一、应用胶体金免疫层析技术建立炭疽杆菌芽孢的快速检测方法（论文文献综述）
钱佳婕,黄迪,徐颖华,徐志南[1]（2021）在《食源性致病微生物检测技术研究进展》文中指出食源性致病微生物是引起食品安全问题的重要因素。针对食源性致病微生物,快速而准确的检测是保障食品安全的关键举措。随着微生物学、分子生物学技术的发展,基于新型基因组编辑技术和先进生物传感器的检测技术不断涌现,食源性致病微生物的检测技术展现出多样性和综合性的特点,并得到了广泛应用和商业化发展。本文从食源性致病微生物分类出发,深入总结和探讨传统培养分离法、免疫学检测技术、核酸检测技术和生物传感器检测技术的优缺点,并重点介绍了近年来开发的基于核酸等温扩增技术和CRISPR基因编辑技术的核酸检测新方法。通过对最新的针对食源性致病微生物检测方法进行综述,为研究者开辟食源性致病微生物检测新方法提供重要的理论参考。
钱佳婕[2]（2021）在《CRISPR/Cas12a系统在新冠病毒和金黄色葡萄球菌即时检测中的应用》文中研究表明严重急性呼吸综合征冠状病毒2（Severe acute respiratory syndrome coronavirus2,SARS-CoV-2）所造成的新型冠状病毒肺炎是一种持续的大流行病,对公共卫生和全球经济构成了严峻挑战。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）是一种常见的食源性致病菌,易引起食物中毒,并对人类健康造成严重威胁。针对上述致病微生物的现有检测方法各有优势,但仍依赖于大型仪器设备和专业操作人员,极大地限制了其应用范围,也难以在条件相对落后、实验资源匮乏的地区普及。近年来,规律成簇的间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）及 CRISPR 相关蛋白（CRISPR associated proteins,Cas）所构成的CRISPR/Cas系统引起了科学家们的广泛关注,其中CRISPR/Cas12a因其具有crRNA指导的靶DNA激发的非特异性ssDNA切割活性成为了体外诊断领域的研究热点;重组酶介导扩增技术（Recombinase aided amplification,RAA）突破了精密控温设备的限制,在恒定且温和的条件下即可快速完成目标核酸的指数扩增;此外,胶体金免疫层析技术具有快速、便携的特点,将其与CRISPR/Cas12a技术结合,有望克服现有致病微生物检测技术的缺陷,实现更灵敏、特异、快速、简便的检测。故本研究意在结合CRISPR/Cas12a系统、RAA等温扩增技术、荧光分析及胶体金试纸条信号输出方式,构建针对SARS-CoV-2和金黄色葡萄球菌的即时检测平台。首先本文建立了一种基于CRISPR/Cas12a系统和荧光分析技术的SARS-CoV-2检测平台,选择N基因作为检测靶标,并将人源RNaseP基因片段作为内参。对反应条件进行优化后,该技术的灵敏度达1 ×100 copies/μL,并在检测临床样本时表现出良好的准确性和特异性,整个检测流程仅需60min。因此,该检测技术平台具有灵敏度高、特异性强、快速高效的特点,具有良好的发展前景,对于COVID-19早期诊断和预防控制具有重要意义。此外,本文基于上述原理构建了一种金黄色葡萄球菌检测平台,选择金黄色葡萄球菌nuc基因和葡萄球菌属16S rDNA作为检测靶标。结合RAA等温扩增技术,该平台检测灵敏度为1×100 CFU/反应,检测人工污染牛奶样品的灵敏度为2×101CFU/mL,并在检测其他食品样品时也表现出良好的准确性,整个检测流程仅需70 min,可满足食品中金黄色葡萄球菌的检测需求。为更好地满足即时检测需求,本文在金黄色葡萄球菌CRISPR荧光检测体系的基础上引入了胶体金免疫层析技术,建立了 一种CRISPR-lateral flow strip（CRISPR-LF）检测平台,可通过裸眼观测或读数仪测定,各项检测参数与上述荧光检测体系相当,并将整个检测流程缩短至60min。该平台在实现目标细菌快速、灵敏、准确、特异检测的同时,提高了检测的便携性和用户友好度,更适合在经济落后、实验资源匮乏的地区使用。因此,CRISPR-LF检测平台在致病菌POCT检测领域具有良好的发展前景,对于食品安全监查、食源性疾病的预防和诊断具有重要意义。
史一恒[3]（2021）在《脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备及免疫检测方法研究》文中进行了进一步梳理脂环酸芽孢杆菌是一类具有嗜酸耐热特性的革兰氏阳性菌的统称,它能够造成多种果汁品质下降,严重影响果汁产业的健康发展。建立灵敏、精确的检测方法,方便高效的识别果汁中脂环酸芽孢杆菌的污染,一直是学者研究的热点,也是果汁企业亟待解决的关键。本研究以建立脂环酸芽孢杆菌的免疫检测体系为主线,通过解析脂环酸芽孢杆菌的细胞壁蛋白,寻找菌体表面潜在的特异识别靶点,并以此为抗原,制备了脂环酸芽孢杆菌的单克隆抗体,并最终实现了苹果汁中脂环酸芽孢杆菌的灵敏、特异识别。主要研究内容和结论如下:（1）选择脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3923作为研究对象,提取菌体细胞壁蛋白,并借助免疫蛋白质组学的研究手段对其中具有免疫原性的蛋白进行鉴定,结果表明:在A.acidoterrestris DSM 3923细胞壁上存在超过200个蛋白,集中分布在10-75 k Da之间,其中分子量范围在35-75 k Da之间的蛋白丰度较低,免疫原性也相对较弱;分子量范围在10-35 k Da之间的蛋白丰度较高,免疫原性也相对较强。在挑选的22个免疫原性蛋白中,成功鉴定出18个,归属于12类蛋白,其中有2种为新发现的免疫原性蛋白。这些蛋白可以参与碳水化合物和能量代谢、物质跨膜运输、催化氧化还原反应、应答氧化应激、维持细胞生长以及多肽合成,另有一种蛋白功能未知。（2）以12类免疫原性蛋白为研究对象,根据其编码基因序列进行引物设计,借助原核表达技术获得融合蛋白,并对其免疫原性进行再次验证,结果表明:通过合理设计获得的引物,可以用于特异扩增目的基因片段,产物长度与理论值一致,且无任何碱基突变。在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下,目的基因可以在大肠杆菌中高效表达,其中4类融合蛋白以可溶性形式存在,其余融合蛋白形成包涵体。对利用镍柱纯化后的蛋白进行免疫原性分析发现,除苹果酸脱氢酶以外,其它11类蛋白均能与A.acidoterrestris多克隆抗体发生强烈的免疫反应。（3）选取假定蛋白N007＿08970作为免疫原,对BALB/c小鼠进行免疫,从而制备单克隆抗体,并对纯化的抗体进行效价和特异性评价,结果表明:经过4次腹腔注射免疫之后,6只小鼠均可产生较高效价的抗血清。选择5号小鼠用于细胞融合,最终筛选获得7株阳性杂交瘤细胞。将1G10细胞株注射入小鼠腹腔,通过腹水生产单克隆抗体,亚型鉴定为Ig G1-kappa。经过蛋白G亲和层析纯化后的抗体纯度较高,浓度为2.28 mg/m L,效价可达1:80000。Western blot分析结果发现制备的单克隆抗体可以与抗原发生强烈的免疫反应,且能专一地识别A.acidoterrestris DSM 3923细胞壁上相应的抗原靶点,具有极高的特异性。（4）以A.acidoterrestris单克隆抗体为捕获抗体,以A.acidoterrestris多克隆抗体为检测抗体,建立了苹果汁中脂环酸芽孢杆菌的间接夹心酶联免疫吸附测定（ELISA）方法,结果表明:方法中单克隆抗体与多克隆抗体最佳工作浓度分别为2.5μg/m L和2μg/m L,酶标二抗的最佳稀释度为1:4000;抗体包被最适条件为4℃过夜;5%（v/v）脱脂奶粉封闭效果最好,封闭温度为37℃,封闭时间2h;菌体抗原与两种抗体以及多克隆抗体与酶标二抗的最适反应时间均为60 min;底物显色15 min之后,方法对脂环酸芽孢杆菌的检测效果最佳,在苹果汁中的检测限达5.4×102 CFU/m L。方法能够有效地区分目标菌与非目标菌,结果重复性与稳定性良好,可以在22h内对目标菌污染量为1 CFU/m L的果汁进行有效识别。（5）以脂环酸芽孢杆菌单克隆和多克隆抗体为核心,以对苯二胺为过氧化物酶底物,同时借助荧光素钠产生荧光信号,建立了具有比色和荧光双重信号模式的免疫检测体系,并对方法的检测性能进行评价,结果表明:当体系中单克隆抗体与多克隆抗体浓度均为2.5μg/m L,酶标二抗稀释度为1:5000时,方法对果汁中的脂环酸芽孢杆菌检测效果最好,两种模式下的检测限均可达4.8×102 CFU/m L,且具有优良特异性。本方法可以在24h内有效地识别脂环酸芽孢杆菌污染浓度为1 CFU/m L果汁样品。
李月[4]（2020）在《β-内酰胺类抗生素受体和多肽类抗生素抗体的制备及快速检测方法研究》文中认为我国是畜禽养殖大国,也是抗生素使用大国。抗生素的大量使用及滥用造成其在动物源性食品中超标严重,进而引发人体过敏反应、菌群失调、抗生素耐药等。抗生素耐药是21世纪全球面临的公共问题。为防控耐药基因产生和传播,许多国家和相关机构陆续颁布“限抗,禁抗”令。为此,持续监测抗生素在食源性食品中的残留现状具有重大意义。基于纳米材料生物标记的免疫层析技术具有灵敏度高、操作简单、分析快速、设备便携低廉等优点,特别适合基层样品的快速筛查。本研究以残留严重的β-内酰胺类抗生素和耐药危害严重的多肽类抗生素为研究对象,基于β-内酰胺类药物的受体和多肽类抗生素（粘菌素、多粘菌素B和杆菌肽）的单克隆抗体,分别建立牛奶中β-内酰胺类抗生素和多肽类抗生素的广谱性快速检测技术。选择肺炎链球菌R6的PBP2x（Thr52-Asp750）、地衣芽孢杆菌ATCC14580的Bla R-CTD（Met346-Arg601）及其突变型Bla R-CTD（I188K/S19C/G24C）,和金黄色葡萄球菌NRS128的突变型Bla R-CTD（Gly331-Gln585,N439V）受体,以N端带6×组氨酸标签形式融合表达,分别为PBP2x’、Bla R-CTD（14580）、Bla R-CTD-M（14580）、Bla R-CTD-M（NRS128）。以Amp-BSA为抗原,HRP标记抗组氨酸标签抗体为二抗,利用类似于间接竞争酶联免疫吸附法鉴定得出Bla R-CTD-M（14580）亲和力最高、稳定性最好。通过优化诱导表达条件,Bla R-CTD-M（14580）在0.2 m M IPTG,20°C诱导表达18 h下,可溶性表达量达8 mg/100 m L。以Bla R-CTD-M（14580）免疫小鼠,制备单克隆抗体6B11,亲和力常数为4.5×1010L/mol。利用35 nm金纳米粒子直接标记受体蛋白Bla R-CTD-M（14580）和先标记6B11抗体再间接标记受体蛋白Bla R-CTD-M（14580）的方法,分别制备二元和三元标记物。基于该标记物分别建立牛奶和鸡肉中β-内酰胺类抗生素残留检测的胶体金层析试纸条。其中,二元标记物的试纸条能检测牛奶中除青霉素G、阿莫西林、氨苄西林、头孢氨苄、头孢羟氨苄和头孢唑啉外的18种β-内酰胺类药物,能检测鸡肉中除头孢氨苄、头孢羟氨苄和头孢唑啉外的21种β-内酰胺类药物;基于三元标记物的试纸条能检测牛奶中包括上述药物在内的33种β-内酰胺类药物,可视化检测限或消线值均小于或等于欧盟设定的最大残留限量。分别采用戊二醛、4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺交联剂合成粘菌素（COL）、多粘菌素B（PMB）和杆菌肽（Baci）的完全抗原,并免疫小鼠制备各自的单克隆抗体。其中,COL特异性抗体1C10的IC50值为2.67 ng/m L,亲和力常数为1.9×109 L/mol;PMB特异性抗体2A2的IC50值为15.26 ng/m L,亲和力常数为8.95×108 L/mol;Baci特异性抗体4B11的IC50值为18.3 ng/m L,亲和力常数为2.6×108 L/mol;此外,COL和PMB的广谱性抗体2A6,亲和力常数为4.04×1010 L/mol,对COL和PMB的IC50值分别为4.44和4.25 ng/m L。利用荧光微球分别标记Baci和COL特异性抗体,建立牛奶中Baci和COL联合检测的荧光免疫层析试纸条。Baci和COL的消线值分别为100和50 ng/m L;定量检测限分别为7.85和1.89 ng/m L,检测线性范围分别为7.85-28.42 ng/m L和1.89-5.81 ng/m L。线性范围较窄,该方法可用于COL和Baci的定性分析。另外,基于金纳米粒子标记COL和PMB的广谱性抗体,建立牛奶中COL和PMB联合检测的胶体金免疫层析试纸条。COL和PMB的消线值分别为50和100 ng/m L;定量检测限分别为0.53和0.94 ng/m L,线性范围分别为0.53-61.48 ng/m L和0.94-480.93 ng/m L。线性范围较宽,适用于COL和PMB联合定量检测。
翁鸿宇[5]（2020）在《腐败梭菌胶体金试纸条检测方法的建立及类毒素疫苗的制备和应用》文中研究说明羊快疫（Braxy）是由腐败梭菌引起的急性、致死性传染病。腐败梭菌（Clostridium septicum）是一种革兰氏阳性菌,该菌感染人和家畜引起恶性水肿,因此曾被称为恶性水肿病。羊快疫以发病急、死亡快且感染初期症状不明显为主要特征,对人类健康和畜牧业生产造成严重危害。因此,迫切需要建立一种针对羊快疫等腐败梭菌病的快速诊断方法,以便应用于基层生产,从而做到及时有效防治。同时,疫苗免疫是针对腐败梭菌病有效的预防措施,研发更加有效的疫苗对于此病的防控至关重要。因此本研究根据腐败梭菌生长繁殖特性,发明了一种新型的腐败梭菌培养方法。在此基础上,制备了腐败梭菌多克隆抗体,建立胶体金试纸条检测方法;并制备了腐败梭菌类毒素疫苗,为羊快疫的诊断和防控提供技术支持。研究内容可分为以下三个部分:1、腐败梭菌新型培养方法的建立根据腐败梭菌生长培养需要,设计腐败梭菌培养基,接种腐败梭菌参考株（ATCC12464）,并置于不同气体环境下进行培养,对不同时间下腐败梭菌增菌情况进行OD600nm测定。最终确定培养基成分和配比,并发现在一定混合气体配比条件下,且pH为7.8时,腐败梭菌菌体培养OD600nm值达到最高。本研究显示,腐败梭菌在自制培养基中菌液OD600nm可达到1.981,而在通常使用的厌气肉肝汤培养基中仅为1.055,增菌效果明显提高,此外,本研究探索出腐败梭菌在pH为7.8的条件下有较好的产毒能力。2、腐败梭菌胶体金试纸条检测方法的建立将腐败梭菌参考株（ATCC 12464）进行菌种复苏和增菌培养后,使用0.4%的甲醛将浓缩后的菌体进行灭活,并获得抗原,使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electropHoresis,SDS-PAGE）对菌体蛋白进行分析。将抗原与弗氏佐剂混合,对日本大白兔进行4次免疫,获得多克隆抗体,抗体效价可达到1:1024000,并且特异性良好。纯化后的抗体最适标记量为10μg/mL,经测定最适标记pH为8.0,胶体金-抗体结合物原液的最佳工作浓度稀释比为1:4。对腐败梭菌胶体金试纸条进行检测,显示菌液稀释6倍后,仍检测出阳性;腐败梭菌感染豚鼠血清呈阳性,而诺维氏梭菌感染豚鼠血清呈阴性,显示灵敏性和特异性良好,且临床样本检测符合预期。3、腐败梭菌类毒素疫苗的制备和应用将腐败梭菌参考株（ATCC 12464）进行菌种复苏、增菌并产毒,将外毒素粗提、灭活制成类毒素后与白油佐剂充分混合,制备腐败梭菌类毒素疫苗。此疫苗免疫小鼠21天后血清中腐败梭菌毒素抗体效价达到1:6400,且均能抵抗1个小鼠MLD攻击。以不同剂量免疫绵羊,结果表明接种3.5mL组免疫效果最佳,且在免疫后的第21天血清中腐败梭菌毒素抗体效价达到最高,并维持到第6周,说明首次免疫抗体持续时间较长。接种3.5mL腐败梭菌类毒素疫苗绵羊免疫21天后,血清小鼠中和效价达到1:600。本研究创新性地发明了新型腐败梭菌培养方法,并以此为基础,建立了腐败梭菌胶体金检测方法和腐败梭菌类毒素疫苗。经检测,腐败梭菌胶体金检测方法具有较好的特异性和灵敏性,可为羊快疫的临床诊断提供检测依据。腐败梭菌类毒素疫苗有效抗原成分高,免疫效果理想,抗体效价较高且维持时间较长。本研究为腐败梭菌培养提供了新的技术方法,为羊快疫的诊断和防控提供了理论依据和技术支持。
章钢刚[6]（2020）在《基于新型信号输出的四种免疫层析法的研究与应用》文中提出免疫层析法（Immunochromatographicassay,ICA）是结合免疫技术、层析技术和纳米材料技术发展而来的一种快速分析检测方法。该方法与常规仪器法相比有快速、简便、无需昂贵仪器、可现场检测等多种优势,传统ICA的信号输出标记物是吸收光谱型的胶体金,其灵敏度往往不高且以定性为主。提高快速检测方法的灵敏度是日益增长的现实要求。提高ICA灵敏度的方式当前主要有三类:高亲和的抗原抗体、介导信号放大和新型信号输出,其中基于新型信号输出的高灵敏ICA技术能从根本上解决传统信号低而导致的灵敏度不高的问题,是目前免疫层析领域的研究热点。本研究基于新型的信号输出形式,构建了四种新型的ICA,同时将其应用于实际检测当中,并评价了其性能。在第一章中,本研究综述了ICA发展的现状,概述了免疫层析领域的前景,以及本研究针对的靶标物（大肠杆菌O157:H7、猪霍乱沙门氏菌、人绒毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotrophin,HCG）和β2-受体激动剂）的检测现状。在第二章中,构建了基于金银双测试线（T线）的ICA,用于联检大肠杆菌O157:H7和猪霍乱沙门氏菌。本研究利用了传统免疫层析法的红色胶体金以及新型的显色型信号输出标记物一蓝色三角银作为其信号输出,通过在试纸条上喷涂两条T线的方式达到联检大肠杆菌O157:H7和猪霍乱沙门氏菌的目的。联检大肠杆菌O157:H7和猪霍乱沙门氏菌的最低检测限（Limit of detection,LOD）分别为2.16×104和1.18×105CFU/mL,因为采用的标记物均为较传统的显色型,灵敏度并不高。同时,充分利用两种标记材料的颜色差异,验证和阐释了在两种致病菌联检的双线ICA中,存在T线之间的‘干涉’现象。在第三章中,将传统的三步法合成的金花@聚多巴胺（AuNF@PDA）与一锅法制备的新型菊花金@聚多巴胺（AuNC@PDA）进行了比较。与AuNF@PDA相比,AuNC@PDA具有更多的分枝结构、更均匀的花瓣状形状和更好的粒度均一性。在溶液中,AuNC@PDA在可见光范围（400-800nm）内的吸收为AuNF@PDA的3倍;在硝酸纤维素（NC）膜上,AuNC@PDA的灰度值约是AuNF@PDA的2.5倍。这些结果表明,AuNC@PDA具有更好的形态和光学性能。采用新型的AuNC@PDA作为标记材料,与传统的AuNF@PDA应用在ICA中并进行对比分析。以HCG为检测目标物,基于AuNC@PDA和AuNF@PDA的ICA的LOD分别为1.59和5.13mlU/mL。基于AuNC@PDA的ICA的灵敏度比基于AuNF@PDA的ICA的灵敏度提高了 3倍。在第四章中,本研究基于胶体金可猝灭荧光微球的特性,将传统的显色型ICA升级为荧光型ICA,构建了一种新型的荧光猝灭ICA,用以检测β2-受体激动剂类物质。本研究通过预先在试纸条T线和C线（控制线）上喷涂并固定一定浓度的荧光微球,再以胶体金作为其猝灭剂,当待检物中存在β2-受体激动剂时,胶体金标记的抗体与之结合,不能与T线上的全抗原结合,胶体金无法滞留在T线上,因此不能猝灭T线上的荧光微球,此时T线荧光信号强;反之,当待检物中不存在β2-受体激动剂时,胶体金标记的抗体与T线上的全抗原结合,使得胶体金滞留在T线上,猝灭T线荧光,此时T线荧光信号弱。换言之,荧光猝灭ICA将传统的对小分子的竞争抑制型检测的“turn off”模式转变为更为有利的“turnon”模式,提高了检测灵敏度。以β2-受体激动剂类物质氯丙那林为检测模型,该方法LOD为0.12 ng/mL。在第五章中,本研究基于聚集诱导发光（Aggregation-inducedemission,AIE）材料,将传统荧光微球升级为新型的AIE微球,首次构建了AIE免疫层析法。本研究通过微乳液包埋法,在确保微球球体的均匀性和表面的富功能化的同时,一次性将大量的AIE染料包埋进微球,然后将其应用于免疫层析平台检测大肠杆菌O157:H7。一般地,微球的荧光发射性能与微球中包埋的荧光染料的量成正相关关系,然而单个微球包埋大量的荧光染料对于传统荧光微球是不利的,因为传统荧光染料存在聚集引发猝灭（Aggregation-caused quenching,ACQ）效应,导致传统的荧光微球性能与包埋染料的量成两难的关系。而对于AIE微球,荧光性能只与微球包埋染料的量成正相关,这就使得AIE荧光微球的荧光性能理论上可以大大强于传统荧光微球。本研究制备的AIE微球最大荧光强度是相同方法制备的传统荧光微球的9倍,量子产率是传统荧光微球的4.5倍。本研究首次将AIE荧光微球应用于ICA,检测大肠杆菌O157:H7的LOD为3.98×103 CFU/mL,比以两种商品化荧光微球（Ocean微球和Merck微球）为标记物建立的ICA的灵敏度分别提高了 11倍和7倍。在第六章中,对全文工作进行了总结,以标记物和灵敏度为脉络,梳理了本研究工作间的逻辑关系,展望了未来提高ICA灵敏度的方向与思路。
刘卫华[7]（2019）在《动物源食品中氟甲喹快速免疫检测技术的研究》文中进行了进一步梳理氟甲喹（flumequine,FLU）是一种动物专用的喹诺酮类抗生素,用于预防和治疗畜禽及水产类动物的疾病。但是,滥用或者超标使用的情况时有发生,造成动物性食品中的氟甲喹残留问题,对人类的健康造成极大的危害。世界各国都规定了动物性食品中氟甲喹残留的最大限量,作为食品安全监管的标准和依据,而建立简单、快速、高通量的检测方法也很有必要。本研究采用活泼酯法合成氟甲喹完全抗原,通过免疫动物制备了多克隆抗体,建立了氟甲喹间接竞争酶联免疫分析方法（icELISA）;建立了氟甲喹固相膜免疫分析方法;制备了氟甲喹分子印迹膜,并将其作为人工抗体,建立了直接竞争仿生酶联免疫分析方法（BELISA）。建立的icELISA法和BELISA法适于大量样品的快速定量筛查,预处理简单,操作方便快速,检测限低;固相膜免疫分析方法适于快速定性筛查,准确可靠,简便易操作。氟甲喹完全抗原的合成及多克隆抗体的制备。采用活泼酯法将FLU半抗原与载体蛋白牛血清蛋白（BSA）及卵清蛋白（OVA）偶联,制备出FLU-BSA（免疫原）和FLU-OVA（包被原）。通过紫外光谱扫描和SDS-PAGE凝胶电泳两种方法确定人工抗原成功地合成。用免疫原FLU-BSA免疫两只新西兰大耳白兔,获得抗血清（FLU-1和FLU-2）;采用间接竞争ELISA方法测定抗血清效价和亲和性,FLU-1与FLU-2效价相当（均为1:12800）,经纯化后,FLU-1抗体（IC50为0.06 ng/mL）亲和性明显高于FLU-2（IC50为0.21 ng/mL）,故选择FLU-1抗体进行后续免疫检测试验。氟甲喹残留的ELISA检测方法的建立。采用间接竞争ELISA法优化FLU的检测条件,最优条件为:包被量10 μg/mL,抗血清稀释度1:3200,封闭液为1%明胶,酶标二抗稀释度1:2500,pH值7.5,反应缓冲液是1×PBS,乙腈含量是0%～20%。在最优条件下建立间接竞争ELISA方法,该方法的IC50为2.03 ng/mL,最低检出限达1.21×10-4 ng/mL,具有比较高的准确性和灵敏度。将FLU与其结构类似物左氧氟沙星（LVX）、加替沙星（GAT）和氧氟沙星（OFX）进行交叉反应试验,交叉反应率都很低,抗体特异性好。选择牛肉、猪肉、虾肉、牛奶、熟猪肝和生猪肝作为试样,研究基质影响的消除方法。牛肉、猪肉和牛奶经过超声提取后以PBS稀释10倍,虾肉需稀释20倍,猪肝等内脏类需要稀释40倍,就可以有效地消除基质的影响。在加标回收试验中,在三个加标水平上的回收率在72.80%～97.30%之间。用HPLC法对建立的间接竞争ELISA法进行验证,其检测结果之间的拟合程度很高,相关系数R2均大于0.96,这可以说明所建立的ELISA方法准确、可靠、简便、快速,可用于动物性食品中氟甲喹残留的快速定量分析。氟甲喹残留的固相膜免疫检测方法的建立。采用柠檬酸三钠还原法制备出来胶体金,以胶体金标记FLU抗体制备出来免疫金。以硝酸纤维素（NC）膜作为固相载体,分别包被上FLU-OVA、酶标二抗作为T线、C线,对测定条件进行的优化结果是:封闭液为5%脱脂乳、酶标二抗最佳稀释倍数为40倍、包被量1.0 μg、免疫金稀释度为1:5（v/v）、金标抗体与待测溶液的混合比例为1:5（v/v）在最优条件下,制成FLU胶体金标记免疫层析固相膜,最低检出限为40 μg/L。对牛肉、猪肉、虾肉、牛奶、熟猪肝、生猪肝进行基质影响的消除试验,牛肉、猪肉、虾肉基质的提取液需用1×PBS缓冲液稀释20倍,牛奶、熟猪肝、生猪肝稀释40倍,可以消除基质的影响。加标回收试验的结果用肉眼观察即可看到有明显的梯度,说明方法有效。建立的胶体金标记固相膜免疫检测方法是一种定性检测方法,在实际的检测工作中无需仪器,目测结果即可,时间较短,适用于大批量样品的现场快速定性筛选。氟甲喹残留的BELISA检测方法的建立。通过分子动力学模拟,确定氟甲喹与甲基丙烯酸（MAA）结合的最佳摩尔比为1:2。以FLU为模板,以MAA作为功能单体,二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）作为交联剂,偶氮二异丁腈（AIBN）作为引发剂,以96孔酶标板作为固相载体,制备出了分子印迹膜（MIPs）。通过静态吸附试验和吸附动力学试验对其进行表征,结果表明分子印迹膜已经成功合成。采用活泼酯法制备酶标抗原,对BELISA反应体系的条件进行优化,确定的最优条件是:酶标抗原的稀释倍数为8000倍,pH为7.1,甲醇含量为5%的PBST缓冲液。在此条件下建立直接竞争BELISA法,该方法检测线性范围是1～100000 ng/mL,灵敏度IC50为140.62 ng/mL,检测限为1.09ng/mL。与结构类似物左氧氟沙星（LVX）、氧氟沙星（OFX）和依诺沙星（ENX）的交叉反应率分别为17.8%、17.5%和11.0%,表明该方法的特异性较高。采用直接稀释法进行基质消除,虾肉样品提取液经过20倍稀释、牛肉样品提取液经过40倍稀释后即可消除基质的干扰。三个加标水平下的回收率在80.7%～92.3%之间,这即可表明此样品前处理方法可行。通过HPLC法验证该方法的准确性,结果表明,HPLC与BELISA呈现良好的线性关系,相关系数R2在0.98以上,这说明建立的BELISA方法准确、可靠,可以用于动物性食品中氟甲喹残留的快速检测。
周丽军[8]（2019）在《RHDV抗体检测胶体金与量子点标记试纸条的试制》文中研究表明兔病毒性出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）主要引起兔的一种急性、烈性、高度传染性和高度死亡性的疾病,由于感染该病毒后会导致患兔多器官的出血充血,而将该病称为兔病毒性出血症（rabbit hemorrhagic disease,RHD）。本试验对RHDV VP60截段基因进行原核表达,基于重组蛋白对胶体金及量子点免疫层析试纸条进行初步探索研究。1.RHDV VP60截段基因的原核表达根据Gen Bank RHDV基因序列,通过RT-PCR扩增VP60基因（901bp-1740bp）,连接至p MD19-T克隆载体,经测序鉴定后,酶切、连接构建重组表达质粒p Cold TF-VP60-2,转化到大肠杆菌BL21（DE3）,经PCR、酶切以及测序鉴定后的阳性菌扩大培养,用IPTG（1 mmol/L）进行诱导表达,进行SDS-PAGE分析、Western-blotting鉴定以及亲和层析法纯化蛋白ELISA检测。结果显示重组质粒构建成功,表达的重组蛋白为82.8 k Da,并优化确定了37℃、0.2 mmol/L、诱导6 h为最佳诱导表达条件,经亲和层析法可获得5.16mg/m L纯化重组蛋白,包被重组蛋白的间接ELISA结果表明表达的重组蛋白能与兔抗RHDV抗体特异性结合,具有良好的反应原性。2.RHDV抗体检测胶体金免疫层析试纸条的试制制备兔抗重组蛋白抗体,胶体金标记重组蛋白点样金标垫,兔抗重组蛋白多克隆抗体标记C线,羊抗兔IgG标记T线,设计RHDV抗体检测试纸条,通过T线和C线抗体用量的优化,特异性和敏感性试验,初步试制了RHDV抗体检测的免疫胶体金试纸条,对5份试验免疫血清样品、5份未免疫抗体阴性血清以及临床采样154份免疫过的血清进行试验。结果显示研制的胶体金试纸条具有良好的灵敏性和特异性,其免疫血清灵敏度可达到1:16,特异性检测在兔抗RHDV血清时T线出现了红色条带,兔产气荚膜梭菌A型血清及兔巴氏杆菌等血清在T线未见显色条带,5份阳性样品全部为阳性,5份未免疫血清均为阴性,用设计的RHDV抗体试纸条检测临床采样的154份样品,结果显示150份为阳性,4份为阴性,为RHDV抗体水平监测提供一种可用的免疫试纸条。3.RHDV抗体检测的量子点免疫层析试纸条的试制量子点标记重组蛋白为金标垫,兔抗重组蛋白多克隆抗体标记C线,羊抗兔IgG标记T线,设计RHDV抗体检测试纸条,通过T线和C线抗体用量的优化,特异性和敏感性试验及样品检测应用,初步试制了可用于RHDV抗体检测的量子点免疫层析试纸条。结果显示试制的量子点免疫层析试纸条具有良好的灵敏性和特异性,其免疫血清灵敏度可达到1:32,特异性检测在兔抗RHDV血清时T线出现了荧光条带,阴性血清及兔巴氏杆菌等血清在T线未见显色条带,5份阳性样品全部为阳性,5份未免疫血清均为阴性,用设计的RHDV抗体量子点试纸条检测临床采样的154份样品,结果显示150份为阳性,4份为阴性,与胶体金免疫层析试纸条检测结果相符合,同时为量子点免疫层析试纸条进一步研制奠定了基础。
王娟芳[9]（2019）在《禽致病性大肠杆菌O1、O2、O78血清型快速检测方法建立及其应用》文中研究说明禽致病性大肠杆菌（APEC）是肠道外致病性大肠杆菌的一种,可引起鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑和鸽等禽类发病,能导致禽类的各种肠道外疾病,包括呼吸道感染、卵黄囊感染、心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、头部肿胀综合征以及败血症等。禽致病性大肠杆菌是危害家禽养殖业健康的重要病原菌之一。已有诸多研究表明禽源和人源大肠杆菌之间有较近的亲缘关系,他们在基因组结构上有很高的同源性,在遗传进化和生态分布中也有较高相似性,揭示APEC具有人畜共患的风险。因此对禽致病性大肠杆菌的快速检测具有重要意义。大肠杆菌O抗原血清型众多,但引起禽发病的血清型最主要为O1、O2和O78。为了快速检测出O1、O2和O78血清型禽致病性大肠杆菌,本研究建立了适用于实验室快速检测禽致病性大肠杆菌O1、O2、O78血清型的三重PCR方法;制备了O78血清型APEC的单克隆抗体;制备了适用于临床上快速检测O78血清型APEC的胶体金核酸层析试纸条。1.禽致病性大肠杆菌O1、O2、O78血清型三重PCR检测方法的建立及其应用分别设计O1、O2和O78血清型的特异性引物,提取O1、O2和O78血清型APEC菌株的DNA作为模板,优化三重PCR反应条件,在25μL反应体系中,各组分的最佳添加量如下:dNTP为1.5μL,MgCl2为2.5μL,Taq DNA酶为0.6μL,最佳引物比例为O1:O2:O78=0.6μL:0.2μL:0.6μL。最佳退火温度为55.9℃。用146株不同血清型大肠杆菌对三重PCR进行特异性检测的结果显示,不同血清型的大肠杆菌特异性检测准确率为99.32%（145/146）,用金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌进行特异性检测时,没有出现非特异性扩增。分别用不同浓度的DNA对三重PCR进行灵敏度检测,以单一血清型DNA为模板时,O1和O2血清型的DNA最低检测限均为0.1 ng/μL,O78血清型的DNA最低检测限为0.02 ng/μL;以O1、O2和O78混合DNA为模板时,最低检测限0.05 ng/μL。对18份临床模拟样品进行检测,准确率为94.4%（17/18）。2.禽致病性大肠杆菌O78血清型单克隆抗体制备为建立能够在临床上对APEC的进行快速初筛的胶体金免疫层析方法,本研究制备了针对O78血清型APEC的单克隆抗体。根据O78血清型APEC的特异性基因,设计了含NdeI和XbaI酶切位点的特异性引物,扩增了目的片段,通过酶切、连接,构建了 pCznl-AGC87681.1重组质粒,并转化入大肠杆菌Arctic Express感受态细胞中,IPTG低温诱导表达O78蛋白。对表达在包涵体沉淀中的蛋白进行复性,并纯化蛋白。以纯化后的O78蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合、筛选和亚克隆,最终得到2株阳性单克隆细胞株,命名为2D3和8B4,单抗效价均达到1:512000,但不同血清型之间有明显的交叉反应,故不适用于制备特异性检测O78血清型APEC的胶体金免疫层析试纸条。下一步试验可根据制得的单抗用噬菌体肽库筛选出特异性的多肽以建立其他检测方法。3.禽致病性大肠杆菌O78血清型胶体金核酸层析试纸条的研制及其应用为了能够在临床上快速检测出O78血清型APEC,我们结合PCR和胶体金免疫层析技术,制备了一种特异性检测O78血清型APEC的胶体金核酸层析试纸条。根据O78血清型APEC的特异性基因设计引物,上下游引物分别用FITC和DIG修饰后进行PCR扩增,得到带有FITC和DIG双标记的PCR产物,并用制备的胶体金核酸层析试纸条进行检测。采用柠檬酸三钠还原法制备了粒径为15-20nm的胶体金溶液,取4μL 1mg/mL的FITC抗体偶联1mL胶体金溶液,0.5%明胶为封闭液,制备了金标抗体。NC膜上的T线和C线分别标记地高辛抗体和羊抗鼠二抗。制备的胶体金核酸层析试纸条灵敏度为102CFU/mL,用17株非O78血清型的大肠杆菌对试纸条的特异性进行检测,结果T线均不显现条带,说明胶体金核酸层析试纸条的特异性好。对加入不同浓度O78血清型APEC的血清样品进行检测,最低能检测到102 CFU/mL。利用这种胶体金核酸层析试纸条,可以在没有任何复杂的仪器或专业人员的情况下实现O78血清型APEC的快速和现场检测。
滕军[10]（2019）在《食品中大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲菌快速检测新方法研究》文中研究表明食品安全问题是一个日益突出的社会问题,它关系到我国千千万万人民群众切身利益,关注食品安全势在必行。食源性致病菌是目前最常见的,有巨大危害性并且影响广泛的食品污染因素。因此,建立便捷、快速和灵敏的食源性致病菌检测方法对预防食品安全问题的发生和保护人类健康具有重要意义。大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲菌作为常见的食源性致病菌,本文介绍了以下几种检测大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲菌的方法:（1）基于分子扩增原理的死、活菌鉴定方法的建立将叠氮溴化丙锭（PMA）与食源性致病菌细胞孵育,正常情况下PMA不能透过完整的细胞膜,而对于死亡的细胞,其细胞膜上有退化或结构有损坏,所以PMA会选择性地进入死亡细胞的内部与其DNA结合。再将用PMA处理过的食源性致病菌样品暴露在特殊强光下一定时间,PMA会嵌入DNA分子的双链中致使DNA分子的永久修饰。并且这种DNA的共价修饰会抑制聚合酶的活性,进而阻断DNA分子的聚合酶链式反应（PCR）,因此来自非存活或者膜受损细胞的DNA则无法通过PCR进行扩增。经过实验条件的优化,使用终浓度为5μg/mL的PMA与食源性致病菌样品孵育5分钟后在500 W卤素灯下曝光5分钟,可以使PMA对DNA的PCR扩增起到最大抑制作用。利用该方法可以判断食源性致病菌的死活状态,并为进一步选择和建立食源性致病菌的检测方法做铺垫。（2）基于磁性富集增敏型侧向层析试纸条检测大肠杆菌O157:H7的研究基于抗原抗体的免疫识别,在金纳米粒子（AuNPs）表面标记大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体作为识别探针结合细菌,再被检测线（T线）上固定的另一株大肠杆菌O157:H7抗体捕获形成双抗夹心结构,金纳米粒子被固定在T线上使其显线,标记了抗体的金纳米粒子被固定在质控线（C线）上的羊抗鼠二抗捕获,从而C线显线。通过肉眼观察T线的显色强度初步定量分析待测样品中大肠杆菌O157:H7的浓度。在此基础上,增加一步利用标记大肠杆菌O157:H7抗体的磁性纳米粒子（MNPs）对待测样品进行磁性富集,然后再应用胶体金免疫侧向层析试纸条进行检测。在最优实验条件下,传统型侧向层析试纸条的检测灵敏度可以达到4.1×104cfu/mL,相比之下,磁性富集增敏型侧向层析试纸条将检测灵敏度提高100至1000倍,肉眼可以检测到101 cfu/mL的大肠杆菌O157:H7,同时具有良好的检测线性和检测特异性。（3）基于PCR技术的大肠杆菌O157:H7毒力基因检测研究毒力基因,作为细菌DNA中特定的片段,每一种细菌都有其独有的毒力基因,因此可以在分子层面检测毒力基因,从而实现对特定细菌的检测。基于此,我们首先利用磁性纳米粒子提取出大肠杆菌O157:H7的DNA,再利用针对大肠杆菌O157:H7毒力基因（rfb）的特异引物对其进行PCR扩增。最后应用琼脂糖凝胶电泳表征PCR产物,通过肉眼观察目标产物电泳条带的强度初步定量分析待测样品中大肠杆菌O157:H7的浓度。经过实验条件的优化,PCR扩增可以检测到3×102cfu/mL大肠杆菌O157:H7,同时具有良好的检测特异性。（4）基于侧向层析荧光试纸条检测大肠杆菌O157:H7毒力基因的研究基于抗原抗体免疫识别和链霉亲和素（SAV）与生物素（biotin）的特异识别,在毒力基因正反向特异引物的5’端分别修饰生物素和异硫氰酸荧光素（FITC）,再应用PCR对毒力基因进行扩增,得到两端分别标记有biotin和FITC的产物。将PCR产物滴加到荧光试纸条上进行检测,PCR产物会先结合表面标记FITC抗体的荧光微球,再被T线上固定的SAV捕获,紫外光照射下T线显线。标记了FITC抗体的荧光微球被固定在C线上的羊抗鼠二抗捕获,紫外光照射下C线显线。通过肉眼观察T线的荧光强度可以初步定量分析待测样品中大肠杆菌O157:H7的浓度。在最优实验条件下,侧向层析荧光试纸条在标准样品和实际样品中可以分别检测到3 cfu/mL和3×101 cfu/mL的大肠杆菌O157:H7,与琼脂糖凝胶电泳结果相比,该方法将检测灵敏度提高了2个数量级,同时具有良好的检测线性和检测特异性。（5）基于异质识别体系的夹心法平板比色检测空肠弯曲菌研究基于经典的全菌SELEX方法首次筛选出空肠弯曲菌的核酸适配体,再利用所选核酸适配体和空肠弯曲菌的抗体,构建抗体-适配体异质识别体系的夹心法平板比色检测空肠弯曲菌。通过形成夹心结构,辣根过氧化物酶（HRP）被固定到微孔中,最后加入TMB显色底物进行显色反应,肉眼观察微孔中液体的颜色变化可以初步定量分析待测样品中空肠弯曲菌的浓度。然后用浓硫酸终止反应,在应用酶标仪测量微孔中液体的光学强度值可以定量分析待测样品中空肠弯曲菌的浓度。经过筛选和分析,得到序列A1（5’-CTGCGATCAAGTTACGCACCTCGCCATGTT CCCCGCCCGGCATGTGTTATGCCCCTGTG-3’）与空肠弯曲菌有最好的结合能力,所以选择序列A1作为空肠弯曲菌的核酸适配体。在最优实验条件下,异质识别体系的夹心法可以检测到13 cfu/mL的空肠弯曲菌,同时具有良好的检测线性和检测特异性。这也进一步说明该研究中所筛选出的空肠弯曲菌核酸适配体具有良好的性能。
二、应用胶体金免疫层析技术建立炭疽杆菌芽孢的快速检测方法（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用胶体金免疫层析技术建立炭疽杆菌芽孢的快速检测方法（论文提纲范文）
（1）食源性致病微生物检测技术研究进展（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 食源性致病微生物的分类 |
| 2 食源性致病微生物检测技术 |
| 2.1 传统分离鉴定法 |
| 2.2 基于免疫的检测方法 |
| 2.2.1 酶联免疫吸附法 |
| 2.2.2 免疫层析法 |
| 2.2.3 其他免疫检测技术 |
| 2.3 基于核酸的检测方法 |
| 2.3.1 聚合酶链式反应及其衍生技术 |
| 2.3.2 依赖核酸序列扩增技术 |
| 2.3.3 环介导等温扩增技术 |
| 2.3.4 重组酶聚合酶扩增技术与重组酶介导扩增技术 |
| 2.3.5 CRISPR技术 |
| 2.3.6 DNA微阵列 |
| 2.4 生物传感器 |
| 2.4.1 光学生物传感器 |
| 2.4.2 电化学生物传感器 |
| 2.4.3 压电生物传感器 |
| 3 总结与展望 |
（2）CRISPR/Cas12a系统在新冠病毒和金黄色葡萄球菌即时检测中的应用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 致病微生物的危害与现状 |
| 1.1.1 传染性病毒简介 |
| 1.1.2 食源性致病细菌简介 |
| 1.2 致病微生物的检测技术 |
| 1.2.1 SARS-CoV-2 |
| 1.2.2 金黄色葡萄球菌 |
| 1.3 即时检测 |
| 1.3.1 即时检测概述 |
| 1.3.2 即时检测技术分类 |
| 1.4 基于CRISPR/Cas检测技术简介 |
| 1.4.1 CRISPR/Cas系统简介 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas检测技术 |
| 1.5 论文的研究意义及内容 |
| 2 基于CRISPR/Cas12a技术的SARS-CoV-2荧光检测平台 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要病毒株 |
| 2.2.2 实验仪器与设备 |
| 2.2.3 实验材料和试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 样品处理及病毒RNA提取 |
| 2.3.2 检测靶标的选择、引物的设计 |
| 2.3.3 crRNA的设计与转录 |
| 2.3.4 CRISPR/Cas12a的反式切割活性验证 |
| 2.3.5 CRISPR/Cas12a检测反应体系的优化 |
| 2.3.6 CRISPR/Cas12a检测的可行性研究及最优检测位点的选择 |
| 2.3.7 SARS-CoV-2 CRISPR-fluorescence检测方法的建立与灵敏度表征 |
| 2.3.8 临床样本的CRISPR-fluorescence检测 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 CRISPR/Cas12a的反式切割活性验证 |
| 2.4.2 CRISPR/Cas12a检测反应体系的优化 |
| 2.4.3 CRISPR/Cas12a检测体系最优检测位点的选择 |
| 2.4.4 SARS-CoV-2 CRISPR-fluorescence检测方法的建立与灵敏度表征 |
| 2.4.5 临床样本的CRISPR-fluorescence检测 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 基于CRISPR/Cas12a技术的金黄色葡萄球菌荧光检测平台 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要菌株 |
| 3.2.2 实验仪器与设备 |
| 3.2.3 主要培养基 |
| 3.2.4 主要药品和试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 菌种保藏、活化和培养 |
| 3.3.2 金黄色葡萄球菌计数方法 |
| 3.3.3 样品处理 |
| 3.3.4 特异性靶标的选择、引物的设计 |
| 3.3.5 crRNA的设计与转录 |
| 3.3.6 CRISPR/Cas12a的顺式切割活性验证 |
| 3.3.7 CRISPR/Cas12a的反式切割活性验证 |
| 3.3.8 基于PCR的CRISPR-fluorescence检测方法的建立及灵敏度表征 |
| 3.3.9 基于RAA的CRISPR-fluorescence检测方法的建立及灵敏度表征 |
| 3.3.10 金黄色葡萄球菌CRISPR-fluorescence检测系统灵敏度试验 |
| 3.3.11 人工金黄色葡萄球菌污染牛奶的检测系统构建及灵敏度表征 |
| 3.3.12 其他人工污染食品检测 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 CRISPR/Cas12a的顺式切割活性验证 |
| 3.4.2 CRISPR/Cas12a的反式切割活性验证 |
| 3.4.3 基于PCR的CRISPR-fluorescence检测方法的建立及灵敏度表征 |
| 3.4.4 基于RAA的CRISPR-fluorescence检测方法的建立及灵敏度表征 |
| 3.4.5 金黄色葡萄球菌CRISPR-fluorescence检测系统灵敏度试验 |
| 3.4.6 人工金黄色葡萄球菌污染牛奶的检测系统构建及灵敏度表征 |
| 3.4.7 其他人工污染食品的CRISPR-fluorescence检测 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 基于CRISPR/Cas12a技术的金黄色葡萄球菌POCT检测平台 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要菌株 |
| 4.2.2 实验仪器与设备 |
| 4.2.3 主要培养基 |
| 4.2.4 主要药品和试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 菌种保藏、活化和培养 |
| 4.3.2 金黄色葡萄球菌计数方法 |
| 4.3.3 样品处理 |
| 4.3.4 特异性靶标的选择、引物的设计 |
| 4.3.5 crRNA的设计与转录 |
| 4.3.6 胶体金试纸条的反应条件优化 |
| 4.3.7 金黄色葡萄球菌CRISPR-LF检测方法的建立及灵敏度表征 |
| 4.3.8 金黄色葡萄球菌CRISPR-LF检测方法的特异性表征 |
| 4.3.9 人工金黄色葡萄球菌污染牛奶的CRISPR-LF检测系统构建及灵敏度表征 |
| 4.3.10 其他人工污染食品检测 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 胶体金试纸条反应条件的优化 |
| 4.4.2 金黄色葡萄球菌CRISPR-LF检测方法的建立及灵敏度表征 |
| 4.4.3 金黄色葡萄球菌CRISPR-LF检测方法的特异性表征 |
| 4.4.4 人工金黄色葡萄球菌污染牛奶的CRISPR-LF检测系统构建及灵敏度表征 |
| 4.4.5 其他人工污染食品的CRISPR-LF检测 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者攻读硕士学位期间发表论文 |
（3）脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备及免疫检测方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 脂环酸芽孢杆菌简介 |
| 1.1.1 脂环酸芽孢杆菌的发现历史 |
| 1.1.2 脂环酸芽孢杆菌的特性 |
| 1.1.3 脂环酸芽孢杆菌的分布 |
| 1.1.4 脂环酸芽孢杆菌的危害 |
| 1.2 脂环酸芽孢杆菌的检测方法 |
| 1.2.1 脂环酸芽孢杆菌及其芽孢的检测 |
| 1.2.2 脂环酸芽孢杆菌代谢物的检测 |
| 1.3 抗体研究进展 |
| 1.3.1 多克隆抗体 |
| 1.3.2 单克隆抗体 |
| 1.3.3 基因工程抗体 |
| 1.4 免疫分析方法研究进展 |
| 1.4.1 放射免疫分析 |
| 1.4.2 荧光免疫分析 |
| 1.4.3 酶联免疫吸附分析 |
| 1.4.4 胶体金免疫技术 |
| 1.4.5 化学发光免疫分析 |
| 1.4.6 免疫传感器 |
| 1.5 选题背景与研究内容 |
| 1.5.1 选题背景与依据 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 1.5.3 技术路线图 |
| 第二章 脂环酸芽孢杆菌细胞壁特异蛋白鉴定 |
| 2.1 试验材料、试剂和设备 |
| 2.1.1 供试菌株及培养基 |
| 2.1.2 试验材料 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.1.4 主要试剂溶液配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 细菌培养 |
| 2.2.2 A.acidoterrestris细胞壁蛋白的提取 |
| 2.2.3 A.acidoterrestris细胞壁蛋白的纯化 |
| 2.2.4 双向电泳 |
| 2.2.5 Western blot |
| 2.2.6 胶内酶解 |
| 2.2.7 MALDI-TOF MS鉴定 |
| 2.2.8 生物信息学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 A.acidoterrestris细胞壁蛋白双向电泳图谱 |
| 2.3.2 A.acidoterrestris细胞壁蛋白免疫原性分析 |
| 2.3.3 免疫原性蛋白的质谱鉴定 |
| 2.3.4 蛋白功能分析 |
| 2.3.5 蛋白相互作用预测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 脂环酸芽孢杆菌免疫原性蛋白的原核表达 |
| 3.1 试验材料、试剂和设备 |
| 3.1.1 菌株与质粒 |
| 3.1.2 试验材料 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.1.4 主要试剂溶液配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 A.acidoterrestris免疫原性蛋白相关基因的克隆 |
| 3.2.2 A.acidoterrestris免疫原性蛋白的原核表达 |
| 3.2.3 重组蛋白的纯化 |
| 3.2.4 重组蛋白免疫原性的验证 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 目的基因的扩增 |
| 3.3.2 重组表达载体的构建 |
| 3.3.3 融合蛋白的原核表达 |
| 3.3.4 融合蛋白的纯化 |
| 3.3.5 融合蛋白免疫原性的验证 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备 |
| 4.1 试验材料、试剂和设备 |
| 4.1.1 供试菌株、实验动物及细胞株 |
| 4.1.2 试验材料 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.1.4 主要试剂溶液配制 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 小鼠免疫 |
| 4.2.2 间接ELISA测定血清效价 |
| 4.2.3 细胞融合 |
| 4.2.4 选择性培养 |
| 4.2.5 杂交瘤细胞的筛选与亚克隆 |
| 4.2.6 杂交瘤细胞的扩大培养与冻存和复苏 |
| 4.2.7 单克隆抗体的大量制备 |
| 4.2.8 单克隆抗体的纯化 |
| 4.2.9 单克隆抗体的鉴定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 动物免疫 |
| 4.3.2 杂交瘤细胞株的筛选 |
| 4.3.3 单克隆抗体亚型鉴定 |
| 4.3.4 单克隆抗体效价测定 |
| 4.3.5 SDS-PAGE鉴定纯化后的单克隆抗体 |
| 4.3.6 Western blot验证抗体特异性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 脂环酸芽孢杆菌间接夹心ELISA的建立与评价 |
| 5.1 试验材料、试剂和设备 |
| 5.1.1 供试菌株 |
| 5.1.2 试验材料 |
| 5.1.3 仪器设备 |
| 5.1.4 主要试剂溶液配制 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 间接夹心ELISA实验流程 |
| 5.2.2 间接夹心ELISA最适参数的优化 |
| 5.2.3 间接夹心ELISA性能的评价 |
| 5.2.4 人为污染果汁中脂环酸芽孢杆菌的检测 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 间接夹心ELISA最适条件优化 |
| 5.3.2 间接夹心ELISA性能的评价 |
| 5.3.3 人为污染苹果汁的检测 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 基于比色和荧光双模式的脂环酸芽孢杆菌免疫检测方法的建立与评价 |
| 6.1 试验材料、试剂和设备 |
| 6.1.1 供试菌株 |
| 6.1.2 试验材料 |
| 6.1.3 仪器设备 |
| 6.1.4 主要试剂溶液配制 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 双通道免疫检测体系的可行性 |
| 6.2.2 双通道免疫检测体系实验流程 |
| 6.2.3 双通道免疫检测体系最适参数的优化 |
| 6.2.4 方法性能的评价 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 双通道免疫检测体系的建立 |
| 6.3.2 双通道免疫检测体系最适参数的优化 |
| 6.3.3 双通道免疫检测体系性能评价 |
| 6.3.4 人为污染苹果汁中A.acidoterrestris的检测 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 结论、创新点和展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）β-内酰胺类抗生素受体和多肽类抗生素抗体的制备及快速检测方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 立题背景 |
| 1.1.1 抗生素残留现状 |
| 1.1.2 抗生素残留危害 |
| 1.1.3 抗生素监管 |
| 1.2 β-内酰胺类抗生素概述 |
| 1.2.1 β-内酰胺类抗生素简介 |
| 1.2.2 理化性质 |
| 1.2.3 作用机制 |
| 1.2.4 限量要求 |
| 1.2.5 检测方法 |
| 1.2.6 青霉素结合蛋白(PBPs) |
| 1.3 多肽类抗生素概述 |
| 1.3.1 理化性质 |
| 1.3.2 作用机制 |
| 1.3.3 使用及危害 |
| 1.3.4 限量要求 |
| 1.3.5 检测方法 |
| 1.4 本课题的主要研究内容 |
| 第二章 β-内酰胺类抗生素受体结合蛋白的制备与鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 试剂与材料 |
| 2.2.2 仪器与设备 |
| 2.2.3 培养基与主要溶液 |
| 2.3 实验方法与步骤 |
| 2.3.1 表达质粒设计与构建 |
| 2.3.2 受体蛋白表达与纯化 |
| 2.3.3 受体蛋白表达鉴定 |
| 2.3.4 受体蛋白活性鉴定 |
| 2.3.5 受体蛋白稳定性评估 |
| 2.3.6 受体蛋白表达优化 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 受体蛋白表达鉴定 |
| 2.4.2 抗原合成表征 |
| 2.4.3 重组受体蛋白活性鉴定 |
| 2.4.4 受体蛋白稳定性评估 |
| 2.4.5 受体蛋白诱导条件优化 |
| 2.5 结果讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 基于受体的β-内酰胺类抗生素免疫层析检测方法研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 试剂与材料 |
| 3.2.2 仪器与设备 |
| 3.2.3 主要溶液 |
| 3.3 实验方法与步骤 |
| 3.3.1 金纳米粒子标记受体 |
| 3.3.2 基于受体建立胶体金层析试纸条 |
| 3.3.3 受体试纸条检测原理与步骤 |
| 3.3.4 实际样本检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 金标受体的制备 |
| 3.4.2 试纸条检测条件优化 |
| 3.4.3 实际样本检测 |
| 3.5 结果讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 基于受体抗体的β-内酰胺类抗生素免疫层析检测方法研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 试剂与材料 |
| 4.2.2 仪器与设备 |
| 4.2.3 实验动物与细胞 |
| 4.2.4 主要溶液 |
| 4.3 实验方法与步骤 |
| 4.3.1 小鼠免疫 |
| 4.3.2 抗血清检测 |
| 4.3.3 细胞融合与单克隆杂交瘤细胞筛选 |
| 4.3.4 单克隆抗体制备 |
| 4.3.5 抗体鉴定 |
| 4.3.6 基于受体抗体建立胶体金层析试纸条 |
| 4.3.7 实际样本检测 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 抗血清检测 |
| 4.4.2 抗体鉴定 |
| 4.4.3 金纳米粒子-抗体-受体标记物的制备 |
| 4.4.4 试纸条检测条件优化 |
| 4.4.5 实际样本检测 |
| 4.4.6 方法验证 |
| 4.5 结果讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 多肽类抗生素的抗体制备与鉴定 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与设备 |
| 5.2.1 试剂与材料 |
| 5.2.2 仪器与设备 |
| 5.2.3 实验动物与细胞 |
| 5.2.4 主要溶液 |
| 5.3 实验方法与步骤 |
| 5.3.1 完全抗原的制备与表征 |
| 5.3.2 小鼠免疫 |
| 5.3.3 抗血清检测 |
| 5.3.4 细胞融合与单克隆杂交瘤细胞筛选 |
| 5.3.5 单克隆抗体制备 |
| 5.3.6 抗体鉴定 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 完全抗原鉴定 |
| 5.4.2 抗血清检测 |
| 5.4.3 细胞筛选 |
| 5.4.4 抗体鉴定 |
| 5.5 结果讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 多肽类抗生素的多残留免疫层析检测方法研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与设备 |
| 6.2.1 试剂与材料 |
| 6.2.2 仪器与设备 |
| 6.2.3 主要溶液 |
| 6.3 实验方法与步骤 |
| 6.3.1 COL-Baci联合检测的FICA建立 |
| 6.3.2 COL-PMB联合检测的GICA建立 |
| 6.3.3 实际样本检测 |
| 6.4 实验结果与讨论 |
| 6.4.1 COL-Baci联合检测的FICA建立 |
| 6.4.2 COL-PMB联合检测的GICA建立 |
| 6.5 结果讨论 |
| 6.6 本章小结 |
| 主要结论 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间发表成果 |
（5）腐败梭菌胶体金试纸条检测方法的建立及类毒素疫苗的制备和应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 腐败梭菌研究概况 |
| 1.1.1 腐败梭菌简介 |
| 1.1.2 腐败梭菌生长特性 |
| 1.1.3 腐败梭菌致病机制 |
| 1.1.4 腐败梭菌α毒素 |
| 1.2 羊快疫概述 |
| 1.2.1 羊快疫简介 |
| 1.2.2 羊快疫的诊断 |
| 1.2.3 羊快疫的预防和治疗 |
| 1.3 胶体金免疫层析试纸条 |
| 1.3.1 胶体金层析技术简介 |
| 1.3.2 胶体金层析技术原理 |
| 1.3.3 胶体金免疫层析试纸条的分类 |
| 1.3.4 胶体金层析技术的应用 |
| 1.4 羊快疫疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 制苗培养基及培养方法 |
| 1.4.2 制苗佐剂研究概况 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物、菌株及血清 |
| 2.1.2 实验所需试剂、材料及引物 |
| 2.1.3 主要试剂的配制方法 |
| 2.1.4 主要试验仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 腐败梭菌培养条件的摸索 |
| 2.2.1.1 腐败梭菌培养基的选择 |
| 2.2.1.2 腐败梭菌培养环境的选择 |
| 2.2.1.3 腐败梭菌培养最适pH摸索 |
| 2.2.1.4 腐败梭菌产毒条件摸索 |
| 2.2.2 腐败梭菌多克隆抗体的制备 |
| 2.2.2.1 腐败梭菌菌体总蛋白的获取 |
| 2.2.2.2 腐败梭菌多克隆抗体免疫过程 |
| 2.2.2.3 兔血清抗体效价检测 |
| 2.2.2.4 抗体的纯化 |
| 2.2.2.5 纯化后抗体效价检测 |
| 2.2.3 腐败梭菌胶体金试纸条的制备 |
| 2.2.3.1 抗体标记最适pH的选择 |
| 2.2.3.2 抗体最适标记量的选择 |
| 2.2.3.3 胶体金探针的制备和纯化 |
| 2.2.3.4 结合物原液工作浓度的确定和金标垫的制备 |
| 2.2.3.5 检测线(T线)及质控线(C线)条件的建立及点膜 |
| 2.2.3.6 胶体金试纸条组装 |
| 2.2.3.7 胶体金试纸条结果判定 |
| 2.2.4 腐败梭菌胶体金试纸条的检测试验 |
| 2.2.4.1 灵敏性检测 |
| 2.2.4.2 特异性检测 |
| 2.2.4.3 重复性检测 |
| 2.2.4.4 临床样本的检测 |
| 2.2.5 腐败梭菌类毒素疫苗的制备 |
| 2.2.5.1 腐败梭菌外毒素的获取 |
| 2.2.5.2 外毒素小鼠最小致死量(MLD)的测定 |
| 2.2.5.3 外毒素的灭活及检验 |
| 2.2.5.4 白油佐剂类毒素疫苗的制备 |
| 2.2.5.5 疫苗的初步检验 |
| 2.2.5.6 疫苗的安全检验 |
| 2.2.6 腐败梭菌类毒素疫苗免疫保护性试验 |
| 2.2.6.1 类毒素疫苗免疫小鼠攻毒试验 |
| 2.2.6.2 类毒素疫苗免疫小鼠的抗体水平检测 |
| 2.2.6.3 绵羊接种剂量的摸索 |
| 2.2.6.4 小鼠中和试验检测绵羊血清抗体 |
| 3 结果 |
| 3.1 腐败梭菌培养条件摸索 |
| 3.1.1 腐败梭菌培养基的选择 |
| 3.1.2 不同培养环境的选择 |
| 3.1.3 培养最适pH的摸索 |
| 3.1.4 腐败梭菌产毒条件摸索 |
| 3.2 腐败梭菌胶体金试纸条的制备 |
| 3.2.1 腐败梭菌菌体蛋白的获取 |
| 3.2.1.1 腐败梭菌菌液PCR鉴定 |
| 3.2.1.2 腐败梭菌菌体蛋白检测 |
| 3.2.2 高免血清中抗体效价的检测 |
| 3.2.3 纯化后抗体检测 |
| 3.2.4 抗体标记最适pH的选择 |
| 3.2.5 抗体最适标记量的选择 |
| 3.2.6 胶体金探针的制备和纯化 |
| 3.2.7 结合物原液工作浓度的确定和NC膜型号的选择 |
| 3.2.8 检测线(T线)及质控线(C线)条件的建立和优化 |
| 3.2.9 腐败梭菌胶体金试纸条的检测结果 |
| 3.2.9.1 灵敏性检测 |
| 3.2.9.2 特异性检测 |
| 3.2.9.3 重复性试验 |
| 3.2.9.4 临床样本的检测 |
| 3.3 腐败梭菌类毒素疫苗的制备 |
| 3.3.1 腐败梭菌外毒素的鉴定 |
| 3.3.2 小鼠致死量(MLD)的测定 |
| 3.3.3 外毒素的灭活和检验 |
| 3.3.4 腐败梭菌类毒素疫苗的物理性质检验 |
| 3.3.5 腐败梭菌类毒素疫苗的安全检验 |
| 3.3.5.1 无菌检验 |
| 3.3.5.2 甲醛、硫柳汞残留量的检验 |
| 3.3.5.3 安全性检验 |
| 3.3.6 疫苗免疫效果的初步检测 |
| 3.3.6.1 类毒素疫苗免疫小鼠攻毒试验 |
| 3.3.6.2 类毒素疫苗免疫小鼠的抗体水平检测 |
| 3.3.7 绵羊接种剂量的摸索 |
| 3.3.8 小鼠中和试验检测抗体 |
| 4 讨论 |
| 4.1 腐败梭菌培养条件的摸索 |
| 4.2 腐败梭菌胶体金试纸条检测方法的建立 |
| 4.3 腐败梭菌类毒素疫苗的制备和应用 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间论文发表情况 |
（6）基于新型信号输出的四种免疫层析法的研究与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 显色型ICA |
| 1.1.1 胶体金ICA |
| 1.1.2 碳纳米颗粒ICA |
| 1.2 荧光型ICA |
| 1.2.1 有机染料荧光微球ICA |
| 1.2.2 量子点ICA |
| 1.2.3 量子点微球ICA |
| 1.2.4 上转换荧光ICA |
| 1.3 其它型ICA |
| 1.3.1 磁ICA |
| 1.3.2 表面增强拉曼散射ICA |
| 1.4 大肠杆菌O157:H7和猪霍乱沙门氏菌检测现状 |
| 1.4.1 培养法 |
| 1.4.2 聚合酶链式反应 |
| 1.4.3 酶联免疫吸附法 |
| 1.4.4 ICA |
| 1.5 人绒毛膜促性腺激素检测现状 |
| 1.5.1 胶乳凝集抑制试验 |
| 1.5.2 酶联免疫吸附法 |
| 1.5.3 电化学发光法 |
| 1.5.4 ICA |
| 1.6 β_2-受体激动剂检测现状 |
| 1.6.1 气相色谱-质谱法 |
| 1.6.2 高效液相色谱法 |
| 1.6.3 酶联免疫吸附法 |
| 1.6.4 ICA |
| 1.7 结语 |
| 1.8 参考文献 |
| 第2章 基于金银双T线免疫层析法联检大肠杆菌O157:H7和猪霍乱沙门氏菌 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 主要试剂及材料 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.2.3 主要试剂的配制与制备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 致病菌及其培养条件 |
| 2.3.2 金纳米球(AuNS)和银三角片(AgNP)的合成 |
| 2.3.3 免疫探针金标抗体(Au-mAb)和银标抗体(Ag-MUA-mAb)的制备 |
| 2.3.4 金银双T线试纸条的制备 |
| 2.3.5 建立金银双T线免疫层析法检测大肠杆菌O157:H7和猪霍乱沙门氏菌 |
| 2.3.6 特异性实验 |
| 2.3.7 实际样本中的加标回收实验 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 AuNS和AgNP的表征 |
| 2.4.2 探针(Au-mAb和Ag-MUA-mAb)的制备 |
| 2.4.3 基于金银双T线免疫层析法的建立 |
| 2.4.4 验证方法的特异性 |
| 2.4.5 实际样本的检测 |
| 2.4.6 多T线“干涉”现象的发现与研究 |
| 2.5 小结 |
| 2.6 参考文献 |
| 第3章 基于菊花金@聚多巴胺免疫层析法检测人血清中绒毛膜促性腺激素 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 主要试剂及材料 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.2.3 主要试剂的配制与制备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 菊花金@聚多巴胺(AuNC@PDA)的合成 |
| 3.3.2 金花@聚多巴胺(AuNF@PDA)的合成 |
| 3.3.3 AuNC@PDA-mAb和AuNF@PDA-mAb的制备 |
| 3.3.4 免疫层析试纸条的制备 |
| 3.3.5 ICA检测HCG |
| 3.3.6 特异性实验 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 AuNC@PDA和AuNF@PDA的形貌对比 |
| 3.4.2 AuNC@PDA与AuNF@PDA的光学性能对比 |
| 3.4.3 ICA上的应用 |
| 3.5 小结 |
| 3.6 参考文献 |
| 第4章 基于荧光猝灭免疫层析法检测β_2-受体激动剂 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 主要试剂及材料 |
| 4.2.2 主要仪器设备 |
| 4.2.3 主要试剂的配制与制备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 金纳米球(AuNS)的合成 |
| 4.3.2 制备金标抗体(Au-mAb) |
| 4.3.3 制备可固定荧光微球(BSA-FM) |
| 4.3.4 试纸条的制备 |
| 4.3.5 单抗标记量的优化 |
| 4.3.6 免疫学反应动力学曲线 |
| 4.3.7 荧光猝灭免疫层析法的建立 |
| 4.3.8 交叉反应 |
| 4.3.9 实际样本中的检测 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 探针的制备和优化 |
| 4.4.2 动力学曲线分析 |
| 4.4.3 建立标准曲线 |
| 4.4.4 交叉反应结果 |
| 4.4.5 实际样本检测 |
| 4.5 小结 |
| 4.6 参考文献 |
| 第5章 聚集诱导发光免疫层析法的建立 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与仪器 |
| 5.2.1 主要试剂及材料 |
| 5.2.2 主要仪器设备 |
| 5.2.3 主要试剂的配制与制备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 致病菌及其培养条件 |
| 5.3.2 传统染料荧光素的甲基化改性 |
| 5.3.3 微乳液一锅法制备荧光微球 |
| 5.3.4 单微球染料装载量的测定 |
| 5.3.5 免疫探针的制备 |
| 5.3.6 免疫层析试纸条的制备 |
| 5.3.7 基于聚集诱导发光免疫层析法检测大肠杆菌O157:H7 |
| 5.3.8 特异性实验 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 传统荧光染料荧光素的疏水化改性 |
| 5.4.2 两种染料的性能表征 |
| 5.4.3 制备的两类荧光微球(AIEFM和DMFFM)的材料表征 |
| 5.4.4 单微球装载量的确定 |
| 5.4.5 荧光微球性能的比较 |
| 5.4.6 聚集诱导发光免疫层析法的建立 |
| 5.5 小结 |
| 5.6 参考文献 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.1.1 基于金银双T线免疫层析法联检大肠杆菌O157:H7和猪霍乱沙门氏菌 |
| 6.1.2 基于菊花金@聚多巴胺免疫层析法检测人血清中绒毛膜促性腺激素 |
| 6.1.3 基于荧光猝灭免疫层析法检测β_2-受体激动剂 |
| 6.1.4 聚集诱导发光免疫层析法的建立 |
| 6.2 展望 |
| 致谢 |
| 个人介绍 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 获奖情况 |
（7）动物源食品中氟甲喹快速免疫检测技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 研究目的与意义 |
| 1.1.1 动物性食品安全与兽药残留 |
| 1.1.2 氟甲喹概述 |
| 1.1.3 研究意义 |
| 1.2 喹诺酮类及氟甲喹检测方法的研究进展 |
| 1.2.1 喹诺酮类检测方法的研究进展 |
| 1.2.2 氟甲喹检测方法的研究进展 |
| 1.3 存在的主要问题 |
| 1.4 主要研究内容和方法 |
| 第二章 氟甲喹完全抗原合成及多克隆抗体制备 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 药品及试剂 |
| 2.1.2 缓冲溶液体系 |
| 2.1.3 仪器及设备 |
| 2.1.4 试验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 完全抗原的合成与鉴定 |
| 2.2.2 氟甲喹多克隆抗体的制备与纯化 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 完全抗原的合成与鉴定 |
| 2.3.2 氟甲喹多克隆抗体的制备及纯化 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 氟甲喹残留的ELISA检测方法研究 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 药品及试剂 |
| 3.1.2 缓冲溶液体系 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 包被原最适浓度和抗血清最适稀释度的确定 |
| 3.2.2 间接竞争ELISA反应体系条件的优化 |
| 3.2.3 间接竞争ELISA标准曲线的建立 |
| 3.2.4 ELISA方法的稳定性 |
| 3.2.5 抗体的特异性 |
| 3.2.6 样品的测定 |
| 3.2.7 ELISA方法的验证——高效液相色谱法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 包被原最适浓度和抗血清最适稀释度的确定 |
| 3.3.2 间接竞争ELISA反应体系条件的优化 |
| 3.3.3 间接竞争ELISA法标准曲线的建立 |
| 3.3.4 ELISA方法的稳定性 |
| 3.3.5 抗体的特异性 |
| 3.3.6 样品的测定 |
| 3.3.7 ELISA方法的验证——高效液相色谱法 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 氟甲喹残留的固相膜免疫检测方法研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 药品及试剂 |
| 4.1.2 仪器及设备 |
| 4.1.3 试验样品 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 胶体金及金标抗体的制备 |
| 4.2.2 胶体金标记固相膜的制备 |
| 4.2.3 胶体金标记固相膜检测条件的优化 |
| 4.2.4 最低检出限的确定 |
| 4.2.5 样品的基质消除 |
| 4.2.6 样品的加标回收测定 |
| 4.3 结果及分析 |
| 4.3.1 胶体金的制备及质量鉴定 |
| 4.3.2 胶体金与FLU抗体结合最适pH值的确定 |
| 4.3.3 胶体金标记最佳抗体加入量的确定 |
| 4.3.4 胶体金标记固相膜检测条件的优化 |
| 4.3.5 最低检出限的确定 |
| 4.3.6 样品基质的消除 |
| 4.3.7 样品的加标回收测定结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 氟甲喹残留的仿生酶联免疫检测方法研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 药品及试剂 |
| 5.1.2 仪器及设备 |
| 5.1.3 实验样品 |
| 5.1.4 溶液体系的配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 氟甲喹分子印迹膜(MIPs)的制备及表征 |
| 5.2.2 酶标抗原的制备 |
| 5.2.3 仿生酶联免疫分析方法的操作过程 |
| 5.2.4 BELISA反应体系条件的优化及方法的建立 |
| 5.2.5 样品检测 |
| 5.2.6 BELISA方法的验证 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 氟甲喹分子印迹膜的制备及表征 |
| 5.3.2 仿生酶联免疫分析方法的条件优化及建立 |
| 5.3.3 方法的特异性 |
| 5.3.4 样品测定 |
| 5.3.5 BELISA方法的验证——高效液相色谱法 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.1.1 氟甲喹完全抗原的合成及多克隆抗体的制备 |
| 6.1.2 氟甲喹间接竞争ELISA检测方法的建立与应用 |
| 6.1.3 氟甲喹固相膜免疫检测方法的建立与应用 |
| 6.1.4 基于分子印迹技术的氟甲喹仿生酶联免疫检测方法的建立与应用 |
| 6.2 本研究的创新点 |
| 6.3 本研究的不足之处 |
| 6.4 展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 附件 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（8）RHDV抗体检测胶体金与量子点标记试纸条的试制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 兔瘟简介 |
| 1.1 兔瘟基本概况 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 理化特性 |
| 1.1.3 病毒结构及功能 |
| 1.1.4 流行病学 |
| 1.1.5 临诊症状 |
| 1.1.6 病理变化 |
| 1.1.7 实验室检验 |
| 2 免疫层析技术简介 |
| 2.1 胶体金 |
| 2.1.1 胶体金的结构 |
| 2.1.2 胶体金的制备 |
| 2.1.3 胶体金的鉴定 |
| 2.1.4 免疫胶体金的标记 |
| 2.1.5 免疫胶体金快速检测技术在兽医领域的应用 |
| 2.2 量子点 |
| 2.2.1 量子点免疫层析技术 |
| 2.2.2 量子点标记方法 |
| 2.2.3 免疫层析量子点标记快速检测技术在兽医领域的应用 |
| 3 研究目的与意义 |
| 第二章 RHDV VP60 截段基因的克隆表达及鉴定分析 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 主要试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 溶液配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 pMD19-T-VP60-2 构建与鉴定 |
| 2.1.1 引物设计 |
| 2.1.2 RNA提取 |
| 2.1.3 RNA反转录 |
| 2.1.4 VP60 截段基因扩增 |
| 2.1.5 pMD19-T-VP60-2 重组克隆载体的构建 |
| 2.2 重组表达质粒构建与鉴定 |
| 2.2.1 pMD19-T-VP60-2及pCold TF质粒的提取、酶切与回收 |
| 2.2.2 pCold TF酶切片段与VP60 截段基因片段的连接 |
| 2.2.3 重组表达菌株的构建及转化菌落的鉴定 |
| 2.3 重组蛋白诱导表达及诱导条件优化 |
| 2.3.1 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.3.2 重组表达蛋白存在形式的鉴定 |
| 2.3.3 重组蛋白表达条件的优化 |
| 2.3.4 重组蛋白的Western-Blotting检测 |
| 2.3.5 重组蛋白的纯化 |
| 2.3.6 重组蛋白的浓度测定 |
| 2.3.7 兔抗RHDV抗体的制备及效价测定 |
| 2.3.8 重组蛋白的反应原性检测 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 pMD19-T-VP60-2 克隆质粒构建 |
| 3.2 pCold TF-VP60-2 重组表达载体构建 |
| 3.3 重组菌表达条件的优化 |
| 3.3.1 重组蛋白的诱导表达 |
| 3.3.2 重组蛋白性质鉴定 |
| 3.3.3 重组蛋白最优表达条件筛选 |
| 3.4 蛋白免疫印迹分析 |
| 3.5 重组蛋白的纯化及浓度测定 |
| 3.6 兔抗RHDV抗体的效价测定 |
| 3.7 重组蛋白的反应原性检测 |
| 4 讨论 |
| 第三章 胶体金标记重组蛋白免疫层析试纸条的初步研制 |
| 1 材料 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 溶液配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 兔抗重组蛋白抗体制备及效价测定 |
| 2.2 胶体金的制备 |
| 2.2.1 器皿的清洁 |
| 2.2.2 制备胶体金 |
| 2.3 材料的处理 |
| 2.3.1 硝酸纤维素(NC)膜的处理 |
| 2.3.2 金标垫(玻璃纤维)的处理 |
| 2.4 金标蛋白的制备条件筛选 |
| 2.4.1 胶体金标记最适pH的筛选 |
| 2.4.2 标记胶体金最适蛋白含量的确定 |
| 2.5 金标重组蛋白的制备 |
| 2.5.1 重组蛋白金标记 |
| 2.5.2 金标蛋白颗粒质量的鉴定 |
| 2.6 金标试纸条的试制 |
| 2.7 试纸条的组装及检测 |
| 2.7.1 检测试纸条的标记 |
| 2.7.2 检测试纸条的组装与测试 |
| 2.8 胶体金试纸条T线和C线条件确定 |
| 2.8.1 T线二抗浓度的优化 |
| 2.8.2 C线多克隆抗体浓度的优化 |
| 2.9 胶体金试纸条的灵敏性和特异性试验 |
| 2.10 临床样品检测 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 兔抗重组蛋白抗体的效价测定 |
| 3.2 胶体金的制备及初步鉴定 |
| 3.3 免疫胶体金最适pH的测定 |
| 3.4 胶体金标记蛋白的最适量 |
| 3.5 试纸条检测结果 |
| 3.5.1 硝酸纤维膜上T线二抗浓度的确定 |
| 3.5.2 硝酸纤维膜C线多克隆抗体浓度的确定 |
| 3.6 胶体金试纸的灵敏度试验 |
| 3.7 胶体金试纸的特异性试验 |
| 3.8 临床样品检测 |
| 4 讨论 |
| 第四章 量子点标记重组蛋白免疫层析试纸条的初步研制 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试验所需溶液配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 量子点标记重组蛋白的制备 |
| 2.2 量子点标记重组蛋白条件的优化 |
| 2.2.1 量子点标记重组蛋白最佳pH值的优化 |
| 2.2.2 量子点标记重组蛋白最佳蛋白量的优化 |
| 2.2.3 量子点标记重组蛋白最佳活化剂量的优化 |
| 2.3 量子点标记重组蛋白的鉴定 |
| 2.4 量子点标记重组蛋白免疫层析试纸条最佳条件的优化 |
| 2.4.1 二抗稀释倍数的优化 |
| 2.4.2 多克隆抗体稀释倍数的优化 |
| 2.5 量子点标记重组蛋白免疫层析试纸条检测限的确定 |
| 2.6 量子点标记重组蛋白免疫层析试纸条的特异性 |
| 2.7 量子点标记重组蛋白免疫层析试纸条检测临床样品 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 量子点标记重组蛋白的制备 |
| 3.2 量子点标记重组蛋白最适pH值的确定 |
| 3.3 量子点标记重组蛋白的最适蛋白量 |
| 3.4 量子点标记重组蛋白最佳活化剂量的确定 |
| 3.5 量子点标记重组蛋白免疫层析试纸条最佳条件的优化 |
| 3.5.1 检测线(T线)稀释倍数的优化 |
| 3.5.2 多克隆抗体稀释倍数的优化 |
| 3.6 量子点标记重组蛋白免疫层析试纸条的灵敏性检测 |
| 3.7 量子点标记重组蛋白免疫层析试纸条的特异性 |
| 3.8 临床样品检测 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）禽致病性大肠杆菌O1、O2、O78血清型快速检测方法建立及其应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 禽致病性大肠杆菌(APEC)研究现状 |
| 1.1 大肠杆菌生物学特性 |
| 1.2 大肠杆菌分类 |
| 1.3 APEC致病机制 |
| 1.4 APEC血清型 |
| 1.5 APEC致人畜共患风险 |
| 2 大肠杆菌检测主要方法 |
| 2.1 微生物学检测方法 |
| 2.2 血清学方法 |
| 2.3 分子生物学方法 |
| 3 胶体金免疫层析技术及应用现状 |
| 3.1 免疫胶体金技术 |
| 3.2 免疫层析法 |
| 3.3 胶体金免疫层析技术 |
| 参考文献 |
| 第二章 禽致病性大肠杆菌O1、O2、O78血清型三重PCR检测方法的建立及其应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 细菌培养基配制 |
| 1.4 引物设计与合成 |
| 1.5 PCR模板制备 |
| 1.6 三重PCR扩增体系的优化 |
| 1.7 三重PCR特异性试验 |
| 1.8 三重PCR敏感性试验 |
| 1.9 临床模拟样品检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 退火温度的优化 |
| 2.2 dNTP量的优化 |
| 2.3 MgCl_2量的优化 |
| 2.4 Taq DNA酶量的优化 |
| 2.5 引物比例的优化 |
| 2.6 三重PCR特异性检测 |
| 2.7 三重PCR敏感性检测 |
| 2.8 临床模拟样品检测结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 禽致病性大肠杆菌O78血清型单克隆抗体制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1菌株、质粒、细胞和实验动物 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 O78特异性基因的筛选 |
| 1.4 O78血清型APEC特异性蛋白的原核表达 |
| 1.5 动物免疫 |
| 1.6 融合 |
| 1.7 融合筛选及亚克隆 |
| 1.8 腹水制备 |
| 1.9 抗体纯化 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 pCzn1-AGC87681.1重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.2 pCzn1-AGC87681.1重组质粒蛋白表达 |
| 2.3 融合蛋白的纯化 |
| 2.4 免疫后小鼠血清效价检测 |
| 2.5 融合筛选结果 |
| 2.6 腹水及纯化抗体效价检测结果 |
| 2.7 单抗的纯化 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 禽致病性大肠杆菌O78血清型胶体金核酸层析试纸条的研制及其应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 特异性引物的设计与合成修饰 |
| 1.4 待检PCR产物的制备 |
| 1.5 胶体金核酸层析试纸条的制备 |
| 1.6 胶体金试纸条检测PCR产物 |
| 1.7 胶体金试纸条灵敏度检测 |
| 1.8 胶体金试纸条特异性检测 |
| 1.9 血清加标样品检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 胶体金的制备 |
| 2.2 制备金标抗体的条件优化 |
| 2.3 胶体金核酸层析试纸条的灵敏度 |
| 2.4 胶体金核酸层析试纸条的特异性 |
| 2.5 血清加标样品的检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读学位期间取得的学术成果目录 |
| 致谢 |
| 附录 |
（10）食品中大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲菌快速检测新方法研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 立题背景、研究目的和意义 |
| 1.2 食品安全检测的问题和主要检测方法 |
| 1.2.1 食品安全检测的特点和要求 |
| 1.2.2 主要方法及存在的问题 |
| 1.3 食源性致病菌及其检测现状 |
| 1.3.1 食源性致病菌概述 |
| 1.3.2 食源性致病菌检测现状 |
| 第二章 细菌培养和基于分子扩增原理的死活菌鉴定方法建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 大肠杆菌O157:H |
| 2.1.2 空肠弯曲菌 |
| 2.2 试剂,材料和设备 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验材料 |
| 2.2.3 实验设备和仪器 |
| 2.2.4 主要溶液和培养基 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 E.coli O157:H7的培养 |
| 2.3.2 E.coli O157:H7的计数 |
| 2.3.3 C.jejuni的培养 |
| 2.3.4 C.jejuni的计数 |
| 2.3.5 PMA对 E.coli O157:H7的处理 |
| 2.3.6 E.coli O157:H7DNA的提取 |
| 2.3.7 PCR扩增与电泳 |
| 2.3.8 可行性验证 |
| 2.3.9 PMA使用浓度的优化 |
| 2.3.10 PMA与 E.coli O157:H7孵育时间的优化 |
| 2.3.11 卤素灯曝光时间的优化 |
| 2.3.12 PMA法判断E.coli O157:H7的死活状态 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 可行性验证 |
| 2.4.2 PMA使用浓度的优化 |
| 2.4.3 PMA与 E.coli O157:H7孵育时间的优化 |
| 2.4.4 卤素灯曝光时间的优化 |
| 2.4.5 PMA法判断E.coli O157:H7的死活状态 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 基于磁性富集增敏型侧向层析试纸条检测大肠杆菌O157:H7的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.1.1 金纳米粒子 |
| 3.1.2 磁性纳米粒子 |
| 3.1.3 基于磁性富集增敏型侧向层析试纸条检测E.coli O157:H7的原理 |
| 3.2 试剂,材料和设备 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.2.3 实验设备和仪器 |
| 3.2.4 主要溶液 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 GNPs的制备 |
| 3.3.2 GNPs标记E.coli O157:H7单克隆抗体(GNPs-Ab)的制备 |
| 3.3.3 MNPs的制备 |
| 3.3.4 MNPs标记E.coli O157:H7单克隆抗体(MNPs-Ab)的制备 |
| 3.3.5 TEM、SEM、DLS和 Zeta电位仪表征GNPs、GNPs-Ab、MNPs和MNPs-Ab |
| 3.3.6 样品垫的制备 |
| 3.3.7 金标垫的制备 |
| 3.3.8 C线和T线母液的制备 |
| 3.3.9 喷膜 |
| 3.3.10 胶体金免疫侧向层析试纸条的组装 |
| 3.3.11 GNPs粒径的优化 |
| 3.3.12 MNPs-Ab使用量的优化 |
| 3.3.13 NC膜类型的优化 |
| 3.3.14 传统型侧向层析试纸条对E.coli O157:H7灵敏度的检测 |
| 3.3.15 传统型侧向层析试纸条对E.coli O157:H7特异性的检测 |
| 3.3.16 磁性富集增敏型侧向层析试纸条对E.coli O157:H7灵敏度的检测 |
| 3.3.17 磁性富集增敏型侧向层析试纸条对E.coli O157:H7特异性的检测 |
| 3.3.18 实际样品的检测 |
| 3.4 结果讨论 |
| 3.4.1 GNPs的制备 |
| 3.4.2 MNPs磁性分离前后的照片表征 |
| 3.4.3 TEM表征GNPs和 SEM表征MNPs |
| 3.4.4 动态光散射(DLS)表征GNPs和 GNPs-Ab、MNPs和 MNPs-Ab |
| 3.4.5 Zeta电位表征GNPs和 GNPs-Ab、MNPs和 MNPs-Ab |
| 3.4.6 GNPs粒径的优化 |
| 3.4.7 MNPs-Ab使用量的优化 |
| 3.4.8 NC膜类型的优化 |
| 3.4.9 传统型与磁性富集增敏型侧向层析试纸条检测灵敏度的比较 |
| 3.4.10 特异性的检测 |
| 3.4.11 实际样品的检测 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 基于PCR技术的大肠杆菌O157:H7毒力基因检测研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试剂,材料和设备 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.2.3 实验设备和仪器 |
| 4.2.4 主要溶液 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 E.coli O157:H7DNA的提取 |
| 4.3.2 PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳表征 |
| 4.3.3 退火温度的优化 |
| 4.3.4 引物浓度的优化 |
| 4.3.5 镁离子(Mg(2+))浓度的优化 |
| 4.3.6 PCR扩增对E.coli O157:H7灵敏度的检测 |
| 4.3.7 PCR扩增对E.coli O157:H7特异性的检测 |
| 4.3.8 实际样品的检测 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 退火温度的优化 |
| 4.4.2 引物浓度的优化 |
| 4.4.3 Mg~(2+)浓度的优化 |
| 4.4.4 灵敏度的检测 |
| 4.4.5 特异性的检测 |
| 4.4.6 实际样品的检测 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 基于侧向层析荧光试纸条检测大肠杆菌O157:H7毒力基因的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试剂,材料和设备 |
| 5.2.1 实验试剂 |
| 5.2.2 实验材料 |
| 5.2.3 实验设备和仪器 |
| 5.2.4 主要溶液 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 荧光微球标记FITC单克隆抗体(FMs-Ab)的制备 |
| 5.3.2 样品垫的制备 |
| 5.3.3 荧光垫的制备 |
| 5.3.4 C线和T线母液的制备 |
| 5.3.5 喷膜 |
| 5.3.6 侧向层析荧光试纸条的组装 |
| 5.3.7 FMs偶联FITC单克隆抗体量的优化 |
| 5.3.8 封闭剂种类的优化 |
| 5.3.9 重悬液种类的优化 |
| 5.3.10 侧向层析荧光试纸条对E.coli O157:H7灵敏度的检测 |
| 5.3.11 侧向层析荧光试纸条对E.coli O157:H7特异性的检测 |
| 5.3.12 侧向层析荧光试纸条对E.coli O157:H7实际样品的检测 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 FMs偶联FITC单克隆抗体量的优化 |
| 5.4.2 封闭剂种类的优化 |
| 5.4.3 重悬液种类的优化 |
| 5.4.4 灵敏度的检测 |
| 5.4.5 特异性的检测 |
| 5.4.6 实际样品的检测 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 基于异质识别体系的夹心法平板比色检测空肠弯曲菌研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 试剂,材料和设备 |
| 6.2.1 实验试剂 |
| 6.2.2 实验材料 |
| 6.2.3 实验设备和仪器 |
| 6.2.4 主要溶液 |
| 6.2.5 引物 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 C.jejuni核酸适配体的筛选 |
| 6.3.2 克隆和测序 |
| 6.3.3 解离常数的测量 |
| 6.3.4 基于抗体和适配体建立异质识别体系的夹心法平板比色检测C.jejuni |
| 6.3.5 特异性的检测 |
| 6.3.6 实际样品的检测 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 克隆和测序 |
| 6.4.2 解离常数的测定 |
| 6.4.3 基于抗体和适配体建立异质识别体系的夹心法平板比色检测C.jejuni |
| 6.4.4 特异性的检测 |
| 6.4.5 实际样品的检测 |
| 6.5 结论 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的学术活动及成果情况 |
四、应用胶体金免疫层析技术建立炭疽杆菌芽孢的快速检测方法（论文参考文献）
- [1]食源性致病微生物检测技术研究进展[J]. 钱佳婕,黄迪,徐颖华,徐志南. 食品安全质量检测学报, 2021(12)
- [2]CRISPR/Cas12a系统在新冠病毒和金黄色葡萄球菌即时检测中的应用[D]. 钱佳婕. 浙江大学, 2021(02)
- [3]脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备及免疫检测方法研究[D]. 史一恒. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [4]β-内酰胺类抗生素受体和多肽类抗生素抗体的制备及快速检测方法研究[D]. 李月. 江南大学, 2020(04)
- [5]腐败梭菌胶体金试纸条检测方法的建立及类毒素疫苗的制备和应用[D]. 翁鸿宇. 山东农业大学, 2020(12)
- [6]基于新型信号输出的四种免疫层析法的研究与应用[D]. 章钢刚. 南昌大学, 2020(01)
- [7]动物源食品中氟甲喹快速免疫检测技术的研究[D]. 刘卫华. 河北农业大学, 2019(01)
- [8]RHDV抗体检测胶体金与量子点标记试纸条的试制[D]. 周丽军. 四川农业大学, 2019(01)
- [9]禽致病性大肠杆菌O1、O2、O78血清型快速检测方法建立及其应用[D]. 王娟芳. 南京农业大学, 2019(08)
- [10]食品中大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲菌快速检测新方法研究[D]. 滕军. 合肥工业大学, 2019(01)