一、骨髓间充质干细胞(MSC_S)诱导分化为心肌细胞研究进展（论文文献综述）
罗雪[1]（2021）在《HCN2和HCN4对骨髓间充质干细胞向具有起搏功能的心肌细胞分化的影响》文中提出第一部分猪骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离培养和诱导分化目的:通过在体外分离BMSCs,构建一套BMSCs特有的培养方法,并诱导及分化BMSCs,从而建立选择BMSCs最佳流程,从而来探讨BMSCs在生物学中的特性。方法:红细胞裂解法和密度梯度离心法分选是从猪骨髓分离单核细胞两种常用的分离方法,在体外的环境下,将分离获得的单核细胞进行培养,用流式细胞术检测骨髓间充质干细胞表面抗原,以收集的细胞分成BMSC诱导组和对照组,将骨髓间充质干细胞传递至第三代。BMSC诱导组采用不同的诱导方法,加入诱导液,持续7-14天。诱导完成后,观察各组细胞形态。结果:采用骨髓抽吸法采集猪骨髓,充质干细胞来自于猪骨髓中分离获得。采用流式细胞术检测MSCs中CD45、CD11B、CD90的表达情况,结果显示,前两者为阴性,第三个为阳性。由此可见,培养的猪骨髓干细胞符合干细胞的特性。结论:MSCs可以被诱导,分别分化为神经元样细胞、心肌样细胞和脂肪样细胞,由此可见,MSCs能够分化为三层胚胎细胞,为后续进一步诱导做了铺垫。第二部分HCN2和HCN4对骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的影响目的:构建能够使MSCs定向分化为心肌细胞的诱导体系,探讨让心肌细胞能够具有起搏样电流的操作方法,并通过检测起搏通道蛋白的表达情况及If电流动力学特性,探索探讨HCN2和HCN4对骨髓间充质基质细胞（BMSCs）向心肌细胞分化的影响。以获得能够稳定、持久的心肌细胞的诱导机制和方法。方法:以小型成猪为实验对象,提取并分离骨髓间充质干细胞。CD45、CD11B和CD90的细胞表面抗原的表达情况利用流式细胞术来进行检测。对骨髓间充质干细胞进行干预,HCN2+HCN4组:被HCN2和HCN4基因共转染;骨髓间充质干细胞诱导组:被心肌诱导液进行诱导分化。α-actin、cTnT和Desmin是常见的心肌标志物,采用免疫荧光染色和Western blot进行检测。选择全细胞膜片钳技术来检测细胞HCN2通道、HCN4通道电流激活曲线及CsCl对异源表达电流的抑制作用。结果:采用流式细胞术检测CD45、CD11B和CD90的表达情况,结果显示,前两个为阴性,第三个表达为阳性。转染后的HCN2和HCN4基因,免疫荧光染色和Western blot结果显示,HCN2+HCN4组HCN2、HCN4、α-actin和cTnT表达明显增加,可与BMSC诱导组比较。HCN2+HCN4组能够记录与If性质相似的细胞膜通道离子电流。结论:HCN2、HCN4过表达可显着增强MSCs体外向心肌细胞分化的能力,诱导的心肌细胞具有起搏样离子电流。第三部分BMSCs转染HCN1、HCN2和HCN4后诱导为具有起搏样电流细胞的研究目的:研究起搏样细胞的构建方法,并对转染细胞的起搏通道蛋白的表达及If电流动力学特性进行检测,期待能够获得稳定、持久的起搏样细胞。方法:用生物起搏的靶基因HCN1、HCN2、HCN4分别转染到猪MSCs细胞内,把转染后MSCS诱导为具有起博样电流的细胞。结果:用全细胞膜片钳对转染后细胞进行检测,能成功检测出If电流,为建立新型有效的细胞生物起搏技术奠定实验基础。结论:BMSCs转染HCN1、HCN2和HCN4基因后可提高向起搏样细胞诱导分化效率。
王雪姣[2]（2020）在《葛根素诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究》文中研究指明背景:心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）作为世界上危害人类尤其是中老年人生命健康的主要疾患之一,因其极高的发病率以及近年来的年轻化趋势,而备受广大医者和学者的关注。急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）作为心血管疾病中重要一员,其科学实验及临床治疗的研究更是成为热点和难点。已经发育成熟的心肌细胞作为终末分化细胞,当发生心肌梗死时,心肌细胞不同程度受损甚至坏死,功能丧失。临床对于AMI的治疗方法主要包括药物治疗、介入治疗等,都是针对心肌梗死早期用于挽救受损但是还未凋亡的心肌细胞及其功能,但对于已经坏死或凋亡的心肌细胞却是回天乏术。心肌细胞坏死或凋亡,功能性心肌细胞由无功能的成纤维细胞取代进而形成瘢痕组织,心室重构,心脏功能下降,最终导致心力衰竭,导致患者生活质量下降,严重的威胁患者生命。由于心肌细胞损伤的不可逆性,解决心肌细胞的缺失成为心肌梗死治疗的根本问题。随着科学技术的进步,细胞生物工程学的发展使干细胞替代疗法成为治疗心肌梗死的一种新的具有前景的治疗方法。干细胞具有自我复制和多向分化的能力,使干细胞移植治疗心肌梗死成为研究热点。多项基础实验和临床试验已经表明干细胞移植能够修复受损的心肌细胞,促进血管新生,减少梗死面积,促进心脏功能的恢复。自2003年美国FDA率先批准对心肌梗死等疾病采用自体骨髓干细胞移植进行治疗,此后全球范围内开始了干细胞治疗的相关研究,骨髓间充质干细胞是其中应用最为广泛和成熟的。骨髓间充质干细胞（bone marrowmesenchymal stem cells,BMSCs）与胚胎干细胞等其他干细胞相比以下优点:具有容易获取,容易分离,体外培养及扩增具有稳定性,没有免疫排斥问题,不涉及医学伦理道德问题,具有多向分化潜能,运用恰当的诱导剂在适当条件下可以分化为骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、内皮细胞、干细胞、平滑肌细胞、心肌样细胞,上述优点使其成为了干细胞移植治疗心肌梗死等心血管疾病的重要种子细胞。BMSCs可以通过与心肌细胞共培养,基因修饰及药物诱导等方法分化为心肌细胞,但其分化率及安全性有待进一步提高。葛根素是葛根的重要成分,它可以影响骨髓间充质干细胞的分化。葛根素及其多种制剂已经通过各种药剂形式广泛应用于临床各种心血管疾病的治疗。葛根素作为中药有效成分,与西药相比,毒副作用更小,使用更安全,临床推广价值显着。目前已有研究发现,葛根素不仅能保护受损心肌细胞、保护心血管,还能在体外诱导胚胎干细胞分化为心肌样细胞,提高心室细胞分化效率。目的:本实验应用葛根素体外诱导骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞,从形态学和分子生物学层面探讨葛根素对骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的诱导能力,通过其诱导分化最适浓度的筛选提高分化率,为心肌梗死等心血管疾病的干细胞移植治疗提供理论基础。方法与结果:为了探讨葛根素诱导BMSCs分化为心肌样细胞的可行性,运用全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠的四肢骨的BMSCs。对第2代BMSCs分别运用0（对照组）、50、100、200μmol/L葛根素进行体外定向诱导。观察培养细胞的形态,结果可见,BMSCs由0小时的悬浮状态到24小时时均匀贴壁;3天后可见细胞圆钝突起;7天后细胞呈现长梭形等不规则状态。葛根素诱导7天后,细胞增殖加快,细胞形态更加修长;诱导28天后,细胞呈现方向性的紧密排列状态。BMSCs的形态经过不同浓度葛根素诱导无差异。运用流式细胞技术对第3代BMSCs进行表面抗原鉴定,结果显示,CD29、CD45、CD90的阳性率表达分别为95.1%、7.4%和93.4%。表明细胞为纯化的BMSCs。运用免疫细胞化学检测法检测间隙连接蛋白43（Cx43）、心肌肌钙蛋白I（c Tn I）、心肌肌钙蛋白T（c Tn T）在诱导4周后各组的表达。结果显示,各诱导组均可见Cx43、c Tn I及c Tn T的阳性表达,空白对照组表达呈阴性,其中100μmol/L诱导组较其他组的阳性表达最高,差异具有统计学意义（P<0.05）。运用激光共聚焦荧光技术检测间隙连接蛋白43（Cx43）、心肌肌钙蛋白I（c Tn I）、心肌肌钙蛋白T（c Tn T）,对比诱导4周后对照组与100μmol/L诱导组的表达,提示100μmol/L诱导组呈阳性表达,对照组呈阴性表达,差异显着。运用Western blotting检测法检测间隙连接蛋白43（Cx43）、心肌肌钙蛋白I（c Tn I）、心肌肌钙蛋白T（c Tn T）在各组诱导4周的BMSCs的表达。结果显示,各组均在蛋白水平表达Cx43、c Tn I及c Tn T,其中100μmol/L诱导组的表达最高,对照组最低,差异有统计学意义（P<0.05）。实时荧光定量PCR（RT-q PCR）技术检测心肌早期转录因子GATA-4和心肌细胞增强因子2c（MEF2c）在各诱导组诱导分化1周、2周、4周细胞的表达,检测T-box5和amphiphysin-2（Bin1）在空白对照组与100μmol/L诱导组诱导分化1周、2周、4周细胞的表达。结果显示,经葛根素诱导后,各个基因的表达与对照组相比整体呈现上升趋势。虽然各个基因的最高表达量呈现在不同时间段,但都出现在100μmol/L诱导组。各诱导组相比,GATA-4的最高表达量出现在100μmol/L诱导组诱导4周时,MEF2c的最高表达量出现在100μmol/L诱导组诱导2周时。100μmol/L诱导组与空白对照组相比,T-box5的最高表达量出现在100μmol/L诱导组诱导1周时,Bin1的最高表达量出现在100μmol/L诱导组诱导4周时。相较于其他诱导组,100μmol/L组表达最高（P<0.05）。结论:1.采用全骨髓贴壁法分离培养的SD大鼠四肢骨髓细胞可以纯化为骨髓间充质干细胞。2.不同浓度葛根素可以在体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化。3.100μmol/L为葛根素体外诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的最佳浓度。
李记泉[3]（2020）在《针刺联合骨髓间充质干细胞移植改善大鼠急性心肌缺血研究》文中研究表明目的:本文以急性心肌缺血（Acute Myocardial Ischemia,AMI）大鼠为研究对象,以针刺联合骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BM-MSCs）静脉移植为干预手段,旨在探讨针刺联合BM-MSCs静脉移植改善大鼠急性心肌缺血作用情况,并从炎症反应、细胞凋亡及生长因子变化三个方面探讨了针刺联合BM-MSCs静脉改善大鼠急性心肌缺血的相关分子生物学机制。材料与方法:1.BM-MSCs的分离、培养、传代、鉴定和标记:健康雄性SD大鼠3只（SPF级,4周龄,体重150-160g）,采用7%水合氯醛（5 m L/kg）腹腔注射麻醉,浸泡于75%酒精消毒5min,无菌条件下取胫骨、股骨,PBS缓冲液冲洗出骨髓制成单细胞悬液,离心后接种于培养瓶,放置于培养箱中采用全骨髓贴壁法培养,及时更换培养基,待细胞铺满培养瓶底部并融合成单层时,用0.25%胰蛋白酶消化后,按1:2传代培养,显微镜观察细胞形态变化,取第三代细胞采用流式细胞仪检测细胞表面标记（CD29、CD73、CD90、CD44、CD45）,并取第三代细胞Brd U标记后采用荧光显微镜观察阳性细胞标记率。2.AMI大鼠模型的制备:60只健康雄性SD大鼠,腹腔注射7%水合氯醛（5 m L/kg）麻醉,通过结扎冠状动脉左前降支复制AMI大鼠模型,将存活的大鼠随机分为模型组、干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组,每组10只;同时另有15只大鼠仅在相同部位穿刺手术缝合线而不结扎,随机挑选术后存活大鼠10只作为假手术组。3.针刺联合BM-MSCs静脉移植干预AMI大鼠:造模结束后1小时,干细胞组、针刺联合干细胞组大鼠经尾静脉注射0.5ml的BM-MSCs（2×106个/ml）,同时其余各组注射同等剂量的生理盐水。对针刺组、针刺联合干细胞组大鼠采取电针双侧内关、心俞穴,刺入皮下深度2-3mm,疏密波,频率2Hz,强度2m A左右,以局部肌肉出现轻度震颤收缩为度,留针30min,24h治疗一次,共治疗10次;其他各组不针刺,但在同时同地以同样方式进行抓取和固定。期间观察各组大鼠体重、毛发、体态、饮食、二便、运动等一般情况。治疗结束后检测各组大鼠心电图、心脏超声,随即处死各组大鼠,取腹主动脉全血,分离出血清备用;同时快速取出心脏,生理盐水冲洗干净,每组随机挑选1个心脏样本,在缺血区域切薄片5片,用于大鼠心肌缺血面积的测定,其他心脏样本—80℃超低温冰箱冻存备用。本文分两个部分讨论针刺联合BM-MSCs静脉移植改善大鼠急性心肌缺血作用情况,并从炎症反应、细胞凋亡及生长因子变化三个方面探讨了针刺联合BM-MSCs静脉改善大鼠急性心肌缺血的相关分子生物学机制。（1）针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI作用研究观察BM-MSCs传代培养时的形态学特征与变化,分析BM-MSCs的鉴定和标记结果,采集大鼠心电图和心脏超声数据并分析,采用氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色法测定AMI后各组大鼠的心肌缺血面积。（2）针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI相关分子机制研究苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin staining,HE）染色法检测AMI后各组大鼠心肌细胞形态和炎症浸润情况;蛋白质印迹法（Western Blot,WB）技术检测大鼠心肌组织Bcl-2、Bax、Caspase-3、NF-κB、VEGF、b-FGF、TGF-β蛋白的相对表达量;酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）技术检测大鼠心肌TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10蛋白的相对表达量。结果:1.与假手术组比较,模型组大鼠LVDd、LVDs明显升高（P<0.01）,而LVEF、LVFS明显降低（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠大鼠LVDd、LVDs明显降低（P<0.01）,而LVEF、LVFS明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠LVDd、LVDs、LVEF、LVFS无明显差异（P>0.05）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠LVDd、LVDs明显降低（P<0.01）,而LVEF、LVFS明显升高（P<0.01）。2.假手术组大鼠未见心肌缺血;与假手术组比较,模型组大鼠心肌缺血面积明显升高（P<0.01）,缺血区面积占左心室总面积的18.39%;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积比例均明显降低（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠心肌缺血面积比例无明显变化,针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积比例均明显降低（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积明显高于针刺组、干细胞组（P<0.01）。3.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显升高（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低（P<0.01或P<0.05）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低（P<0.01）。4.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显降低（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量无明显变化（P>0.05）,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高（P<0.01）。5.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显升高（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显降低（P<0.01）;针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显低于针刺组、干细胞组（P<0.01）。6.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显降低（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量无明显变化（P>0.05）,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高（P<0.01）。7.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）。结论:1.针刺联合BM-MSCs移植能够显着改善AMI大鼠心电图和心脏超声变化,降低AMI大鼠左心室心肌缺血面积,提高AMI大鼠心脏功能,为临床治疗本病提供了新思路。2.针刺联合BM-MSCs移植能够通过下调AMI大鼠NF-κB表达,降低炎症因子TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8水平,以及上调抑炎因子IL-10水平,减轻AMI后过度表达的炎症反应,从而减轻心肌细胞坏死;通过调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达,从而减少AMI后心肌细胞凋亡;通过调节细胞生长因子VEGF、b-FGF、TGF-β表达,诱导内皮细胞形成,从而改善心肌供血。
陈一欢[4]（2020）在《不同来源间充质干细胞外泌体修复缺血受损心肌功能差异及机制研究》文中认为目的:比较两种间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell,MSC）[骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell,BMSC）与脐带间充质干细胞（Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell,UMSC）]来源的外泌体（Exosome,EXO）对急性心肌梗死的治疗效果差异,利用蛋白组学手段分析出现差异的分子机制,为应用EXO治疗缺血性心脏病的临床转化提供理论基础。方法:第一部分将冻存的P3代BMSC复苏培养并传代,胰酶-胶原酶消化法分离培养UMSC并传代,对P5代的细胞进行干细胞相关鉴定并进行下一步实验;差速超速离心法提取BMSC和UMSC培养上清液中的EXO并进行鉴定。第二部分通过体外和体内实验（外泌体心肌注射移植入大鼠急性心梗模型）,进行两种外泌体对细胞相关功能及对心肌修复功能的比较,观察两者之间的差异。第三部分提取BMSC-EXO和UMSC-EXO中的蛋白,运用液相色谱-质谱联用分析方法鉴定蛋白并进行注释,筛选差异蛋白进行富集分析,根据分析结果选择典型差异蛋白进行体外验证。结果:复苏接种的P3代BMSC形态均一,呈梭形或纺锤形,5天左右融合达90%以上;经酶消化法贴壁培养得到的UMSC呈成纤维细胞样,呈多角形或梭形,培养3周细胞融合比例超过80%。MSC传代后生长速度明显加快。流式细胞仪检测:超过95%的 BMSC 和 UMSC 表达 CD44、CD90 和 CD105;不表达 CD34 和 HLA-DR。生长曲线显示P5代的UMSC增殖速度明显较BMSC快。在同样诱导条件下,BMSC和UMSC均能被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞,BMSC更易被诱导为脂肪细胞和软骨细胞,而UMSC则易被诱导为成骨细胞。透射电镜观察MSC-EXO呈典型的“杯托样”结构,内可见低密度光亮区;粒径分析结果,BMSC-EXO平均粒径131.5nm,UMSC-EXO 平均粒径 13 7.5nm;Western Blot 显示 BMSC 和 UMSC 来源的EXO均为CD63、TSG101阳性表达。体外实验结果:两种来源MSC的EXO均能抑制H2O2诱导的H9C2细胞凋亡、在体外诱导HUVEC细胞加速迁移和形成管样结构、在体外抑制TGF-β诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化。UMSC-EXO在上述调控能力上优于BMSC-EXO。体内实验结果:术后3天见UMSC-EXO在心肌组织内驻留率更高。HE染色、RT-qPCR、Western Blot结果提示经EXO处理后,心梗区域炎性细胞浸润减少,炎症因子IL-6、TNF-α、IκBα、NF-κB p65表达降低,与凋亡相关的Bax、cleaved-Caspase3的表达降低、Bcl2表达增加,与纤维化相关的MMP-2、MMP-9表达降低、与血管新生相关的eNOS、VEGF表达增加。天狼猩红染色、Masson’s Trichrome染色、TUNEL染色和CD31染色结果显示MSC-EXO能抑制梗死后心肌间质纤维化、抑制心肌细胞凋亡、促进新生血管形成。心脏超声结果提示MSC-EXO能提高急性心梗后的心脏功能。上述指标UMSC-EXO移植组较BMSC-EXO移植组改善更显着。使用液相色谱-质谱联用分析法鉴定到BMSC-EXO中可定量蛋白624个,UMSC-EXO中可定量蛋白635个,两者共同表达的蛋白为558个,139个蛋白在BMSC-EXO中表达上调,153个蛋白在UMSC-EXO中表达上调。富集分析显示UMSC-EXO中的差异上调蛋白较BMSC-EXO能更多地发挥细胞粘附、促细胞增殖和存活、抗凋亡及炎症调节等功能。筛选有明显表达差异的蛋白PDGFC进行验证结果:转染过表达靶向PDGFC的shRNA的UMSC,其EXO中的PDGFC含量下降,使用该外泌体体外与HUVEC细胞共培养后,HUVEC细胞中p-AKT的表达下降,形成管状结构能力下降。结论:BMSC-EXO和UMSC-EXO在体外均可以提高心肌细胞抗凋亡能力、促进内皮细胞增殖迁移及形成管样结构、抑制TGF-β诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化的程度。在体内均能够减轻急性心梗后局部炎性反应,改善心肌细胞存活率,降低心肌组织纤维化程度,促进毛细血管新生,改善心脏功能。总体效果UMSC-EXO较BMSC-EXO更好,其原因可能与其包含的蛋白成分差异有关。MSC-EXO中包含的蛋白质在心梗后心肌修复过程中发挥了一定的作用,而差异蛋白（如PDGFC）表达量的不同可能是不同来源MSC外泌体在心肌修复过程中产生差异的原因之一。
韩刘君[5]（2020）在《兔骨髓间充质干细胞体外构建血管化组织工程心肌的实验研究》文中进行了进一步梳理目的利用兔骨髓间充质干细胞作为种子细胞,分别诱导为心肌样细胞和内皮细胞,于体外构建血管化组织工程心肌组织,为临床上通过组织工程与细胞移植技术治疗心肌梗死这一疾病提供理论基础和技术支持。方法1选取普通级日本大耳白兔,无菌分离双侧股骨及胫骨,采用Percoll分离液分离兔骨髓间充质干细胞并使用流式细胞仪鉴定其表面标志物CD90、CD105和CD45。使用内皮细胞条件培养基（Endothelial cell culture medium,ECM）对兔骨髓间充质干细胞诱导为内皮细胞,采用免疫细胞化学染色的方法对表面标志物CD34和CD31进行鉴定。显微镜下观察兔骨髓间充质干细胞和内皮细胞的形态学变化。2使用5-氮胞苷对兔骨髓间充质干细胞定向诱导为心肌样细胞,免疫细胞化学染色的方法对表面标志物心肌肌钙蛋白T（Cardiac troponin T,c TNT）进行鉴定,并于显微镜下观察诱导后细胞的形态学变化。3分别使用4,6-二氨基-2-苯基吲哚（4,6-diamino-2-phenylindole,DAPI）和氯甲基苯甲酰氨（Chloromethylbenzamidodialkylcarbocyanine,CM-DIL）标记心肌样细胞和内皮细胞。4将诱导后获得的心肌样细胞与内皮细胞按照不同比例进行共培养（1∶0、0∶1、1∶1、1∶2）。5将不同组的细胞接种至Matrigel基质胶和胶原海绵两种支架材料上,观察细胞-支架材料复合物的血管化形成能力。6采用SPSS 23.0统计软件对实验数据进行统计学分析,计量资料使用均数±标准差（sx±）的形式表示,多个样本的均数之间的比较采用单因素方差分析,以P<0.05表示具有显着性差异。采用Graph Pad Prism 8.0软件进行图形的绘制。结果1通过流式细胞仪技术检测可观察到使用Percoll分离液的方法可获得兔骨髓间充质干细胞,CD90和CD105表面标志物呈现为阳性表达,CD45为阴性表达,显微镜下可观察到48小时的兔骨髓间充质干细胞形态为透亮圆形、折光性较强,第1代的兔骨髓间充质干细胞,细胞长短伸展不一,形态多为短梭形,内含少量杂质细胞,第2代的兔骨髓间充质干细胞,细胞呈现为梭形,第3代的兔骨髓间充质干细胞,细胞体积较起始细胞体积大,形态变为长梭形,多边形。2使用内皮细胞条件培养基（ECM）对兔骨髓间充质干细胞诱导后可获得内皮细胞,经免疫细胞化学染色的方法进行鉴定,结果表明诱导后的细胞表达CD31和CD34,显微镜下可观察到内皮细胞在48小时后部分细胞开始贴壁,细胞形态大小不一致,呈现条索样变化;传至第1代时,细胞形态变为短小细条索状,有少许透亮点;待细胞进行第2次传代,可观察到细胞数量较前明显增多,排列为“铺路石样”改变;传至第3代,细胞为长梭形改变。3 DAPI荧光染料标记心肌样细胞,可观察到细胞核标记为蓝色,CM-DIL荧光染料标记内皮细胞,可观察到细胞膜标记为红色。4使用10umol/L的5-氮胞苷对兔骨髓间充质干细胞定向诱导为心肌样细胞,经免疫细胞化学染色的方法进行鉴定,观察到诱导后的细胞心肌标志物c TNT表达为阳性,经5-氮胞苷诱导24小时的细胞形态呈现为多角形,分布不均,生长缓慢,诱导3天后,细胞体积较前增大,诱导5天后,细胞开始伸出长短不一的伪足,诱导7天后细胞伸出明显伪足,偶有相互连接,细胞胞体呈现为高亮状态,诱导3周,细胞之间聚集数量逐渐减少,诱导1月可观察到细胞形态发生明显变化,细胞数量明显减少。5体外构建细胞-支架材料复合物,将不同组别的细胞接种至Matrigel基质胶上,可观察到心肌样细胞与兔骨髓源性内皮细胞以1∶2共培养条件下的血管网状结构的形成能力最强,而在胶原海绵支架材料上只观察到细胞在胶原海绵生长,无血管网状结构的形成。结论1使用内皮细胞条件培养基诱导兔骨髓间充质干细胞可获得内皮细胞。2 5-氮胞苷诱导兔骨髓间充质干细胞可获得心肌样细胞。3体外构建血管化细胞-支架材料复合物,支架材料的选择上Matrigel基质胶相比较胶原海绵更合适。4细胞-支架材料复合物形成血管化的能力上,心肌样细胞与内皮细胞以1∶2比例进行共培养条件下的血管网状结构的形成能力最强。图15幅;表2个;参118篇。
倪达[6]（2020）在《外泌体介导心肌损伤保护作用的机制研究》文中指出背景:近年来,外泌体在心肌保护的研究中逐渐受到越来越多的关注。心血管系统是外泌体进行细胞间信号传递的重要场所之一,外泌体介导的心肌细胞间信号传递广泛涉及心血管系统疾病的生理及病理过程。在心肌缺血后,不同细胞来源的外泌体介导的信号传递和组织修复可能发挥着重要作用,其含有的大量与其结构和功能密切相关的物质可通过自分泌或旁分泌的方式作用于自身或远隔的靶细胞,修复受损心肌,对心肌梗死以及心肌缺血再灌注损伤引发的心肌细胞凋亡具有一定保护作用,可能减少梗死面积、增加新生血管数量,从而改善心脏功能。但外泌体如何发挥心肌保护作用的具体机制仍有待进一步研究。本课题研究拟从两部分内容进行阐述:首先从探讨多种来源外泌体在体外循环围手术期的水平变化的角度阐述外泌体与心肌保护之间的关联与作用,然后选取来源广泛且具有多向分化功能的骨髓间充质干细胞来源外泌体,拟从细胞和整体动物两个层面,通过一系列实验,深入研究外泌体介导心肌损伤保护作用的具体机制。第一部分研究多种来源外泌体在体外循环围手术期的表达变化情况目的:探究外周血内皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞和血小板等多种来源的外泌体在体外循环围手术期的变化情况。方法:选择2017年1月-2017年12月行体外循环下先天性心脏畸形矫治术患儿60例,于体外循环前、再灌注1h、6h、12h、24h、48h、72h分别采集桡动脉血,采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）检测患儿血浆中c Tn T的浓度水平,并提取桡动脉血内皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞和血小板,分别采用超速离心法分离内皮细胞、树突状细胞和巨噬细胞来源的外泌体,采用离心法分离血小板来源的外泌体。结果:体外循环再灌注1h、6h、12h、24h、48h c Tn T浓度[（1.352±0.233、1.653±0.231、1.263±0.224、0.623±0.145、0.231±0.025）μg/l]均明显高于体外循环前[（0.013±0.001）μg/l]（P<0.05）,再灌注1h、6h、12h、24h、48h内皮细胞来源外泌体含量[（167.55±26.67、210.57±31.12、189.56±26.32、142.28±4.27、91.02±3.16）×106微粒/ml]均明显高于体外循环前[（76.78±13.14）×106微粒/ml]（P<0.05）,再灌注1h、6h、12h、24h、48h树突状细胞来源外泌体含量[（87.51±6.28、92.12±5.37、83.14±4.29、68.37±3.28、50.49±3.94）×106微粒/ml]均明显高于体外循环前[（34.27±4.52）×106微粒/ml]（P<0.05）,再灌注1h、6h、12h、24h、48h巨噬细胞来源外泌体含量[（92.16±2.73、101.26±3.47、88.19±3.20、65.45±2.76、43.28±1.97）×106微粒/ml]均明显高于体外循环前[（28.78±2.64）×106微粒/ml]（P<0.05）,再灌注1h、6h、12h、24h、48h血小板来源外泌体含量[（134.27±4.28、141.28±3.06、135.84±3.29、105.61±2.58、65.24±3.10）×106微粒/ml]均明显高于体外循环前[（41.51±2.02）×106微粒/ml]（P<0.05）,再灌注72h各指标和体外循环前比较无统计学意义（P>0.05）。结论:外周血内皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞、血小板来源的外泌体浓度水平在体外循环围手术期明显增高,且与代表心肌损伤的c Tn T浓度变化一致,证明外泌体具有心肌保护作用。第二部分研究骨髓间充质干细胞来源外泌体调控自噬发挥心肌保护作用机制目的:探讨骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死的影响是否与自噬有关,以及外泌体在其中发挥的作用。方法:1.建立小鼠心肌梗死模型,将骨髓间充质干细胞注入梗死周围心肌（4处20μl,共2×105个细胞）,分别于术后1、3、7、14、28天检测心功能的变化;术后28天取心脏标本,经Masson染色后,比较梗死面积的差异;TUNNEL法检测各组心肌细胞凋亡情况。2.在心肌梗死后1天采集心肌细胞,比较各组心肌组织自噬水平的变化。3.将骨髓间充质干细胞与心肌细胞共培养,在缺氧培养箱中模拟心肌梗死情况,检测心肌细胞自噬水平,并观察使用自噬抑制剂3-MA后的变化情况。4.提取骨髓间充质干细胞来源的外泌体,在缺氧条件下与心肌细胞共培养,检测心肌细胞自噬水平。结果:1.骨髓间充质干细胞移植组术后28天时心功能较心肌梗死组明显改善;骨髓间充质干细胞移植组小鼠心肌梗死面积较心肌梗死组明显减少;骨髓间充质干细胞移植组心肌细胞凋亡率低于心肌梗死组。2.骨髓间充质干细胞移植组LC3-I、LC3-II、p53和BNIP3的表达明显降低。3.缺氧组p53和BNIP3水平升高,骨髓间充质干细胞共培养组p53和BNIP水平降低,使用自噬抑制剂后,心肌细胞死亡率下降。4.骨髓间充质干细胞来源外泌体共培养组LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p53和BNIP3在蛋白和m RNA水平上均明显低于缺氧组。结论:骨髓间充质干细胞分泌的外泌体可通过P53/BNIP3信号通路下调心肌细胞自噬水平,减少心肌细胞自噬死亡,从而改善心功能,减少心肌重塑,发挥心肌保护作用。
焦智慧[7]（2020）在《ADSC-CM对小型猪腹腔镜肝IRI合并部分肝切除保护作用的研究》文中研究指明肝脏是哺乳动物最大的实质器官,具有加工储存营养物质、代谢药物毒物、分泌胆汁、合成蛋白质等重要功能。肝脏缺血再灌注损伤是外科手术中常见的一种临床综合征,20世纪90年代出现了腹腔镜的肝切除术,腹腔镜手术可以最大程度的减少腹壁神经和肌肉的损伤,减少出血、术后疼痛和粘连,加快手术恢复。尽管采用微创外科手术,在肝切除、肝移植、出血性休克等临床手术中仍不可避免的出现肝脏缺血再灌注损伤,严重会导致肝炎以及术后肝功能的衰竭。对于晚期肝功能不全的有效治疗办法是原位肝移植,但也面临着器官短缺,费用昂贵、免疫排斥和移植并发症等问题,因此,寻找能够减轻肝脏缺血再灌注损伤以及提高肝脏再生能力的安全有效的治疗办法是目前肝脏外科亟待解决的问题之一。脂肪间充质干细胞（ADSCs）能够自我更新、具有多向分化能力、来源丰富、取材损伤小,是目前细胞疗法理想的种子细胞。ADSCs主要依靠分化和旁分泌发挥作用,旁分泌指干细胞释放的多种生物因子在微环境里通过细胞基质在局部以及临近组织对靶细胞发挥的生物学作用。随着对旁分泌机制的深入研究,发现ADSCs分泌的多种细胞因子具有促进血管生成,抑制炎症反应,调节免疫应答,修复组织再生等多种生物学功能。ADSCs在体外培养的过程中,会将细胞因子等生物活性物质分泌到培养液中,这种含有细胞分泌物的培养液为脂肪间充质干细胞的条件培养液（ADSC-CM）。尽管ADSCs在临床上对许多疾病有治疗效果,但ADSCs具有免疫原性,对植入ADSCs的不可控分化仍是重要的安全隐患。因此,使用ADSC-CM的无细胞疗法成为绕过细胞疗法局限性的一种再生医学治疗方法。目前有关肝脏缺血再灌注损伤的动物模型以啮齿类动物为主,而从比较医学角度,小型猪与人的同源性好,体积大小以及器官大小与人更为接近,因此也作为研究缺血再灌注损伤理想的实验动物,所获得的研究数据更有价值,易于临床转化。而ADSC-CM在大型实验动物的研究较少,特别是肝脏领域尚未见报道,所以本研究旨在通过建立小型猪肝脏缺血再灌注合并部分切除模型,探究ADSC-CM治疗肝脏缺血再灌注合并部分切除损伤的疗效,为比较医学开展肝病治疗,拓宽ADSC-CM移植领域提供研究依据。本研究使用30头小型猪,其中6头用于脂肪组织的获取。采用胶原酶消化法分离培养ADSCs,使用诱导培养基和特定染色鉴定ADSCs成脂、成骨、成肝分化能力,应用细胞流式鉴定ADSCs表面特异性抗原。ADSCs饥饿培养48 h获得ADSC-CM,经3 kda超滤管离心浓缩ADSC-CM用于后续实验。另外24头小型猪随机分为四组:模型组（IRI）,DMEM对照组（DMEM）,脂肪间充质干细胞组（ADSCs）,脂肪间充质干细胞条件培养基组（CM）,每组6头。四组实验动物均通过腹腔镜手术建立肝脏缺血再灌注合并部分肝切除模型,IRI组通过肝实质注射生理盐水,DMEM组注射基础培养基,ADSCs组注射脂肪间充质干细胞,数量为1×106/kg,CM组按照1×106/kg细胞数提取等量干细胞分泌的条件培养液,注射浓缩的ADSC-CM进行干预。分别在术前、术后1 d、3 d、7 d采集血液样本及肝组织样本用于相关指标的检测。通过HE染色观察病理组织学变化,透射电镜观察超微结构的变化,血常规检测外周血的炎性细胞变化,试剂盒检测抗氧化酶以及细胞凋亡酶活性,TUNEL染色检测凋亡细胞的阳性率,ELISA法检测血清中炎症相关因子、再生相关因子以及ADSC-CM成分,q RT-PCR法检测炎症、凋亡以及再生相关基因水平变化,Western Blot法检测肝组织中凋亡以及再生相关蛋白水平的变化,免疫组化染色检测凋亡相关蛋白以及再生相关蛋白水平的变化。本研究结果如下:（1）病理组织学与超微结构变化:术后各组肝小叶结构被破坏,肝索排列紊乱,肝细胞空泡变性明显,炎性细胞浸润,相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预明显减少空泡变性和炎性细胞浸润;术后IRI组和DMEM组肝细胞内质网严重扩张,细胞核膜皱缩,染色质边集化,ADSCs或ADSC-CM干预改善了内质网扩张及肝细胞核膜皱缩的程度。（2）肝脏功能变化:术后各组ALT、AST、LDH、ALP和T-BIL均升高,TP呈降低趋势,相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预明显降低了ALT、AST、LDH、ALP和T-BIL的升高程度,缓解了TP的降低程度,促进肝脏功能的恢复。（3）氧化应激指标变化:术后各组肝组织抗氧化酶CAT、GSH-Px和SOD活性显着降低,MPO酶活性和MDA含量显着升高,相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预显着增强了抗氧化酶的活性,降低MPO酶活性,并能减少氧化产物MDA的水平,从而减少术后的氧化应激反应,且两个干预组的上述氧化应激指标均无显着性差异。（4）炎症指标变化:术后外周血中炎性细胞WBC、NE、LY含量迅速升高,ADSCs或ADSC-CM干预减少了外周血中的炎性细胞的数量;IRI组和DMEM组血清中的炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量呈升高趋势,ADSCs或ADSC-CM干预降低促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平,同时增强抑炎因子IL-10的表达;肝组织中炎症因子基因水平的表达与血清结果一致,ADSCs和ADSC-CM通过抑制促炎因子的过度释放以及增强抑炎因子的表达显着改善了术后的炎症反应,且两个干预组之间没有显着性差异。（5）凋亡指标变化:术后各组P53、Bax、Fas、Fasl基因和蛋白水平均显着升高,Bcl-2表达水平降低,相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预抑制了凋亡相关指标P53、Bax,、Fas、Fasl的表达,提高抗凋亡Bcl-2的表达水平;ADSCs组和CM组显着降低TUNEL阳性细胞率及Caspase酶活性,减少术后肝细胞凋亡,且两组之间没有显着性差异。（6）再生指标变化:相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预显着提高血清中血管生成相关因子VEGF、ANG-1、ANG-2的表达,增强组织中肝脏再生相关基因HGF、Cyclin D1的表达,抑制肝再生终止基因TGF-β的表达,提高Ki67的阳性细胞数及细胞增殖PCNA蛋白的表达,且ADSCs组和CM组之间没有显着性差异。（7）ADSC-CM成分检测:通过ELISA法检测到小型猪ADSC-CM中含有促进血管生成的VEGF、ANG-1、ANG-2、b-FGF,调节炎症反应与肝脏再生的TNF-α、IL-1β、IL-6。综上所述,经肝实质移植ADSCs和ADSC-CM均能够改善肝脏缺血再灌注合并部分肝切除的病理组织学损伤及超微结构变化,减轻过度炎症反应及氧化应激反应,减少细胞凋亡,促进肝脏再生。本试验成功应用ADSCs和ADSC-CM干预肝脏缺血再灌注合并部分切除后的肝损伤,证明ADSCs和ADSC-CM抗氧化、抗炎、抗凋亡和促进肝再生的作用,且二者干预效果无显着差异,推测ADSCs发挥作用的机制很可能是通过分泌细胞因子的旁分泌途径。
张妮[8]（2019）在《降香新黄酮latifolin促进骨髓间充质干细胞对缺血性心脏病心肌修复作用及机制研究》文中研究指明目的:骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BM-MSCs）移植治疗心肌梗死被认为是一种有效的治疗方法,然而炎性微环境导致移植的BM-MSCs生存率和分化率低,限制了其疗效,提高BM-MSCs的生存率和分化能力以提高BM-MSCs移植治疗心肌梗死疗效十分重要。Latifolin是从中药降香中分离出来的单体化合物,研究报道表明latifolin具有抗炎作用,前期研究发现latifolin对心肌细胞具有保护作用,可降低心肌组织炎细胞浸润,提高心功能。因此,推测latifolin可通过改善炎性微环境提高BM-MSCs生存率和增强BM-MSCs定向分化能力,进而提高BM-MSCs移植治疗心肌梗死疗效。本研究探索latifolin对BM-MSCs生存率和心肌定向分化的作用,以达到增强BM-MSCs移植治疗缺血性心脏病目的,为心肌梗死细胞治疗和心肌再生研究奠定基础。研究方法:1.采用全骨髓提取法收集大鼠BM-MSCs,倒置显微镜观察培养细胞形态;采用流式细胞仪检测BM-MSCs表面抗原CD29、CD90、CD34和CD45。2.采用噻唑蓝（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium,MTT）法和Annexin V-FITC/PI双染法测定缺血、缺氧和炎性微环境对BM-MSCs活力和凋亡的影响;采用RT-PCR和酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs炎性因子表达和分泌影响;MTT法和Annexin V-FITC/PI双染法测定latifolin对BM-MSCs的活力和凋亡作用;ELISA测定latifolin对BM-MSCs炎性因子的影响。3.将BM-MSCs分为正常组、5氮杂胞苷（5-azacytidine,5Aza）诱导组、5Aza+latifolin诱导组和latifolin诱导组,显微镜下观察BM-MSCs向心肌细胞分化的形态学变化;RT-PCR检测心脏特异性基因转录因子GATA4、NKX2.5和肌细胞增强因子-2C（myocyte enhancer factor2C,MEF2C）的表达;免疫荧光染色检测心脏特异性蛋白α-肌动蛋白（alpha sarcomeric actin,a-actinin）和心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I,cTnI）的表达;透射电镜观察各组骨髓间充质干细胞分化的超微结构。4.（1）体外建立BM-MSCs和H9c2共培养体系,实验分组分别为:H9c2正常组;H9c2模型组;H9c2+MSC共培养组;H9c2+MSC共培养+药物（2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL）组,对共培养体系进行缺血缺氧和炎症造模处理,经latifolin干预后,采用Annexin V/PI测定H9c2凋亡情况;（2）冠状动脉左前降支结扎建立急性心肌梗死模型,实验共分成9组:假手术组、MI模型组、MSC移植组、MSC移植+latifolin（25,50,100 mg/kg）组、latifolin（25,50,100 mg/kg）组,PowerLab监测冠状动脉左前降支结扎前后心电图ST段变化以评价造模情况;检测给药7d血清中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）、肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase isoenzyme MB,CK-MB）含量以评价心肌损伤情况;心脏超声评价心功能;TTC染色法测定梗死面积;HE染色评价心肌病理损伤;Masson染色评价心肌胶原纤维化;免疫荧光法检测BM-MSCs生存率和分化情况;免疫组化测定CD68和MPO阳性表达数量;WB检测心肌组织中IL-6、p-NF-κB、β-catenin和缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）蛋白表达情况。结果:1.倒置显微镜观察BM-MSCs呈纺锤形,放射性及螺旋生长;流式细胞仪检测BM-MSCs表面抗原CD29、CD90、CD34和CD45表达率分别为:99.8%、99.5%、0.2%、4.7%。2.（1）MTT和Annexin V-FITC/PI检测结果显示,氧糖剥夺6h和12h后细胞活力明显增强,氧糖剥夺24h后细胞活力显着降低,在氧糖剥夺+肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor,TNF-α）及内毒素（lipopolysaccharide,LPS）条件下6、12、24h细胞活力显着降低;（2）ELISA和RT-PCR结果显示,氧糖剥夺6、12 h降低上清中白细胞介素-6（interleukin 6,IL-6）、白细胞介素-10（interleukin 10,IL-10）水平和细胞中IL-6、IL-10、TNF-α、核转录因子κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）基因表达;氧糖剥夺+TNF-α及LPS条件6、12 h显着升高上清中IL-6、TNF-α水平和细胞中IL-6、TNF-α、NF-κB基因表达;（3）MTT和Annexin V/PI结果显示,10μg/mL剂量下latifolin显着增加氧糖剥夺+TNF-α条件下BM-MSCs活力,显着降低其凋亡,latifolin显着降低氧糖剥夺+TNF-α条件的BM-MSCs分泌的IL-6、TNF-α水平。3.（1）BM-MSCs在单独用5Aza诱导和latifolin联合5Aza诱导2周后表现出形态上变化,其细胞膨大凸起,在第3周和第4周细胞间出现连接,形成肌管样结构;（2）RT-PCR结果显示,5μg/mL latifolin联合5Aza诱导组显着升高BM-MSCs特异性基因GATA4,NKX2.5和MEF2C表达;（3）免疫荧光染色的结果显示,5Aza诱导组及latifolin联合5Aza诱导组存在明显的心脏特异性蛋白质a-actinin和cTnI的表达;（4）透射电镜结果显示,latifolin联合5Aza诱导组的BM-MSCs分化后细胞质中有明显的心房颗粒、肌丝、丰富的线粒体和粗面内质网。4.（1）latifolin促进BM-MSCs修复受损心肌细胞的作用:Annexin V/PI测定结果显示,与正常组比,H9c2模型组细胞凋亡比例显着性升高;与模型组比较,H9c2+MSC共培养组、H9c2与MSC共培养+药物（10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL）组均能显着性降低H9c2凋亡比例;与H9c2+MSC共培养组比较,H9c2+MSC+10μg/mL给药组能显着降低H9c2凋亡。（2）latifolin促进BM-MSCs移植治疗心肌梗死作用及机制研究:（1）PowerLab检测结果显示,心肌梗死后心电图有ST段明显抬高表现;（2）给药7d后,MSC+latifolin高剂量组显着降低LDH含量,显着降低CK-MB含量;（3）超声结果显示,MSC+latifolin高剂量组显着升高左室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）、左室缩短分数（Left ventricular shortening fraction,LVFS）和心输出量（Cardiac output,CO）,显着提高心功能;（4）TTC染色结果显示,模型组梗死面积达到39%,单独MSC组及MSC与latifolin联合组均能显着性降低梗死面积;（5）HE染色结果显示,MSC+latifolin高剂量组明显改善梗死周边炎症细胞浸润和肌丝溶解情况;（6）Masson染色结果显示,MI造模后梗死区呈大面积蓝色染色,胶原纤维化明显,MSC+latifolin中、高剂量组显着减少心肌胶原纤维化面积;（7）免疫荧光检测结果显示,MSC+latifolin高剂量组显着增加BM-MSCs在心肌组织中的生存率和分化率;（8）免疫组化测定结果显示,MSC移植组+latifolin低、中、高剂量组和latifolin低、中、高剂量组均能显着降低CD68阳性表达数量,对MPO阳性表达数量无显着影响;（9）WB检测结果显示,MSC+latifolin高剂量组显着降低心肌组织中IL-6、p-NF-κB和HIF-1α蛋白表达,显着升高β-catenin蛋白表达。结论:采用全骨髓提取法获得的细胞为纯度较高的BM-MSCs,降香新黄酮latifolin通过改变炎症微环境显着提高BM-MSCs生存率,latifolin显着促进BM-MSCs向心肌细胞分化,latifolin显着促进BM-MSCs修复受损心肌细胞;经动物实验证实,latifolin通过降低炎性巨噬细胞浸润改善心肌组织中炎性微环境,显着提高在体BM-MSCs移植生存率和心肌细胞分化率,使受损心肌组织明显得到修复,latifolin有效增强BM-MSCs移植治疗心肌梗死效果,其作用机制可能与HIF-1α/NF-κB/β-catenin通路有关。
王璐[9]（2019）在《淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞的凋亡及线粒体自噬的机理研究》文中提出干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞,具有十分广阔的应用前景,已被广泛应用至多种疾病的临床研究中,但是临床上移植入体内的干细胞存活率低,限制了其推广应用。因此,亟需新的治疗策略改进干细胞抵御体内恶劣微环境的能力。天然药物独具优势,前期实验发现淫羊藿素（icaritin,ICT）预处理后的人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）治疗急性肝衰竭大鼠,死亡率进一步降低,肝脏病理、肝功能得到进一步改善,但是内在机理尚不清楚。预实验发现ICT可以增加体外培养的hUC-MSCs的细胞活力,调节多种细胞因子的分泌,并减少细胞的凋亡,电镜下可见ICT减少了自噬小体包裹的线粒体数量,因此,本研究将从细胞凋亡与线粒体自噬入手,探索淫羊藿素影响人脐带间充质干细胞的机制,为中药联合干细胞疗法提供理论依据。目的:本研究首先通过文献综述,为实验提供理论支持;随后在体外采用无血清培养部分模拟体内微循环障碍的环境,使用ICT干预hUC-MSCs,探索其是否具有抗凋亡作用,并深入研究是否通过HGF（肝细胞生长因子）/c-Met通路发挥作用;观察ICT能否干预hUC-MSCs的线粒体自噬过程;同时采用蛋白质谱,分析ICT预处理后的hUC-MSCs的差异表达蛋白,并进行GO分析、KEGG分析、蛋白互作分析等生物信息学分析,评估淫羊藿素参与的生物学过程。方法:人脐带间充质干细胞无血清培养72小时作为基本的造模方式,模拟微循环障碍的体内环境。不同浓度的ICT干预造模细胞,用MTS法测定其0D值,筛选最佳处理浓度。BrdU掺入试验检测Control组（正常培养组）、Serum free组（无血清培养组）、ICT组（淫羊藿素组）、HGF组（肝细胞生长因子组）的细胞增殖率。ELISA法检测ICT促进hUC-MSCs的HGF分泌情况。WB与qRT-PCR法检测ICT影响hUC-MSCs的c-Met受体表达情况。转染构建c-Met+MSCs,通过qRT-PCR和WB检验其转染效率。使用CCK8法筛选c-Met受体抑制剂克唑替尼（crizotinib）的最佳作用浓度。采用AnnexinV-FITC/PI凋亡检测,评估各组细胞凋亡率。qRT-PCR与WB检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3、Bax的表达。MTS法检测不同浓度的自噬抑制剂3MA对造模细胞的影响。使用qRT-PCR、WB以及免疫荧光显微镜检测线粒体外膜蛋白tomm20、线粒体内膜蛋白timm23、线粒体基质蛋白细胞色素c氧化酶亚基II（MT-C02）、自噬相关蛋白LC3B的表达情况。透射电镜观察各组细胞的超微结构,重点观察其线粒体自噬水平。采用qRT-PCR筛选ICT干预hUC-MSCs线粒体自噬的相关通路。使用JC-1膜电位检测试剂盒检测膜电位情况。采用蛋白质谱进行各组细胞差异蛋白的生物信息学分析。结果:1.不同浓度的淫羊藿素处理无血清培养hUC-MSCs,各处理浓度均提高了其细胞活力,但是仅50ng/ml（0.1uM）、100ng/ml具有统计学意义（P<0.05）。选择50ng/ml为最佳处理浓度进行后续实验。BrdU检测显示较Control组,Serum free组增殖率下降（P<0.05）,而使用ICT或者HGF均提高了细胞增值率（P<0.05）。2.人脐带间充质干细胞本身可分泌HGF,也表达HGF的受体c-Met,而ICT能够促进其表达更高水平的HGF与c-Met受体（P<0.05）。构建c-Met+MSCs后,WB与qRT-PCR法证实了基因转染成功。根据细胞抑制率,筛选4 u M为克唑替尼（c-Met受体抑制剂）的最佳处理浓度。MSCs在无血清培养72h时凋亡率较高,c-Met+MSCs的细胞凋亡率显着降低（P<0.01）,克唑替尼处理后,细胞凋亡率显着增高（P<0.01）,提示HGF/c-Met通路对于MSCs具有抗凋亡作用。WB显示,对比MSCs组,c-Met+MSCs组Bcl-2的表达上调且Cleaved caspase-3、Bax表达下调（P<0.05）,克唑替尼则使Bcl-2蛋白水平降低,Cleaved caspase-3和Bax蛋白表达增加,qRT-PCR验证了上述结论。提示HGF/c-Met通路通过调控凋亡蛋白的表达发挥抗凋亡作用。3.MSCs在无血清培养72h时凋亡率较高,ICT或HGF处理后,MSCs凋亡率显着降低（P<0.05）。当使用c-Met受体抑制剂克唑替尼时,拮抗了 ICT的抗凋亡作用,差异有统计学意义（P<0.01）。这表明克唑替尼可以抑制ICT对MSCs的保护作用,ICT对MSCs的抗凋亡作用与HGF/c-Met通路相关。WB显示,ICT或HGF处理后的MSCs的Bcl-2表达上调且Cleaved caspase-3、Bax表达下调（P<0.05）,对比ICT组,加用克唑替尼后可使Bcl-2蛋白水平降低,使Cleaved caspase-3和Bax蛋白的表达增加,qRT-PCR验证了上述结论。提示ICT通过HGF/c-Met通路调控凋亡蛋白的表达发挥抗凋亡作用。4.低浓度的自噬抑制剂3-MA对造模细胞的活性具有促进作用（P<0.05）,而高浓度的自噬抑制剂3-MA抑制了细胞活性（P<0.01）。提示无血清培养条件下,适度的抑制细胞自噬有利于细胞的存活,而过度的抑制细胞自噬则会降低细胞活力,不利于细胞存活。5.与Control组比较,Serum free组MSCs的线粒体外膜蛋白tomm20、线粒体内膜蛋白timm23、线粒体基质蛋白细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ（MT-C02）均会减少,自噬蛋白LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表达均增加,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率提高,线粒体膜电位降低,提示线粒体自噬水平被上调,电镜可见细胞内“线粒体自噬体”（被自噬小体包裹的线粒体）显着增多,损伤线粒体增加,细胞形态不佳,证实了无血清培养增加了线粒体自噬;而ICT或者HGF干预后上述线粒体蛋白表达增加,自噬蛋白LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表达均减少,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率降低,线粒体膜电位升高,提示线粒体自噬水平被下调。电镜可见胞内“线粒体自噬体”减少,损伤线粒体减少,细胞形态得到一定的改善,证实了ICT和HGF均减少了线粒体自噬。6.采用qRT-PCR进行Pink1/Parkin通路,FUNDC1通路以及Bnip3/Nix通路的筛选,结果如下:Pink1、Bnip3的mRNA与前述线粒体自噬趋势相符,Nix、FUNDC1的mRNA呈现出相矛盾的趋势。7.蛋白质谱分析:通过GO分析,发现Control组与Serum free组的差异蛋白,以及ICT组与Serum-free组之间,HGF组与Serum free组之间的差异蛋白,均参与细胞凋亡、自噬、线粒体自噬相关的生物过程（P<0.05）。对ICT组与Serum free组的差异蛋白进行分析,AKT1位于蛋白互作中心节点位置,KEGG分析PI3K-AKT通路具有统计学意义,可作为研究的重点通路。对于HGF组与Serum free组之间的差异蛋白进行分析,筛选出NF-κ B通路作为研究重点通路。结论:1.淫羊藿素能够通过HGF/c-Met通路降低无血清培养的人脐带间充质干细胞的凋亡率,与调节Cleaved Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表达水平有关。2.淫羊藿素或肝细胞生长因子均可降低无血清培养的人脐带间充质干细胞的线粒体自噬水平,减少损伤线粒体数目,改善细胞形态,增加线粒体蛋白tomm20、timm23、MTC02的表达,提高线粒体膜电位。3.蛋白质谱分析发现淫羊藿素或肝细胞生长因子介导的差异蛋白参与细胞凋亡、自噬、线粒体自噬相关的生物过程,对于ICT,PI3K-AKT通路可作为研究重点通路,对于HGF,NF-κ B通路可作为研究重点。
郭洋[10]（2019）在《人经血干细胞携带溶瘤腺病毒用于结直肠癌的治疗研究》文中提出结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是一类常见的消化系统恶性肿瘤,严重威胁人类健康。传统的放化疗并不能显着提高患者的生存率,因而探索一种新型有效的结直肠癌治疗手段至关重要,近些年溶瘤病毒的肿瘤治疗应运而生。溶瘤病毒可选择性地在肿瘤细胞中复制并裂解肿瘤细胞,同时激活机体的抗肿瘤免疫反应;然而,直接通过静脉注射溶瘤病毒会引起抗病毒免疫反应而降低其作用效果,因而选择合适的载体将溶瘤病毒运输至肿瘤部位是实现安全、高效、精准治疗的关键。本研究我们利用人经血干细胞（Human menstrual blood-derived stem cells,Men SCs）运输溶瘤腺病毒,探索其作为载体的靶向运输能力和结合溶瘤腺病毒对CRC的治疗效果。MenSCs是近年来新发现的一种成体干细胞,与其他间充质干细胞相比,具有来源丰富、采集方便无创、体外扩增迅速、无伦理道德争议等优势。本研究中,我们首先从女性志愿者经血样本中分离获取经血源干细胞,并对其进行传代培养和相关表面标记的鉴定,进而探索其作为病毒运输载体的可行性和结合溶瘤病毒治疗CRC的有效性。为了优化溶瘤病毒对Men SCs的感染效率,我们构建了一种新型嵌合型的溶瘤腺病毒CRAd5/F11,将11型腺病毒的纤毛嵌入5型腺病毒结构中,这种嵌合型病毒主要通过识别细胞表面受体CD46感染细胞;通过一定滴度的CRAd5/F11感染后,Men SCs的细胞活性及其免疫表型并未受到明显影响,且Men SCs-CRAd5/F11细胞株在体内外迁移实验中均能够靶向肿瘤组织或细胞,证实了Men SCs作为溶瘤病毒靶向运输载体的可行性;我们进一步探索了Men SCs-CRAd5/F11细胞株对结直肠癌的治疗潜能,体外研究中,我们利用CCK8和细胞凋亡等体外实验检测了Men SCs-CRAd5/F11对肿瘤细胞的杀伤作用,最后在体内结直肠癌小鼠模型中通过不同方式对Men SCs-CRAd5/F11进行移植,一定时间后观察到小鼠肿瘤的生长明显受到抑制,由此证实利用Men SCs运载CRAd5/F11治疗结直肠癌的有效性。综上所述,Men SCs是一种充满潜能的细胞载体,其能够将嵌合型溶瘤病毒CRAd5/F11安全有效地运输至肿瘤部位并发挥抗肿瘤作用,利用Men SCs装载溶瘤病毒可实现对结直肠癌的病毒靶向治疗,为临床结直肠癌及其他肿瘤的治疗提供了理论依据。
二、骨髓间充质干细胞(MSC_S)诱导分化为心肌细胞研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、骨髓间充质干细胞(MSC_S)诱导分化为心肌细胞研究进展（论文提纲范文）
（1）HCN2和HCN4对骨髓间充质干细胞向具有起搏功能的心肌细胞分化的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 猪骨髓间充质干细胞(MSCS)的分离培养诱导分化 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 主要实验仪器与材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 猪骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导神经元样细胞 |
| 2.2 猪骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导脂肪细胞 |
| 2.3 猪骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导心肌细胞 |
| 3. 讨论 |
| 第二部分 HCN2和HCN4对骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 骨髓干细胞(BMSCs)提取 |
| 1.2 流式细胞术检测骨髓间充质干细胞表面抗原 |
| 1.3 骨髓间充质干细胞的分化和分组 |
| 1.4 免疫荧光染色 |
| 1.5 免疫印迹 |
| 1.6 全细胞膜片钳技术 |
| 1.7 统计分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 猪骨髓间充质干细胞的分离与鉴定 |
| 2.2 HCN2和HCN4可显着增加骨髓间充质干细胞向心肌细胞的体外分化 |
| 2.3 HCN2和HCN4恢复体外培养的BMSCs细胞的离子电流 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第三部分 HCN1、HCN2和HCN4转染BMSCS后诱导为具有起搏样电流细胞的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要实验仪器和材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 转染后MSCs用全细胞膜片钳记录稳定转染HCN阳性干细胞起搏离子通道电流 |
| 2.2 HCN2和HCN4联合转染后MSCs诱导为起搏样细胞的形态 |
| 3. 讨论 |
| 本实验的不足和未来展望 |
| 参考文献 |
| 综述 HCN通道与心脏生物起搏研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）葛根素诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 间充质干细胞适用于心血管疾病治疗的特性及其发挥作用的机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）针刺联合骨髓间充质干细胞移植改善大鼠急性心肌缺血研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI作用研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI相关分子机制研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 针刺治疗心肌缺血及相关分子机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（4）不同来源间充质干细胞外泌体修复缺血受损心肌功能差异及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 间充质干细胞的分离、培养及外泌体的提取与鉴定 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 间充质干细胞培养 |
| 2.2 间充质干细胞鉴定 |
| 2.3 MSC外泌体的提取 |
| 2.4 外泌体鉴定 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 间充质干细胞形态观察 |
| 3.2 间充质干细胞鉴定结果 |
| 3.3 外泌体鉴定 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 不同来源间充质干细胞外泌体心肌修复功能的比较 |
| 1.材料 |
| 1.1 间充质干细胞来源的外泌体及细胞 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 体外实验 |
| 2.2 体内实验 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 体外实验 |
| 3.2 体内实验 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 不同来源间充质干细胞外泌体的蛋白质组学分析及功能验证 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞及外泌体准备 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 蛋白提取 |
| 2.2 胰酶酶解 |
| 2.3 液相色谱-质谱联用分析(LC-MS/MS Analysis) |
| 2.4 数据库搜索 |
| 2.5 蛋白质生物信息学分析 |
| 2.6 差异蛋白验证 |
| 2.7 统计方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 两种来源MSC外泌体的蛋白表达谱分析 |
| 3.2 蛋白质注释结果 |
| 3.3 差异表达蛋白质功能富集分析 |
| 3.4 验证差异蛋白的选择 |
| 3.5 差异蛋白验证结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 干细胞来源的外泌体在心肌梗死治疗中的作用进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间主要科研成果 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
（5）兔骨髓间充质干细胞体外构建血管化组织工程心肌的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第1章 实验研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验动物与试剂 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.1.3 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 兔骨髓间充质干细胞的分离 |
| 1.2.2 兔骨髓间充质干细胞的培养及鉴定 |
| 1.2.3 兔骨髓源性内皮细胞的获取、培养及鉴定 |
| 1.2.4 兔骨髓间充质干细胞定向诱导为为心肌样细胞 |
| 1.2.5 DAPI荧光染料和CM-DIL荧光染料分别标记心肌样细胞与兔骨髓源性内皮细胞 |
| 1.2.6 体外构建血管化细胞-支架材料复合物 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定 |
| 1.3.2 骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞及鉴定 |
| 1.3.3 支架材料的选择 |
| 1.3.4 组织工程心肌的血管化 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第2章 综述 组织工程技术在心肌细胞再生中的应用现状 |
| 2.1 细胞资源(种子细胞) |
| 2.2 基质(支架材料) |
| 2.3 应用线索(生化或生物物理线索) |
| 2.4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间研究成果 |
（6）外泌体介导心肌损伤保护作用的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 2 总体设计思路 |
| 参考文献 |
| 第一部分 研究多种来源外泌体在体外循环围手术期的改变情况 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究骨髓间充质干细胞来源外泌体调控自噬发挥心肌保护作用机制 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 外泌体的研究进展及在心血管疾病中的临床应用价值 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
（7）ADSC-CM对小型猪腹腔镜肝IRI合并部分肝切除保护作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 腹腔镜微创技术简介 |
| 1.1.1 腹腔镜微创技术的发展简介 |
| 1.1.2 腹腔镜肝切除术的发展应用 |
| 1.1.3 腹腔镜微创技术的客观评价 |
| 1.1.4 腹腔镜微创技术的发展方向 |
| 1.2 肝脏缺血再灌注损伤 |
| 1.2.1 肝脏缺血再灌注损伤的发生机制 |
| 1.2.2 肝脏缺血再灌注损伤的预防治疗 |
| 1.2.3 探究肝脏缺血再灌注损伤的实验动物模型 |
| 1.3 间充质干细胞概述 |
| 1.3.1 干细胞的生物学特性与分类 |
| 1.3.2 间充质干细胞的由来与定义 |
| 1.3.3 间充质干细胞生物学功能 |
| 1.3.4 间充质干细胞作用机制 |
| 1.3.5 干细胞临床应用的安全性 |
| 1.4 间充质干细胞条件培养基 |
| 1.4.1 间充质干细胞的旁分泌作用 |
| 1.4.2 间充质干细胞条件培养基的治疗作用 |
| 1.4.3 脂肪间充质干细胞条件培养基 |
| 1.4.4 脂肪间充质干细胞条件培养基的临床应用 |
| 1.5 目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 试验器材 |
| 2.1.3 试验药品及试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 小型猪脂肪间充质干细胞的分离培养 |
| 2.2.2 改良后小型猪脂肪间充质干细胞的鉴定 |
| 2.2.3 改良后小型猪脂肪间充质干细胞的评估 |
| 2.2.4 小型猪脂肪间充质干细胞条件培养液的提取制备 |
| 2.2.5 小型猪腹腔镜下肝缺血再灌注合并部分切除模型的建立 |
| 2.2.6 腹腔镜建立肝缺血再灌注合并部分切除模型的安全性监测 |
| 2.2.7 小型猪ADSC-CM对血液常规指标的影响 |
| 2.2.8 小型猪ADSC-CM对肝组织形态学观察 |
| 2.2.9 小型猪ADSC-CM对肝脏酶谱的影响 |
| 2.2.10 小型猪ADSC-CM对肝脏氧化应激的影响 |
| 2.2.11 小型猪ADSC-CM对炎症反应的影响 |
| 2.2.12 小型猪ADSC-CM对肝细胞凋亡的影响 |
| 2.2.13 小型猪ADSC-CM对肝再生的影响 |
| 2.2.14 小型猪ADSC-CM成分检测 |
| 2.2.15 数据统计分析方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 小型猪脂肪间充质干细胞的分离培养和形态比较 |
| 3.2 小型猪脂肪间充质干细胞的鉴定 |
| 3.2.1 表面抗原的鉴定 |
| 3.2.2 成骨分化能力的鉴定 |
| 3.2.3 成脂分化能力的鉴定 |
| 3.2.4 成肝分化能力的鉴定 |
| 3.3 改良后小型猪脂肪间充质干细胞的评估 |
| 3.3.1 增殖能力的比较 |
| 3.3.2 迁移能力的比较 |
| 3.4 小型猪脂肪间充质干细胞条件培养液的提取制备 |
| 3.4.1 小型猪脂肪间充质干细胞条件培养液的提取 |
| 3.4.2 小型猪脂肪间充质干细胞条件培养液的浓缩 |
| 3.5 腹腔镜建立肝损伤模型安全性监测结果 |
| 3.6 血液常规指标检测结果 |
| 3.6.1 白细胞(WBC) |
| 3.6.2 中性粒细胞(NE) |
| 3.6.3 淋巴细胞(LY) |
| 3.7 肝组织形态学观察结果 |
| 3.7.1 肝脏病理结构观察结果 |
| 3.7.2 肝脏超微结构观察结果 |
| 3.8 术后肝脏酶谱检测结果 |
| 3.8.1 谷丙转氨酶(ALT) |
| 3.8.2 谷草转氨酶(AST) |
| 3.8.3 碱性磷酸酶(ALP) |
| 3.8.4 乳酸脱氢酶(LDH) |
| 3.8.5 总胆红素(TBIL) |
| 3.8.6 总蛋白(TP) |
| 3.9 肝组织氧化应激检测结果 |
| 3.9.1 丙二醛(MDA) |
| 3.9.2 超氧化物歧化酶(SOD) |
| 3.9.3 过氧化氢酶(CAT) |
| 3.9.4 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) |
| 3.9.5 髓内过氧化物酶(MPO) |
| 3.10 炎症反应水平检测结果 |
| 3.10.1 血清炎症相关指标检测结果 |
| 3.10.2 肝脏组织炎症相关基因水平检测结果 |
| 3.11 肝细胞凋亡水平检测结果 |
| 3.11.1 肝脏组织凋亡相关酶活性检测结果 |
| 3.11.2 肝脏组织凋亡相关基因水平检测结果 |
| 3.11.3 肝脏组织凋亡相关蛋白水平检测结果 |
| 3.11.4 肝脏组织Fas和Fasl免疫组织化学染色结果 |
| 3.11.5 肝脏组织TUNEL染色结果 |
| 3.12 肝脏再生水平检测结果 |
| 3.12.1 血清再生相关指标检测结果 |
| 3.12.2 组织再生相关基因检测结果 |
| 3.12.3 组织再生相关蛋白检测结果 |
| 3.12.4 肝脏组织Ki67免疫组织化学染色结果 |
| 3.13 小型猪ADSC-CM成分分析结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ADSCs培养方法的改良 |
| 4.2 ADSC-CM对肝脏缺血再灌注损伤的研究基础 |
| 4.3 ADSC-CM对小型猪肝脏功能的影响 |
| 4.4 ADSC-CM对小型猪氧化应激的影响 |
| 4.5 ADSC-CM对小型猪炎症反应的影响 |
| 4.6 ADSC-CM对小型猪细胞凋亡的影响 |
| 4.7 ADSC-CM对小型猪肝脏再生的影响 |
| 4.8 小型猪ADSC-CM成分分析的探讨 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（8）降香新黄酮latifolin促进骨髓间充质干细胞对缺血性心脏病心肌修复作用及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 第一部分 骨髓间充质干细胞提取、培养和鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验仪器与材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 相关溶液的配制 |
| 2.2 BM-MSCs提取、培养和传代 |
| 2.3 BM-MSCs鉴定 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 BM-MSCs形态观察 |
| 3.2 BM-MSCs表面抗原标志物鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 latifolin通过改变炎性微环境对骨髓间充质干细胞的保护作用 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 受试药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 实验仪器与材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 相关溶液的配制 |
| 2.2 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs生存率影响 |
| 2.3 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs凋亡的影响 |
| 2.4 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs炎性因子分泌影响 |
| 2.5 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs炎性基因表达影响 |
| 2.6 latifolin对缺血、缺氧和炎症环境中BM-MSCs活力的影响 |
| 2.7 latifolin对缺血、缺氧和炎症环境中BM-MSCs凋亡的影响 |
| 2.8 latifolin对缺血、缺氧和炎症环境中BM-MSCs炎性因子分泌影响…. |
| 2.9 数据处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs形态的影响 |
| 3.2 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs活力的影响 |
| 3.3 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs凋亡的影响 |
| 3.4 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs炎症因子基因表达的影响 |
| 3.5 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs炎性因子分泌的影响 |
| 3.6 缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs中 NF-κB的影响 |
| 3.7 latifolin对缺血、缺氧和炎症环境中BM-MSCs活力的影响 |
| 3.8 latifolin对缺血、缺氧和炎症环境中BM-MSCs凋亡影响 |
| 3.9 latifolin对缺血、缺氧和炎症环境中BM-MSCs炎性因子分泌的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 latifolin促进骨髓间充质干细胞定向心肌分化作用 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 受试药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 实验仪器与材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 相关溶液的配制 |
| 2.2 实验分组和诱导分化 |
| 2.3 倒置显微镜观察分化细胞形态 |
| 2.4 RT-PCR测定分化细胞心肌特异性基因表达 |
| 2.5 免疫荧光法检测分化细胞心肌特异性蛋白表达 |
| 2.6 透射电镜观察分化细胞结构 |
| 2.7 数据处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 倒置显微镜观察分化细胞形态 |
| 3.2 RT-PCR测定分化细胞心肌特异性基因表达 |
| 3.3 免疫荧光法检测分化细胞心肌特异性蛋白表达 |
| 3.4 透射电镜观察分化细胞结构 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四部分 latifolin促进骨髓间充质干细胞修复受损心肌作用及机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 受试细胞 |
| 1.3 受试药物 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 实验仪器与材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 相关溶液的配制 |
| 2.2 latifolin促进BM-MSCs修复受损心肌细胞的作用 |
| 2.2.1 H9c2 细胞培养 |
| 2.2.2 BM-MSCs与 H9c2 细胞共培养体系建立 |
| 2.2.3 细胞处理和实验分组 |
| 2.2.4 Annexin V/PI法测定共培养条件下H9c2 细胞凋亡 |
| 2.3 latifolin促进BM-MSCs移植治疗心肌梗死作用及机制研究 |
| 2.3.1 实验分组和给药 |
| 2.3.2 BM-MSCs标记 |
| 2.3.3 心肌梗死模型建立 |
| 2.3.4 BM-MSCs移植 |
| 2.3.5 大鼠血清中心肌损伤标志物检测 |
| 2.3.6 超声心动图评价大鼠心功能 |
| 2.3.7 TTC染色检测大鼠心脏梗死面积 |
| 2.3.8 HE染色评价大鼠心肌病理损伤情况 |
| 2.3.9 Masson染色评价大鼠心肌胶原纤维化情况 |
| 2.3.10 免疫荧光检测BM-MSCs生存率和心肌分化情况 |
| 2.3.11 免疫组织化学检测组织中炎性细胞情况 |
| 2.3.12 WB检测组织中炎症和分化通路相关蛋白表达情况 |
| 2.4 数据处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 latifolin促进BM-MSCs修复受损心肌细胞的作用 |
| 3.1.1 Annexin V/PI法测定共培养条件下H9c2 细胞凋亡 |
| 3.2 latifolin促进BM-MSCs移植治疗心肌梗死作用及机制研究 |
| 3.2.1 MI心电图监测 |
| 3.2.2 BM-MSCs标记CM-Dil |
| 3.2.3 实验大鼠死亡情况 |
| 3.2.4 大鼠血清中LDH、CK-MB含量 |
| 3.2.5 超声心动图评价大鼠心功能 |
| 3.2.6 TTC染色评价大鼠心脏面积 |
| 3.2.7 HE染色评价心肌损伤和炎性细胞情况 |
| 3.2.8 Masson染色评价心肌胶原纤维化情况 |
| 3.2.9 免疫荧光检测BM-MSCs生存率和心肌分化情况 |
| 3.2.10 免疫组织化学检测组织中炎性细胞情况 |
| 3.2.11 WB检测组织中炎症和分化通路相关蛋白表达情况 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新点 |
| 本研究的不足 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简介 |
（9）淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞的凋亡及线粒体自噬的机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 研究背景 |
| 一、补肾中药调控干细胞的相关研究 |
| 1. 淫羊藿对干细胞的调控 |
| 2. 其他补肾中药对干细胞的调控 |
| 二、HGF在干细胞领域的研究进展 |
| 1. HGF的概述 |
| 2. HGF对干细胞的影响 |
| 三、线粒体自噬的研究进展 |
| 1. 线粒体自噬的概述 |
| 2. 中药调控线粒体自噬 |
| 第二部分 淫羊藿素通过HGF/c-Met通路增强人脐带间充质干细胞抗凋亡能力的实验研究 |
| 一、实验材料 |
| 1. 实验细胞 |
| 2. 实验仪器 |
| 3. 实验试剂与耗材 |
| 4. 主要试剂的配制 |
| 二、实验方法 |
| 1. 细胞培养 |
| 2. MTS法测细胞活力 |
| 3. CCK8法测细胞活力 |
| 4. BrdU掺入试验测细胞增殖率 |
| 5. 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 6. western blot(化学)方法检测蛋白表达 |
| 7. qRT-PCR检测mRNA表达水平 |
| 8. 质粒提取与细胞转染 |
| 9. ELISA法测蛋白表达 |
| 10. 统计学方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 淫羊藿素促进人脐带间充质干细胞的细胞活力与增殖活性 |
| 2. HGF/c-Met通路在人脐带间充质干细胞中具有抗凋亡作用 |
| 3. 淫羊藿素通过HGF/c-Met通路抑制人脐带间充质干细胞凋亡 |
| 四、讨论 |
| 第三部分 淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞线粒体自噬的实验研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 1. MTS法测细胞活力 |
| 2. western blot(荧光)方法检测蛋白表达 |
| 3. qRT-PCR检测mRNA表达水平 |
| 4. MitoTracker与目标蛋白共标记进行免疫荧光显微镜检测 |
| 5. 线粒体膜电位检测(JC-1) |
| 6. 电镜检测 |
| 7. 统计学方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 自噬抑制剂3-MA对无血清培养人脐带间充质干细胞的影响 |
| 2. 淫羊藿素增加无血清培养人脐带间充质干细胞的线粒体蛋白 |
| 3. 淫羊藿素抑制无血清培养人脐带间充质干细胞的线粒体自噬 |
| 4. 淫羊藿素提高无血清培养人脐带间充质干细胞的线粒体膜电位 |
| 四、讨论 |
| 第四部分 淫羊藿素预处理人脐带间充质干细胞蛋白质组学分析 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 蛋白浓度测定结果 |
| 2. 差异蛋白筛选结果 |
| 3. 生物信息学分析 |
| 四、讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（10）人经血干细胞携带溶瘤腺病毒用于结直肠癌的治疗研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 经血干细胞的分离培养及鉴定 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料和试剂 |
| 1.2.1 MenSCs的来源 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 1.2.3 主要设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 MenSCs的分离培养 |
| 1.3.2 细胞冻存和复苏 |
| 1.3.3 MenSCs细胞表面标记分子鉴定 |
| 1.3.4 MenSCs诱导分化实验 |
| 1.3.5 免疫荧光检测MenSCs表面干性分子 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 MenSCs的分离培养 |
| 1.4.2 MenSCs细胞成骨成脂分化结果 |
| 1.4.3 MenSCs细胞表面标记分子流式鉴定结果 |
| 1.4.4 MenSCs表面干性标记的表达 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 结论 |
| 第二部分 MenSCs-CRAd5/F11 细胞株的构建及功能鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要设备 |
| 2.2.3 MenSCs及肿瘤细胞系来源 |
| 2.2.4 结直肠癌细胞的培养 |
| 2.2.5 溶瘤腺病毒CRAd5/F11的构建及分离纯化 |
| 2.2.6 动物实验 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Western Blot检测MenSCs表面受体蛋白表达 |
| 2.3.2 CRAd5/F11 感染MenSCs |
| 2.3.3 电镜的检测CRAd5/F11 |
| 2.3.4 CRAd5/F11对MenSCs毒性作用的检测 |
| 2.3.5 CRAd5/F11 感染后MenSCs上清中病毒颗粒数的检测 |
| 2.3.6 MenSCs-CRAd5/F11 细胞表面标记分子鉴定 |
| 2.3.7 MenSCs-CRAd5/F11 对肿瘤细胞的趋化实验 |
| 2.3.8 MenSCs-CRAd5/F11 在肿瘤小鼠体内的迁移实验 |
| 2.3.9 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 MenSCs表面受体蛋白的表达 |
| 2.4.2 溶瘤病毒对MenSCs感染效率的检测 |
| 2.4.3 MenSCs细胞内病毒颗粒的电镜检测 |
| 2.4.4 CRAd5/F11对MenSCs的毒性作用 |
| 2.4.5 感染CRAd5/F11的MenSCs上清中病毒颗粒数检测 |
| 2.4.6 MenSCs-CRAd5/F11 表面标记的表达情况 |
| 2.4.7 MenSCs-CRAd5/F11 体外对肿瘤细胞的趋化作用 |
| 2.4.8 MenSCs-CRAd5/F11 在体内对肿瘤组织的归巢作用 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 CRAd5/F11 依赖细胞受体CD46 感染MenSCs |
| 2.5.2 CRAd5/F11对MenSCs和肿瘤细胞的毒性作用 |
| 2.5.3 MenSCs-CRAd5/F11 对肿瘤的靶向迁移 |
| 2.6 结论 |
| 第三部分 MenSCs运载CRAd5-F11 治疗结直肠癌的体内外实验研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要设备 |
| 3.2.3 MenSCs及肿瘤细胞系来源 |
| 3.2.4 溶瘤腺病毒CRAd5/F11及CRAd5/F11-TIS的构建 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 WB检测肿瘤细胞表面腺病毒结合受体的表达 |
| 3.3.2 CRAd5/F11对肿瘤细胞毒性作用的检测 |
| 3.3.3 运载CRAd5/F11的MenSCs对肿瘤细胞的抑制实验 |
| 3.3.4 荷瘤小鼠肿瘤模型的建立及肿块大小的测量 |
| 3.3.5 MenSCs的移植 |
| 3.3.6 组织标本的制备 |
| 3.3.7 肿瘤组织的免疫组化分析 |
| 3.3.8 肿瘤组织细胞凋亡的TUNEL检测 |
| 3.3.9 MenSCs-CRAd5/F11-TIS对肿瘤的作用 |
| 3.3.10 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 肿瘤细胞表面腺病毒受体蛋白的表达 |
| 3.4.2 溶瘤病毒对肿瘤细胞具有杀伤作用 |
| 3.4.3 携带CRAd5/F11的MenSCs对肿瘤细胞的杀伤作用 |
| 3.4.4 病毒抗体血清对溶瘤病毒杀伤肿瘤细胞的影响 |
| 3.4.5 体内动物实验操作及时间安排示意图 |
| 3.4.6 MenSCs-CRAd5/F11 移植后抑制肿瘤的生长 |
| 3.4.7 肿瘤组织免疫组化相关蛋白的检测 |
| 3.4.8 MenSCs-CRAd5/F11 诱导肿瘤组织凋亡 |
| 3.4.9 MenSCs-CRAd5/F11-TIS在体内对肿瘤的抑制作用 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 MenSCs运载CRAd5/F11 对肿瘤的治疗 |
| 3.5.2 溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤和抑制机制 |
| 3.5.3 溶瘤病毒结合基因治疗 |
| 3.5.4 溶瘤病毒CRAd5/F11从MenSCs胞内释放的机制探讨 |
| 3.5.5 MenSCs结合溶瘤病毒治疗肿瘤的安全性问题 |
| 3.6 结论 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 间充质干细胞的基本特性与疾病治疗的应用 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间取得的科研成果 |
四、骨髓间充质干细胞(MSC_S)诱导分化为心肌细胞研究进展（论文参考文献）
- [1]HCN2和HCN4对骨髓间充质干细胞向具有起搏功能的心肌细胞分化的影响[D]. 罗雪. 扬州大学, 2021(08)
- [2]葛根素诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究[D]. 王雪姣. 河北北方学院, 2020(06)
- [3]针刺联合骨髓间充质干细胞移植改善大鼠急性心肌缺血研究[D]. 李记泉. 辽宁中医药大学, 2020(01)
- [4]不同来源间充质干细胞外泌体修复缺血受损心肌功能差异及机制研究[D]. 陈一欢. 苏州大学, 2020(06)
- [5]兔骨髓间充质干细胞体外构建血管化组织工程心肌的实验研究[D]. 韩刘君. 华北理工大学, 2020(02)
- [6]外泌体介导心肌损伤保护作用的机制研究[D]. 倪达. 苏州大学, 2020(06)
- [7]ADSC-CM对小型猪腹腔镜肝IRI合并部分肝切除保护作用的研究[D]. 焦智慧. 东北农业大学, 2020(04)
- [8]降香新黄酮latifolin促进骨髓间充质干细胞对缺血性心脏病心肌修复作用及机制研究[D]. 张妮. 江西中医药大学, 2019(06)
- [9]淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞的凋亡及线粒体自噬的机理研究[D]. 王璐. 广州中医药大学, 2019(08)
- [10]人经血干细胞携带溶瘤腺病毒用于结直肠癌的治疗研究[D]. 郭洋. 浙江大学, 2019(01)