 TTC染色 |
| 2.6 取材及处理 |
| 2.7 TUNEL法检测皮层梗死周围细胞凋亡情况 |
| 2.8 脑组织ELISA |
| 2.9 脑组织Western blot |
| 2.10 统计分析 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 神经功能评分 |
| 3.2 除胶实验 |
| 3.3 脑梗死体积评价 |
| 3.4 对缺血侧脑组织细胞凋亡的影响 |
| 3.5 星蒌承气汤对缺血侧脑组织TNF-α的影响 |
| 3.6 星蒌承气汤对缺血侧脑组织AKT、p-AKt、PI3K及NF-κB蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 星萎承气汤是治疗中风病急性期痰热腑实证的具有确切临床疗效的代表方剂 |
| 4.2 化痰通腑法代表方星蒌承气汤脑保护作用及中医理论探讨 |
| 4.3 卒中模型神经功能评分探讨 |
| 4.4 卒中模型行为学选择 |
| 4.5 星蒌承气汤与细胞凋亡 |
| 4.6 网络药理学关键靼点及通路实验验证 |
| 5 小结 |
| 实验二 星蒌承气汤对中风急性期痰热腑实证小鼠菌-肠-脑轴影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器设备与耗材 |
| 1.4 实验药物的配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 分组与给药 |
| 2.2 模型制备 |
| 2.3 取材及处理 |
| 2.4 免疫组化 |
| 2.5 免疫荧光 |
| 2.6 ELISA检测 |
| 2.8 肠道菌群分析 |
| 2.9 盲肠内容物短链脂肪酸(SCFAs)检测 |
| 2.10 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 星蒌承气汤对中风痰热腑实证小鼠肠道菌群的影响 |
| 3.2 星蒌承气汤对中风痰热腑实证小鼠肠道菌群代谢产物短链脂肪酸及短链脂肪酸受体的影响 |
| 3.3 星蒌承气对菌-肠-脑轴神经-内分泌-免疫途径相关指标影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 基于脑肠互动理论探讨化痰通腑法治疗中风病的理论基础 |
| 4.2 星蒌承气汤对短链脂肪酸影响 |
| 4.3 星萎承气汤对菌-肠-脑轴自主神经途径影响 |
| 4.4 星蒌承气汤对菌-肠-脑轴神经内分泌途径影响 |
| 4.5 星萎承气汤对菌-肠-脑轴免疫途径影响 |
| 5 小结 |
| 实验三 星萎承气汤对中风急性期痰热腑实证伪无菌小鼠菌-肠-脑轴影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器设备与耗材 |
| 1.4 实验药物的配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 分组与给药 |
| 2.2 模型制备 |
| 2.3 神经功能评分 |
| 2.4 除胶实验 |
| 2.5 TTC染色 |
| 2.6 取材及处理 |
| 2.7 免疫组化、免疫荧光 |
| 2.8 ELISA检测 |
| 2.9 肠道菌群分析 |
| 2.10 盲肠内容物SCFAs分析 |
| 2.11 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 神经功能评分 |
| 3.2 除胶实验 |
| 3.3 脑梗死体积评价 |
| 3.4 肠道菌群 |
| 3.5 短链脂肪酸 |
| 3.6 星蒌承气汤对伪无菌小鼠菌-肠-脑轴神经-内分泌-免疫途径相关指标影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 伪无菌模型建立及评价 |
| 4.2 肠道菌群是星蒌承气汤发挥作用的重要靶点 |
| 4.3 星蒌承气汤治疗急性期缺血性卒中机制的初步探讨 |
| 5 小结 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（3）解毒益智方对阿尔茨海默病双转基因小鼠行为学及大脑皮层内β-淀粉样蛋白沉积及BACE1表达影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 综述一 AD的病因病机及治疗进展 |
| 1 中医学对痴呆的系统认识及研究进展 |
| 1.1 中医学对痴呆病名由来及发展的认识 |
| 1.2 中医学对痴呆病因病机的古代认识 |
| 1.3 中医学对痴呆辨证论治及相关研究的认识 |
| 1.4 中医学对痴呆治疗的古今认识 |
| 综述二 西医学对AD的发病机制及治疗进展研究 |
| 1 现代医学对AD的认识及研究进展 |
| 1.1 AD的概述及流行病学 |
| 1.2 现代医学对AD发病因素的认识及研究 |
| 1.3 现代医学对AD发病相关机制的认识 |
| 2 现代医学对AD治疗的认识 |
| 2.1 乙酰胆碱酯酶抑制剂(AchEIs) |
| 2.2 兴奋性氨基酸受体拮抗剂 |
| 2.3 甘露特纳胶囊 |
| 2.4 其他非药物治疗 |
| 3 问题与展望 |
| 综述三 Aβ在脑内异常沉积的机制 |
| 1.Aβ的产生、分布与清除、传递与运输的研究进展 |
| 1.1 Aβ的产生 |
| 2 Aβ的清除 |
| 2.1 细胞的清除作用 |
| 2.2 Aβ被降解酶的清除作用 |
| 2.3 中枢Aβ的清除途径 |
| 2.4 血液成分介导的Aβ清除 |
| 综述四 解毒益智方在阿尔茨海默病中的应用 |
| 1 解毒益智方的创立 |
| 1.1 脑髓理论 |
| 1.2 髓虚毒损 |
| 1.3 补肾益髓,活血化痰解毒法 |
| 2 解毒益智方通过调节SIRT1/AMPK通路抑制BACE1表达改善Aβ的沉积 |
| 3 解毒益智方对阿尔茨海默病的临床应用 |
| 实验研究 |
| 第一章 CCP对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤保护性的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠行为学的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠脑内Aβ水平变化的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠脑内BACE1表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
（4）牛黄及其有效成分对神经血管单元的保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 上篇文献综述 |
| 综述一 缺血性中风背景下的神经血管单元 |
| 1. 缺血性中风的研究现状 |
| 2. 神经血管单元的组成 |
| 3. 在正常和低氧条件下的生理学 |
| 4. 缺血性脑卒中的实验模型 |
| 5. 基于神经血管单元的治疗策略 |
| 6. 参考文献 |
| 综述二 中药抗缺血性脑卒中的研究进展 |
| 一. 植物药 |
| 1.1 人参 |
| 1.2 栀子 |
| 1.3 姜黄 |
| 1.4 丹参 |
| 1.5 黄芪 |
| 1.6 川芎 |
| 1.7 地黄 |
| 1.8 黄连 |
| 二. 动物药 |
| 2.1 牛黄 |
| 2.2 麝香 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 下篇 实验研究 |
| 实验一 “神经血管单元”体外模型的建立以及缺氧/复氧模型的建立 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 实验二 牛黄及其有效成分对单独培养的神经元、星形胶质细胞、内皮细胞的细胞毒性 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 牛黄及其有效成分对脑神经血管单元的保护作用 |
| 1. 实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验四 不同配伍组分对脑神经血管单元的保护作用 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 试验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验五 牛磺酸和熊去氧胆酸对神经血管单元的作用机制 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 试验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验六 牛磺酸和牛磺熊去氧胆酸对脑神经血管单元的作用机制 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 试验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）冰片配伍黄芪甲苷和三七总皂苷对脑缺血/再灌注损伤后神经血管单元保护作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文索引 |
| 前言 |
| 第一部分 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对脑缺血/再灌注损伤大鼠行为学及病理形态学的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 受试药物、剂量确定及药物配制 |
| 1.3 试剂及仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 MCAO模型的评价 |
| 2.2 Bederson神经功能评分比较 |
| 2.3 Garcia JH神经功能评分比较 |
| 2.4 脑梗死体积的比较 |
| 2.5 脑组织病理形态的比较 |
| 3 讨论 |
| 3.1 实验模型及动物的选择 |
| 3.2 中医对缺血性脑卒中的认识及中药治疗 |
| 4 小结 |
| 第二部分 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对脑缺血/再灌注损伤大鼠神经血管单元特异性结构蛋白及其结构完整性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 受试药物、剂量及浓度 |
| 1.3 实验器材、耗材、试剂及仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区NeuN表达的影响 |
| 2.2 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区Laminin表达的影响 |
| 2.3 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区GFAP表达的影响 |
| 2.4 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后 脑缺血皮质区EBA表 达的影响 |
| 2.5 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区NVU的主要组分结构关系的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 指标选择依据 |
| 3.2 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区Neu N、 EBA和Laminin及 GFAP表达的影响 |
| 3.3 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区NVU主要组分的结构关系的影响 |
| 4 小结 |
| 第三部分 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对脑缺血/再灌注损伤大鼠神经血管单元主要组分相关功能蛋白的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 受试药物、剂量及浓度 |
| 1.3 实验器材、耗材、试剂及仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区αII-Spectrin表达的影响 |
| 2.2 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区AQP-4表达的影响 |
| 2.3 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区VEGF表达的影响 |
| 2.4 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区MMP-9 表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 指标选择依据 |
| 3.2 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区αII-Spectrin、AQP-4、MMP-9及VEGF表达的影响 |
| 4 小结 |
| 第四部分 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对脑缺血/再灌注损伤大鼠损伤局部Notch信号通路的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 受试药物、剂量及浓度 |
| 1.3 实验器材、耗材、试剂及仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区Notch1表达的影响 |
| 2.2 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区NICD表达的影响 |
| 2.3 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区Hes1 表达的影响 |
| 2.4 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区DLL4 表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 指标选择依据 |
| 3.2 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区Notchl、NICD、Hesl及 DLL4 表达的影响 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A 个人简历 |
| 文献综述 |
| 文献综述一 基于神经血管单元的缺血性脑卒中相关信号通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 黄芪、三七及冰片抗脑缺血的研究进展 |
| 参考文献 |
（6）活性肽OM-LV20通过色氨酸羟化酶1介导的促脑缺血损伤修复作用和机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| OM-LV20对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| OM-LV20通过调控色氨酸羟化酶1对氧化应激下大鼠星形胶质细胞的神经保护作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 主要创新点与展望 |
| 综述 外源性应用多肽分子防治缺血性脑卒中损伤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（7）EMC3基因视网膜和小脑神经退行性疾病发病机制的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究工作的背景与意义 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 研究意义 |
| 1.2 神经退行性疾病国内外研究历史与现状 |
| 1.2.1 Emc3基因研究历史与现状 |
| 1.2.2 神经退行性疾病发病种类和机制研究进展 |
| 1.3 本文的主要贡献与创新 |
| 1.3.1 主要贡献 |
| 1.3.2 创新 |
| 1.4 论文结构安排 |
| 1.5 结语 |
| 第二章 EMC3基因在神经退行性疾病发病机制的功能研究 |
| 2.1 课题背景 |
| 2.1.1 脑神经元病变 |
| 2.1.2 视网膜神经元病变 |
| 2.2 选题依据 |
| 2.2.1 EMC1基因突变导致脑和视网膜退行性疾病 |
| 2.2.2 EMC3是果蝇感光细胞合成视紫红质和多通道膜蛋白所必需 |
| 2.2.3 EMC3和EMC1 是以复合物形式存在 |
| 2.3 研究背景 |
| 2.3.1 内质网相关蛋白的合成和降解途径 |
| 2.3.2 内质网应激介导的非折叠蛋白应答途径 |
| 2.4 研究流程和关键技术 |
| 2.5 前期研究 |
| 2.5.1 已经报道的EMC1突变进行WB分析 |
| 2.5.2 EMC3在COS7 细胞内与EMC其他亚基的表达及定位分析 |
| 2.5.3 EMC5在COS7 细胞内与EMC其他亚基的表达及定位分析 |
| 2.5.4 内质网膜蛋白复合物亚基免疫共沉淀及WB检测 |
| 2.6 展望未来 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 Emc3缺失导致小脑共济失调和浦肯野细胞变性 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验技术原理 |
| 3.2.2 实验所用材料 |
| 3.2.3 实验所用方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 利用CRISPR/Cas9-lox P系统构建Emc3 基因敲除小鼠模型 |
| 3.3.2 利用PCR技术对Emc3 CKO小鼠DNA进行基因分型 |
| 3.3.3 Emc3 CKO条件性敲除小鼠生长发育异常 |
| 3.3.4 Emc3 CKO条件敲除型小鼠小脑发育异常 |
| 3.3.5 Emc3 CKO条件敲除型小鼠行为学异常 |
| 3.3.6 Emc3 CKO条件型敲除小鼠的磁共振成像 |
| 3.3.7 Emc3 CKO条件型敲除小鼠进行性小脑萎缩和浦肯野细胞丢失 |
| 3.3.8 Emc3 CKO条件敲除型小鼠浦肯野细胞变性和星形胶质细胞增生 |
| 3.3.9 Emc3 CKO小鼠浦肯野细胞中Emc3 的缺失导致内质网应激 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 浦肯野细胞Emc3缺失影响小鼠的运动协调能力 |
| 3.4.2 星形胶质细胞激活与浦肯野细胞死亡的关系 |
| 3.4.3 浦肯野细胞Emc3缺失怎样激发内质网应激 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 Emc3的丢失导致视网膜杆状双极细胞变性 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 研究目的 |
| 4.3 实验材料和方法 |
| 4.3.1 实验技术原理 |
| 4.3.2 实验所用材料 |
| 4.3.3 实验所用方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 Emc3在视网膜上的表达定位 |
| 4.4.2 Emc3 CKO小鼠Emc3 表达水平降低 |
| 4.4.3 Emc3 CKO小鼠视网膜的生理功能分析 |
| 4.4.4 PKCα抗体对小鼠视网膜冰冻切片进行免疫染色 |
| 4.4.5 感光细胞抗体对小鼠视网膜冰冻切片进行免疫染色 |
| 4.4.6 免疫组化和H&E染色结果 |
| 4.4.7 Emc3缺失损害视杆细胞和视杆双极细胞之间的突触传递 |
| 4.4.8 Emc3 CKO视网膜中的反应性神经胶质增生 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 玻璃体视网膜病变FZD4和NDP基因突变研究 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 伦理声明 |
| 5.2.2 全外显子组测序和变异确认 |
| 5.2.3 表达质粒的构建 |
| 5.2.4 荧光素酶报告分析 |
| 5.2.5 FZD4在细胞中的表达研究 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 测序结果分析 |
| 5.3.2 突变FZD4 蛋白介导的Norrin信号缺陷 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 后续工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩写表 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
（8）电针结合NeuroD1基因疗法修复缺血性脑中风的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1.1 缺血性脑中风的致病机制 |
| 1.1.1 兴奋性氨基酸毒性作用 |
| 1.1.2 缺血性脑中风与氧化、硝化应激损伤 |
| 1.1.3 缺血性脑中风与炎症反应 |
| 1.1.4 缺血性脑中风与细胞凋亡 |
| 1.1.5 缺血性脑中风与细胞自噬 |
| 1.2 神经再生技术对缺血性脑中风的研究进展 |
| 1.2.1 内源性干细胞移植 |
| 1.2.2 外源性干细胞移植 |
| 1.2.3 基因治疗转化重编技术 |
| 1.3.针灸疗法通过调控大脑可塑性改善缺血性脑中风的机制研究 |
| 1.3.1 针刺调控内源性干细胞增殖和分化成功能性神经元治疗缺血性脑中风 |
| 1.3.2 针刺调控突触可塑性治疗缺血性脑中风 |
| 1.3.3 针刺调节神经血管营养因子改善微环境治疗缺血性脑中风 |
| 第二部分 实验研究 |
| 2.1 缺血性脑中风模型的建立与评价 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.1.4 实验讨论 |
| 2.2 神经转录因子NEUROD1将星形胶质细胞重编为功能性神经元的机制研究 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.4 实验讨论 |
| 2.3 神经转录因子NEUROD1对MCAO小鼠应激星形胶质细胞转化功能性神经元的机制研究 |
| 2.3.1 实验材料 |
| 2.3.2 实验方法 |
| 2.3.3 实验结果 |
| 2.3.4 实验讨论 |
| 2.4 电针结合神经转录因子NEUROD1将应激星形胶质细胞重编成神经元修复缺血性脑中风的机制研究 |
| 2.4.1 实验材料 |
| 2.4.2 实验方法 |
| 2.4.3 实验结果 |
| 2.4.4 实验讨论 |
| 第三部分 小结 |
| 3.1 结论 |
| 3.2 本研究创新点 |
| 3.3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1: 缩略词 |
| 附录2: 随机数字表 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 发表论文 |
| 参与课题情况 |
| 获得奖励 |
| 致谢 |
| 附件1:统计学处理合格证明 |
（9）通络清脑方对缺血性卒中急性脑水肿的影响及星形胶质HMGB1/TLR4机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 高迁移率组1(HMGB1)在缺血性中风及其相关疾病研究进展 |
| References |
| 综述二 星形胶质细胞维持大脑中水平衡的作用 |
| References |
| 综述三 神经血管单元在缺血性脑水肿中作用机制和中药对其治疗的研究进展 |
| References |
| 前言 |
| 第一部分 通络清脑方对缺血再灌注大鼠皮层脑水肿及星形胶质HMGB1/TLR4通路和血脑屏障的影响 |
| 第一节 通络清脑方对缺血再灌注大鼠急性期水肿的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第二节 通络清脑方对缺血再灌注大鼠24h星形胶质细胞HMGB1/TLR4通路研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第三节 通络清脑方对缺血再灌注大鼠48h星形胶质细胞HMGB1/TLR4通路研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第四节 通络清脑方对缺血再灌注大鼠血脑屏障保护作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第一部分 小结 |
| 第二部分 通络清脑方及其有效成分对OGD/R星形胶质细胞神经炎症及HMGB1/TLR4通路的影响 |
| 第一节 通络清脑方及其有效成分对OGD/R损伤的星形胶质细胞的保护作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第二节 抑制HMGB1后,TLQN和PNS对OGD/R损伤HA细胞HMGB1/TLR4/NF-κB通路及水肿相关炎性相关因子的作用机制研究 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第三节 抑制HMGB1后,TLQN和PNS对OGD/R损伤HA和BMECs细胞共培养紧密连接的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第二部分 小结 |
| 结语 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 通络醒脑方主要成分的含量测定 |
（10）人参皂苷Rb1和Rg1对OGD/R损伤星形胶质细胞线粒体的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1 人参皂苷抗脑缺血再灌注损伤的研究进展 |
| 1.1 抗氧化应激 |
| 1.2 减少钙超载 |
| 1.3 降低兴奋性氨基酸毒性 |
| 1.4 降低神经炎性反应 |
| 1.5 改善线粒体损伤 |
| 1.6 抑制细胞凋亡 |
| 1.7 结语 |
| 参考文献 |
| 2 线粒体氧化磷酸化水平与脑缺血再灌注损伤 |
| 2.1 线粒体氧化磷酸化 |
| 2.2 脑缺血再灌注损伤氧化磷酸化参与的相关机制 |
| 2.3 脑缺血再灌注损伤下氧化磷酸化水平的保护作用研究 |
| 2.4 结语 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 人参皂苷Rb1和Rg1对OGD/R损伤星形胶质细胞的影响 |
| 1 小鼠星形胶质细胞培养与鉴定 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 实验小结 |
| 2 人参皂苷Rb1和Rg1对OGD/R损伤星形胶质细胞的保护作用 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 实验小结 |
| 3 人参皂苷Rb1和Rg1对OGD/R损伤星形胶质细胞氧化应激水平的调节作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 实验小结 |
| 4 讨论 |
| 第二章 人参皂苷Rb1和Rg1对OGD/R损伤星形胶质细胞线粒体的保护作用机制研究 |
| 1 人参皂苷Rb1和Rg1对OGD/R损伤星形胶质细胞线粒体功能的影响 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 实验小结 |
| 2 人参皂苷Rb1和Rg1对OGD/R损伤星形胶质细胞线粒体氧化磷酸化水平的调节作用 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 实验小结 |
| 3 讨论 |
| 第三章 结语与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间主要研究成果 |
四、星形胶质细胞凋亡途径的研究进展（论文参考文献）
- [1]COL6A1通过PI3K/Akt通路对大鼠原代脊髓星形胶质细胞氧糖剥夺/复氧复糖后自噬的影响[D]. 魏延虎. 延安大学, 2021(09)
- [2]星蒌承气汤治疗急性缺血性卒中痰热腑实证机制研究[D]. 高强. 北京中医药大学, 2021(01)
- [3]解毒益智方对阿尔茨海默病双转基因小鼠行为学及大脑皮层内β-淀粉样蛋白沉积及BACE1表达影响的研究[D]. 朱晓婷. 长春中医药大学, 2021(01)
- [4]牛黄及其有效成分对神经血管单元的保护作用研究[D]. 杜欣. 北京中医药大学, 2021(02)
- [5]冰片配伍黄芪甲苷和三七总皂苷对脑缺血/再灌注损伤后神经血管单元保护作用的研究[D]. 欧阳波. 湖南中医药大学, 2021(02)
- [6]活性肽OM-LV20通过色氨酸羟化酶1介导的促脑缺血损伤修复作用和机制研究[D]. 尹赛格. 昆明医科大学, 2021
- [7]EMC3基因视网膜和小脑神经退行性疾病发病机制的功能研究[D]. 朱雄. 电子科技大学, 2020(03)
- [8]电针结合NeuroD1基因疗法修复缺血性脑中风的机制研究[D]. 吴春晓. 广州中医药大学, 2020(02)
- [9]通络清脑方对缺血性卒中急性脑水肿的影响及星形胶质HMGB1/TLR4机制研究[D]. 田方泽. 北京中医药大学, 2020(04)
- [10]人参皂苷Rb1和Rg1对OGD/R损伤星形胶质细胞线粒体的影响及其机制研究[D]. 徐梦. 北京中医药大学, 2020(04)