一、STR-PCR定量检测供受者嵌合体方法的建立及临床应用（论文文献综述）
杜胜男[1]（2019）在《定量检测微嵌合体对造血干细胞移植的意义分析》文中提出目的通过定量检测微嵌合体,并分析其动态变化,来早期观察异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）的早期植入情况和早期预测HSCT的复发风险,从而可以进行合适的干预治疗,以达到降低移植失败率的目的。同时对比脐血移植（CBT）和外周血干细胞移植（PBSCT）早期植入的规律。方法行allo-HSCT治疗多种恶性及非恶性难治性血液病15例。其中,中位年龄16岁（0.8-60岁）,中位体重42 kg（8-80 kg）。急性白血病（AL）5例,骨髓增生异常综合征（MDS）2例,再生障碍性贫血（AA）5例,重型β地中海贫血2例,湿疹血小板减少伴免疫缺陷综合征（WAS）1例。在15例患者中,行PBSCT有5例,输入的中位有核细胞数为85.60 x 10^7/kg（69.90-109.90 x 10^7/kg）,CD34+细胞计数为39.80 x 10^5/kg（30.70-49.40 x 10^5/kg）。而CBT有10例,输入的中位有核细胞数为8.91 x 10^7/kg（3.84-11.00 x 10^7/kg）,CD34+细胞计数为2.50 x 10^5/kg（1.34-4.57 x 10^5/kg）。收集患者移植后至少15天的外周血样本,使用插入或缺失多态性实时定量聚合酶链反应（Indel-qPCR）定量检测微嵌合体。结果15例患者中,15例（100%）获得了中性粒细胞植入和11例（73.3%）获得了血小板植入。13例患者通过微嵌合体的检测达到了完全供者嵌合（CDC）。在10名达到CDC并且没有混合嵌合增加（IMC）中,9名获得完全植入,1名中性粒细胞植入,血小板还未植入;3名达到CDC后出现1次IMC的患者中,中性粒细胞全部植入成功,血小板有2名成功植入;在2名出现多次IMC且始终未达到CDC的患者中,2名血小板未植入。在15例患者中,1例出现多次IMC的患者复发。在11例可评估的患者中,3例患者发生了II-IV级急性移植物抗宿主病（GVHD）。患者在存活超过100天的患者中,没有患者发生慢性GVHD。迄今为止,15名患者中有13名存活,中位生存时间为4.7个月（0.9-11.0月）。总生存率（OS）为86.7%。结论1.Indel-qPCR技术是一种有效的检测微嵌合体的方法,可以作为早期预测植入和复发风险的一种有效手段。2.通过对CBT和PBSCT的植入对比,虽然PBSCT血小板植入优于CBT,但是两者中性粒植入无明显不同,两者的总生存率也无明显不同,说明CBT可以作为治疗血液病的一种有效的手段。
洪睿敏[2]（2019）在《各系免疫细胞嵌合状态监测在异基因造血干细胞移植后的意义》文中进行了进一步梳理目的:探究分析异基因造血干细胞移植（Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT）后各系免疫细胞嵌合状态变化在判断移植物稳定植入、急性移植物抗宿主病（Acute graft versus host disease,aGVHD）、原发病复发、移植物排斥中的临床意义,以及巨细胞病毒（Cytomegalovirus,CMV）感染、EB病毒（Epstein-Barr Virus,EBV）感染与嵌合状态的关系。方法:纳入我科2016.06-2018.12行allo-HSCT的患者68例,于移植后+14d,+28d,此后每月定期采集所有患者外周血或骨髓行嵌合状态监测,直至移植后1年。其中骨髓增生异常综合征（MDS）19例,急性髓系白血病（AML）15例,急性淋巴细胞白血病（ALL）9例,重型再生障碍性贫血（SAA）6例,非霍奇金淋巴瘤（NHL）6例,慢性髓系白血病（CML）3例,急性混合细胞白血病（MPAL）3例,阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）2例,再生障碍性贫血-阵发性睡眠性血红蛋白尿综合征（AA-PNH综合征）1例,多发性骨髓瘤（MM）2例,重型地中海贫血2例。采用免疫磁珠分选技术分选CD3+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、CD56+CD16+NK细胞,并采用聚合酶式链反应扩增短串联重复序列（PCR-STR）动态监测各系免疫细胞嵌合状态和全血细胞嵌合状态。并随访统计各患者的造血重建时间,aGVHD的发生和临床分度、原发病复发时间以及CMV/EBV感染情况,对所得数据进行回顾性分析,定量资料采用独立样本T检验、定性资料采用卡方检验、对四组不同嵌合状态类型患者的生存情况行Kaplan-Meier生存曲线分析、对完全嵌合（Full donor chimerism,FDC）及混合嵌合（Mixed chimerism,MC）组aGVHD发生、病毒感染情况行累积发生曲线分析、对影响T细胞早期嵌合率的因素行Logistic模型分析等统计学方法。结果:1.清髓性预处理（Myeloablative stem cell transplantation,MST）组 57 例,患者粒细胞植入的时间为15.41±4.38d（10-30d）,巨核系植入的时间为23.60±6.78d（8-40d）;减低强度/非清髓性预处理（Reduced intensity conditioning/Nonmyeloablative stem cell transplantation,RIC/NST）组 1 1 例,其粒细胞植入的时间为15.51±2.26（11-20d）,巨核系植入的时间为23.43±7.31（11-40d）。两组造血恢复时间差异无统计学意义（P粒细胞=0.632,P巨核系=0.823）。2.各系嵌合与移植物植入的关系:在移植后+14d,各系细胞的嵌合率分别为NK 细胞 98.79±2.71%（84.06-99.99%）、T 细胞 96.54±3.72%（78.42-99.88%）、B细胞 98.77±3.01%（79.51-100%）、全血细胞 98.45±3.33%（81.28-100%）,T 细胞嵌合率低于其它三组,差异有统计学意义（PT比比NK<0.001,PT比比B<0.001,PT比全血=0.002）。移植后+28d,各系细胞嵌合率分别为NK细胞98.97±2.11%（85.67-100%）、T 细胞 96.51±6.25%（70.51-100%）、B 细胞 98.88±3.29%（75.56-100%）、全血细胞98.98±2.74%（80.54-100%）,T细胞嵌合率仍低于其它三组,差异有统计学意义（PT比NK=0.005,PT比B=0.011,PT比全血=0.004）。移植后+60d,各系细胞的嵌合率分别为:NK 细胞 98.32±5.06%（69.88-100%）、T 细胞 97.82±4.53%（69.55-99.97%）、B 细胞 98.09±5.82%（64.33-99.98%）、全血细胞 97.94±5.02%（73.12-100%）,T细胞嵌合率仍低于NK、B细胞组,差异有统计学意义（PT比NK<0.001,PT比B=0.009）。移植后+28d,67例患者各系免疫细胞达全完供者细胞嵌合（Full donor chimerism,FDC）的比例分别为 NK 细胞 94.92%（56/59）、T 细胞 81.67%（49/60）、B细胞93.22%（55/59）、全血细胞95.52%（64/67）。T细胞系达完全嵌合比例低于其余各系细胞,差异有统计学意义（P=0.037）。3.各系嵌合与aGVHD的关系:移植后+14d,aGVHD组和无aGVHD组T细胞的嵌合率分别为 95.68±5.54%（78.42-99.80%）、97.12±1.50%（94.81-99.73%）,P=0.142;+28d,两组 T 细胞嵌合率分别为 96.49±5.25%（82.70-100%）、96.00±7.43%（70.51-99.98%）,P=0.778,差异均无统计学意义;+60d,aGVHD组T细胞嵌合率高于无aGVHD组（98.96±1.85%比95.98±7.72%）,差异有统计学意义（P=0.043）。+14d,T细胞FDC组发生轻度aGVHD的比例为22.22%（12/54）,MC组轻度aGVHD 发生率为 40%（2/5）;FDC 组重度 aGVHD 的发生率为 16.67%（9/54）,MC组重度aGVHD的发生率为20%（1/5）,差异无统计学意义（P=0.550）。同时比较+28d、+60d T细胞FDC组与MC组aGVHD的发生情况及严重程度,差异无统计学意义（P28d=0.088,P60d=0.245）。此外,+14d、+28d 及+60d T 细胞 FDC 组与MC组aGVHD累积发生率差异亦无统计学意义（P14d=0.423,P28d=0.501,P60d=0.148）。4.各系嵌合与复发的关系:稳定型供者细胞嵌合（Stable full donor chimerism,SFDC）组 55/68 例（80.88%）,复发率（Relapse rate,RR）3/55（5.45%）,1 年总体生存率（Overall survival,OS）29/42（69.05%）;增高型混合嵌合（Increased mixed chimerism,IMC）组4/68例（5.88%）,RR:2/4（50%）,1年OS:2/4（50%）;减低型混合嵌合（Decrease mixed chimerism,DMC）组 8/68 例（11.76%）,无 1例复发,1 年 OS:4/4（100%）;未形成完全供者嵌合（Non-full donor chimerism,NFDC）组1/68例（1.47%）,该患者因原发病复发死亡。IMC、NFDC组原发病复发率明显高于SFDC、DMC组,经Fisher确切概率法检验差异有统计学意义（P=0.006）。3例分子生物学或形态学复发患者,复发前及复发时各系免疫细胞嵌合状态均有不同程度下降;3例髓外复发患者在复发时各系细胞均未出现嵌合率下降。此外,比较四组不同嵌合类型患者的1年OS情况,经Fisher确切概率法检验差异无统计学意义（P=0.174）。5.各系嵌合与病毒感染的关系:移植后+28d,CMV感染组T细胞嵌合率高于CMV 未感染组,分别为 97.64±4.32%（70.51-100%）、93.00±9.58%（77.63-100%）,差异有统计学意义（P=0.012）。同理在移植后+14d、+60d,分别比较CMV感染组与CMV未感染组T细胞嵌合率,差异无统计学意义（P14d=0.362,P60d=0.118）。移植后+28d,EBV感染组T细胞嵌合率高于EBV未感染组,分别为99.24±1.03%（92.93-100%）、94.62±7.64%（70.51-99.98%）,差异有统计学意义（P=0.004）。而移植后+14d、+60d,EBV感染组与EBV未感染组T细胞嵌合率比较差异无统计学意义（P14d=0.241,P60d=0.961）。同时,移植后+28d T细胞FDC组与MC组比较,FDC组CMV及EBV的累积感染率均高于MC组,差异有统计学意义（PCMV=0.020,PEBV=0.047）。6.aGVHD与病毒感染的关系:移植后aGVHD组,CMV感染率89.66%（26/29）,无 aGVHD 组,CMV 感染率 64.10%（25/39）,aGVHD 组 CMV 感染率高于无aGVHD组,差异有统计学意义（P=0.016）;aGVHD组与无aGVHD组,EBV感染率分别为44.83%（13/29）、35.90%（14/39）,差异无统计学意义（P=0.457）;Ⅰ-Ⅱ度 aGVHD 组与Ⅲ-Ⅳ 度 aGVHD 组,CMV 感染率分别为 93.75%（15/16）、84.62%（11/13）,差异无统计学意义（P=0.573）;Ⅰ-Ⅱ度 aGVHD 组与 Ⅲ-Ⅳ度 aGVHD组,EBV感染率分别为56.25%（9/16）、30.77%（4/13）,差异无统计学意义（P=0.264）。7.预处理方案与各系嵌合的关系:移植后+28d,MST组患者各系免疫细胞的嵌合率分别为 NK 细胞:98.91±2.30%（85.67-99.99%）、T 细胞:96.48±6.46%（77.63-100%）、B 细胞:98.78±3.64%（76.56-100%）;RIC/NST 组患者各系免疫细胞嵌合率分别为 NK 细胞:97.13±6.59%（78.54-99.81%）、T 细胞:95.83±6.83%（81.68-99.88%）、B 细胞:97.41±6.29%（79.57-99.87%）。移植后+28d,MST 组与RIC/NST组各系免疫细胞嵌合率差异无统计学意义（PNK=0.137,PT=0.775,PB=0.350）。同理比较+60d,MST组与RIC/NST组各系免疫细胞嵌合率差异亦无统计学意义（PNK=0.484,PT=0.410,PB=0.502）。两组在移植后+28d各系免疫细胞达FDC率比较差异无统计学意义（PNK=0.313,PT=1.000,PB=0.433）,+60d时各系免疫细胞达FDC率比较差异亦无统计学意义（PNK=0.522,PT=1.000,PB=0.515）。8.T细胞嵌合的多因素分析:分析供者性别、供者年龄、预处理方案、HLA相合类型、移植物来源、疾病类型、移植物中CD34+细胞计数、单个核细胞计数等因素对移植后+14d、+28d和+60d T细胞达FDC的影响程度。结果显示供者性别（P14d=0.998,P28d=0.963,P60d=0.956）,供者年龄（P14d=0.672,P28d=0.543,P60d=0.216）,预处理方案（P14d=0.999,P28d=0.714,P60d=0.416）,HLA 相合类型（P14d=0.580,P28d=0.220,P60d=0.392）,移植物来源（P14d=0.280,P28d=0.719,P60d=0.401）,疾病类型（P14d=0.934,P28d=0.659,P60d=0.351）,移植物中 CD34+细胞计数（P14d=0.153,P28d=0.362,P60d=0.455）,移植物中单个核细胞计数（P14d=1.000,P28d=1.000,P60d=1.000）与移植后早期T细胞嵌合状态无明显相关。结论:1.各系嵌合与移植物植入的关系:移植后早期T细胞嵌合率低于NK、B细胞,因此T细胞达FDC对移植物的稳定植入有预示作用。同时MST和RIC/NST预处理方案均可实现稳定的移植物植入,达到较好的治疗效果。2.各系嵌合与aGVHD的关系:移植后60d T细胞的高嵌合状态与aGVHD的发生具有一定关联性。3.各系嵌合与复发的关系:供者细胞嵌合率下降与移植后原发病复发具有相关性。嵌合状态监测对预测髓内复发更具价值,而在髓外复发中敏感性不足。移植后嵌合状态的动态监测联合骨髓形态学、MRD及特征性分子生物学检测,为预测疾病复发提供了有力依据,指导临床治疗。4.各系嵌合与病毒感染的关系:移植后早期T细胞高嵌合状态与CMV、EBV感染有关。移植后CMV感染会促进T细胞FDC状态的形成,从而增加GVHD发生率。因此,CMV感染也可作为诱发aGVHD的一项危险因素。
于浩[3]（2018）在《数字PCR监测造血干细胞移植嵌合体的初步研究及HLA-DPB1与rs9277534连锁关系分析》文中进行了进一步梳理研究目的:基于中国人群的单核苷酸碱基多态性分布,结合数字PCR技术平台建立嵌合状态的检测方法—SNP-dPCR定量检测体系,并初步探讨该方法在异基因造血干细胞移植术后早期嵌合状态监测中的临床应用价值。研究方法:1.构建SNP-dPCR定量检测体系针对我国人群SNP分布特点,在dbSNP数据库中筛选合适的SNP位点,选取四川骨髓库无关健康四川籍汉族志愿者样本200（人）份,通过TaqMan探针法对其进行进一步筛选,构建适于本次研究的SNP位点复合分型体系。通过1000 Genomes Browser数据库中北京和南方汉族人群数据来分析SNP位点复合分型体系在无关个体之间的有效识别性。在四川省脐带血库收到的临床送检移植配型样本中选取100对HLA位点8/8同胞全相合的供受者样本200（人）份,检测供受者之间的差异性位点,分析SNP位点复合分型体系在同胞供受者之间的有效识别性。体外模拟嵌合体样本检测SNP-dPCR定量体系的特异性和灵敏度,评价方法的可行性。2.临床移植样本早期嵌合体检测在四川大学华西医院和成都军区总医院共收集临床样本21例。采集造血干细胞移植前的供受者样本,筛选供受者之间差异性位点;采集造血干细胞移植后患者第7、14、21、30、60、90和120天外周血抗凝样本,利用免疫磁珠法分选CD3+T细胞,通过SNP-dPCR方法定量检测全血细胞和CD3+T细胞的嵌合状态。研究结果:1.SNPS位点复合分型体系的构建在dbSNP数据库中筛选了 13个SNPs位点,建立了 TaqMan探针的分型方法,这13个SNPs位点在四川汉族无关健康个体中各等位基因频率均在0.4～0.6之间。2.SNPs位点复合分型体系的有效识别性在1000 Genomes Browser数据库中,北京汉族人群（CHB）中任意两个无关个体至少存在4个有效差异性位点,南方汉族人群（CHS）中任意两个无关个体至少存在6个有效差异性位点。在100对HLA 8/8相合的同胞供受者之中,至少存在1个差异性位点占98%,至少存在2个差异性位点占94%,至少存在3个差异性位点占90%。3.数字PCR定量检测模拟嵌合样本所有SNP-TaqMan探针均能在数字PCR上进行有效特异性的分型,模拟嵌合样本在数字PCR上的灵敏度可达到0.01%。4.临床移植样本的检测与分析收集的21例临床样本,应用该方法均能进行准确检测分析。移植后早期患者外周血供者全血细胞比供者CD3+T细胞更早达到完全嵌合（+14天VS +30天）,而且不同供体来源的CD3+T细胞嵌合率有所不同,移植后早期+21天的CD3+T细胞嵌合率,全相合无关供者组较全相合同胞供者组更高（P<0.05）,更早达到T细胞完全嵌合。本方法还可在移植后早期（+21d～+42d）检测到用于辅助治疗的脐带血微嵌合。研究结论:本研究构建了 SNP-dPCR定量检测造血干细胞移植后早期患者体内供者细胞嵌合状态的方法,该方法灵敏度高,稳定性好。该方法能够对21例造血干细胞移植的供受者进行良好的区分,为临床获得准确可靠的嵌合检测结果。本研究初步揭示移植后早期T细胞嵌合状态的动态监测具有重要意义。研究目的:调查研究四川地区汉族人群HLA-DPB1和rs9277534等位基因多态性的分布特征,并分析两者之间的连锁关系。研究方法:从四川骨髓库中随机选取200（人）份无关健康四川汉族志愿者样本,采用PCR-SBT方法对其HLA-DPB1等位基因分型,TaqMan探针法对其rs9g77534等位基因分型并通过测序验证结果。利用Arlequin 3.1软件计算HLA-DPB1与rs9277534之间的连锁不平衡参数。研究结果:本组四川骨髓库汉族人群中的DPB1等位基因:以DPB 1*05:01:01G频率为最高:0.412 5（165/400）;rs9277534等位基因:A和G的频率分别为0.4（160/400）和0.6（240/400）,AA、GG、AG基因型频率分别为0.165（33/200）、0.3^5（75/200）和0.46（92/200）。有10种HLA-DPB1等位基因型与rs9277534等位基因A、G之间存在连锁不平衡,DPB1*04:02:01G、DPB1*02:01:02G、DPB1*02:02:01G和DPB1*17:01:01G与rs9277534A完全连锁,DPB1*05:01:01G、DPB1*03:01:01G、DPB1*13:01:01G、DPB1*14:01:01G和DPB1*21:01与rs9277534G完全连锁。DPB1*04:01:01G与rs9277534A等位基因之间呈高度连锁不平衡（|D’|=0.95,P<0.01）。研究结论:四川骨髓库汉族人群的HLA-DPB1部分等位基因与rs9277534A/G等位基因连锁,对临床选择造血干细胞移植供者有参考价值。
陈舒[4]（2012）在《红细胞血型基因监测同种异基因造血干细胞移植术后嵌合状态的研究》文中提出研究背景同种异基因造血干细胞移植已经广泛应用于治疗各种恶性血液病和其他疾病患者。通过嵌合动力学的精确定量分析,可以早期识别供者细胞在受者体内植入情况,评估植入失败、植入延迟和患者的GVHD或者复发的风险,从而指导临床及时采取相应的干预。目前,STR-PCR是嵌合状态检测的金标准。然而,STR-PCR法并不是真正意义上的定量技术,其敏感性为1-10%。本研究旨在利用红细胞血型基因结合实时荧光定量PCR（RQ-PCR）技术探索一种更敏感的定量监测同种异基因造血干细胞移植术后供受者嵌合状态的方法。实验方法1、红细胞血型基因多态性位点测序分析：采集随机献血者的EDTA抗凝全血,采用血清学技术鉴定,提取基因组DNA。设计序列特异性引物分别对ABO血型基因5’侧翼转录调控区、外显子5～7和内含子5.6, Kidd血型SLC14A1基因外显子4～11序列进行PCR扩增,扩增产物鉴定纯化后进行双向测序分析。2、红细胞血型基因多态性位点筛选：多态性位点的选择标准主要有：在中国人群中的高度杂合性和高度的序列特异性。3、红细胞血型基因多态性位点实时荧光定量PCR：采集随机献血者EDTA抗凝全血,采用血清学技术鉴定,分别选取血清型为Jk（a+b+）杂合子样本、B型样本和O型样本,提取基因组DNA。ABO血型基因运用测序法进行B101和非B101等位基因以及002和非002等位基因的筛选,获得B101/非B101杂合子和001/002杂合子样本。以筛选样本的基因组DNA为模板对含有SLC14A1基因（838G>A）位点的JK基因片段,含有（796C>A+803G>C）位点和（IVS5+103insCCC）位点的ABO基因片段进行PCR扩增,扩增产物经割胶纯化后的PCR片段以TOPO TA克隆法（Invitrogen公司）连接至PCR-4-TOPO载体。克隆筛选后获取重组质粒进行PCR鉴定,测序分析。采用基因克隆后的质粒DNA制作人工嵌合的样本和作为标准品制备标准曲线。设计序列特异性引物和针对核苷酸多态性位点的TaqManMGB探针进行人工嵌合样本的实时荧光定量PCR分析。结果1、ABO血型系统：根据ABO基因外显子5-7和侧翼内含子多态性分析,中国人群中杂合度较高的ABO等位基因有4个,分别为001（33.693%）、002（22.302%）、B101（20.624%）和A102（19.784%）等位基因,其它等位基因的频率均低于2%。（796C>A+803G>C）是B101和非B101等位基因的区别,人群杂合度为0.33,为位置接近的两个核苷酸多态性；内含子5区域的（IVS5+103insCCC）为O02和非O02等位基因的区别,人群杂合度为0.35,含有连续3个核苷酸的差异。根据5’非编码区测序结果分析,共发现20个多态性位点,包括16个SNP位点和4个重复序列多态性,9个位点在国外文献中已见报道,11个为本研究新发现的变异位点,分别为：-4682A>G、-4597C>T、-4581C>T、-4238A>G、-4105A>C、-2848G>A、-2818C>T、-2247～-2232del CCCTTCCT（8bp-reps）、-2081G>A、-840G>T、-593C>T。16个SNP位点均相距较远。2、Kidd血型系统：经Kidd血型SLC14A1基因外显子4～11序列分析,共发现5个SNP位点,即-99A>G、130G>A、499A>G、588G>A和838G>A,其等位基因频率分别为0.479（-99A）,0.521（-99G）,0.583（130G）,0.417（130A）,0.788（499A）,0.212（499G）,0.925（588G）,0.075（588A）,0.479（838G）,0.521（838A）。各个多态性位点的人群杂合度分别约为：0.50（-99A>G）、0.49（130G>A）、0.33（499A>G）、0.14（588G>A）和0.50（838G>A）。3、人工嵌合样本实时荧光定量检测的实际测量值与理论值无显着差异（P>0.05）。4、利用红细胞Kidd血型SLC14A1基因（838G>A）位点、ABO血型基因（796C>A+803G>C）位点和ABO血型基因（IVS5+103insCCC）进行人工嵌合样本的实时荧光定量检测,检测范围分别约为100%～1.56%、100%～0.39%和100%～0.195%。结论1、在ABO基因的外显子7区域（796C>A+803G>C）,内含子5区域的(IVS5+103insCCC准点和红细胞Kidd血型SLC14A1基因的外显子9区域的SNP位点（838G>A）均符合嵌合状态监测的分子标志物要求,可以进行嵌合体的实时荧光定量检测。2、利用红细胞血型基因多态性位点的实时荧光定量PCR检测人工嵌合样本结果可靠。3、在利用红细胞血型基因多态性位点的实时荧光定量PCR中,增加探针设计的核苷酸多态性位点数目可以提高方法的特异性和敏感性。4、我们成功建立了利用红细胞血型基因的核苷酸多态性位点结合实时荧光定量PCR检测人工嵌合样本的方法。
李素霞,朱宏丽,郭搏,达万明[5]（2011）在《荧光标记短串联重复序列复合扩增监测嵌合体的应用研究》文中认为本研究采用荧光标记的多重PCR复合扩增短串联重复序列（STR）结合全自动毛细管电泳检测异基因造血干细胞移植后嵌合体水平,并探讨该方法动态监测对移植患者预后判断的作用。采集30例异基因造血干细胞移植患者及其供者移植前后骨髓或外周血的DNA,采用Profiler Plus试剂盒进行PCR扩增,产物经ABI310遗传分析仪进行毛细管电泳,通过供受者基因位点差异和峰面积进行嵌合体的定量检测。结果表明,29例患者在移植后28天形成完全供者嵌合体（complete chimerism,CC）,1例形成混合嵌合体（mixed chimerism,MC）。在长期随访中,22例表现为持续完全供者嵌合体,8例混合嵌合体患者中7例原病复发,从完全供者嵌合体转为混合嵌合体。完全供者嵌合体组移植物抗宿主病（GVHD）的发生率明显高于混合嵌合体组。结论 :荧光标记多重复合扩增STR检测嵌合体具有快速、自动化高、可定量及灵敏度高等优点,动态定量监测嵌合体可用于移植动力学研究,对移植物早期植入或被排斥、疾病复发以及GVHD均有预警作用,对实施临床干预治疗有指导价值。
喻凤宽[6]（2011）在《异基因外周血造血干细胞移植后供受者血细胞嵌合状态的临床研究》文中研究指明异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT）后患者供体细胞嵌合状态的动态监测,可用于判断移植成功、移植物抗宿主病（graft versus host diseases,GVHD）发生以及疾病复发、移植物被排斥,并指导临床早期实施相应干预治疗。短串联重复序列（short tandem repeats STR）是DNA中特异序列重复串联排列而成,具有高度的多态性。聚合酶链反应（polymerase chain reaction PCR）扩增后可以进行精确的个体识别,所以荧光标记的多重PCR扩增STR位点结合全自动毛细管电泳方法,是嵌合状态检测中最灵敏的方法。进行STR-PCR的定量检测,可以准确测定供受者细胞的嵌合率,评估供者细胞的植入状态,为临床allo-HSCT后续治疗提供理论依据。本研究拟建立采用免疫磁珠分选技术（magnetic cell separation technique MACS）,利用STR-PCR结合全自动毛细管电泳技术,动态检测移植后各血细胞的嵌合状态,研究其与供者细胞植入、造血恢复、移植物被排斥、疾病复发和GVHD之间的关系,从而指导合理使用免疫干预治疗,提高移植成功率。第一部分STR-PCR定量检测allo-HSCT后供者细胞植入技术的建立【目的】建立STR-PCR定量检测方法。【方法】取人类白细胞抗原（human leukocyte antigen HLA）不同2例正常人分别作为供者和受者,按不同比例将供受者抗凝血混合,制成人工模拟混合嵌合（mixed chimerism,MC）样本,分别提取基因组DNA后,进行PCR扩增荧光标记的STR,同步扩增15个STR位点和1个性别位点,行全自动毛细管电泳及片段分析,根据DNA片段长度及等位基因梯（Ladder）阅读各位点的基因型,选择嵌合率计算公式,得到供受者细胞嵌合比例。【结果】采集5对供受者外周血或骨髓,进行位点检测。5例移植后均可检出供者的特异性STR位点,最小检出的供者细胞嵌合百分比达1～2%。在+7d时,5例患者骨髓的平均嵌合率为70%,+14d时,骨髓的嵌合率均超过90%以上,仅有1例为88%。在+21d和+28d,骨髓嵌合率均达到完全嵌合状态。【结论】成功建立了STR-PCR的定量检测方法,并通过5例allo-HSCT患者动态观察验证,可以准确地分析嵌合状态的变化。第二部分Allo-HSCT后单个核细胞、T细胞、粒细胞植入动力学与aGVHD关系【目的】1.观察allo-HSCT后供者各血细胞的植入顺序;2.分析三类细胞植入顺序以及其与aGVHD的关系;【方法】我院22例确诊血液系统疾病并接受allo-HSCT患者,采集供受者移植前、受者移植后+7天、+14天、+21天、+28天外周血或骨髓。利用MACS技术分选出高纯度的单个核细胞（mononuclear cell MNC）、CD3+T细胞、CD15+粒细胞。分别进行STR-PCR定量检测供体细胞嵌合率（donor chimerism DC）,同时检测血常规、骨髓细胞分类、骨髓染色体,并观察疾病相关的临床表现、GVHD等。【结果】移植后均顺利造血恢复。在移植后+7d,T细胞的植入率（65%）,粒细胞为（40%）,MNC为70%,移植+14d、+21d以粒细胞的植入为主,T细胞植入的略晚于粒细胞。在移植后+28天内,T细胞达到高比例供体嵌合的19例患者,有8例（42.1%）发生了aGVHD,其aGVHD的发生率显着高于+28d T-MC组。【结论】1.allo-HSCT后供者血细胞植入不同步,T淋巴细胞植入最早,但达到完全供者嵌合状态（full donor chimcrism,FDC）时间最晚。粒细胞植入稍晚,但植入迅速。2.aGVHD的发生与T细胞达到高比例嵌合可能相关。第三部分嵌合体检测动态变化在疾病复发和移植物被排斥中的应用【目的】1.观察allo-HSCT后供者血细胞的嵌合体动态变化;2.分析MNC与疾病复发、移植物被排斥（graft rejection GR）之间的关系。【方法】收集了allo-HSCT术后3例复发及1例GR的恶性血液病患者标本,采用STR-PCR技术定量检测复发或GR的4例患者DC,并动态监测,研究DC与疾病复发、GR之间的关系。【结果】3例复发患者移植后造血重建顺利。早期CD3+T淋巴细胞嵌合水平的均较低,但随时间延续,其嵌合率逐渐增高。3例复发患者检测DC均下降,后骨髓形态学检查证实复发,经减量或停用抗排异药物、供体淋巴细胞输注（donor lymphocyte infusion DLI）、IL-2、化疗等处理,1例DC由MC转为FDC,1例初期有效,后期无效,1例有效,失访。1例GR患者,停用环孢菌素A（cyclosporin A CSA）后MC上升。【结论】1.早期T淋巴细胞MC状态并不预示复发及排斥;2.移植后MC呈下降趋势者,往往提示疾病复发或移植物被排斥;3.疾病复发或移植物被排斥时,减量、停用免疫抑制剂或DLI能够增强移植物抗白血病（graft versus leukemia GVL）作用,有可能逆转移植物被排斥或疾病复发的趋势,使DC由MC转变为FDC。
刘靓,丁家华[7]（2011）在《STR-PCR半定量检测嵌合体方法在异基因造血干细胞移植中的应用》文中认为目的:应用短串联重复序列-聚合酶链反应（STR-PCR）半定量方法检测异基因造血干细胞移植后供者细胞比例并探讨其临床意义。方法:给30例接受移植的患者行移植后嵌合体检测,采集外周血提取DNA,对9个STR位点行聚合酶链反应扩增,扩增完成后行聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色显影,再计算嵌合率。结果:30例患者均检测到供者细胞,24例达到完全嵌合（CC）,6例形成混合造血（MC）。在移植后14 d,稳定植入的患者多数表现为CC。CC组的aGVHD发生率高于MC组,7例患者在复发前检测到嵌合率（donor cell,DC）下降,经相应免疫治疗后有3例达到CC。结论:监测异基因造血干细胞移植后嵌合率的动态变化过程,PCR-STR是一种简单经济的方法,可根据嵌合状态指导个体化免疫治疗,对患者的长期存活有重要意义。
李幼奇,刘冠贤,石咏军[8]（2010）在《造血干细胞移植后嵌合体检测的研究进展》文中研究说明
邵宇[9]（2010）在《异基因造血干细胞移植后供体嵌合率检测方法的建立以及免疫细胞供体嵌合率的动态变化研究》文中认为目的及意义异基因造血干细胞移植（allo-SCT）是目前能够根治多种造血系统良恶性疾病及部分实体瘤的重要及有效的手段之一。然而,移植后的并发症复发排斥及移植物抗宿主病（GVHD）都极大地影响了移植的临床治疗效果。有研究发现精确动态监测移植后患者的供者细胞嵌合率（DC）可以早期预测GVHD或排斥复发,所以移植后检测DC对于判断移植物状态及决定下一步治疗方案非常重要。嵌合率的检测经典方法有：（1）血型；（2）红细胞同工酶；（3）性染色体核型分析；（4）HLA抗原；（5）限制性长度多态性；（6）可变串联重复序列VNTR；（7）微卫星重复序列STR等。大部分病例可用上述方法得到客观的植入证明,但都存在其固有缺点。本研究的第一部分通过实时定量PCR（RQ-PCR）技术对供受者差异单核苷酸多态性（SNP）位点进行检测,建立了一种目前国内未曾报道的定量检测嵌合体的方法,以达到经济、简便、精确的目的；第二部分重点分析了移植后早期（+7d、+14d）CD4+T细胞、自然杀伤（NK）细胞以及T调节细胞（Treg cell）供者嵌合率与临床结局关系,尤其是+7d嵌合率,希望在患者达到完全嵌合（CC）或在出现临床早期事件之前找到一些预测指标,来指导预后、提前干预。第一部分SNP-PCR定量检测异基因移植后嵌合率方法的建立方法1.收集2007年4月至2009年12月长海医院65例行异基因移植的移植前供受者及移植后患者+7d、+14d、+21d、+30d、+60d、+90d、+6m、+1年、+2年等的EDTA抗凝外周血或骨髓标本共650份；2.按试剂盒盐析法或采用DNAzol或Chelex-100试剂提取基因组DNA,分光光度计测取DNA纯度,-20℃冻存备用；3.选取了9条不同染色体上共18个SNP位点作为备选差异SNP位点,通过定量PCR筛选出供受差异SNP位点；4.RQ-PCR扩增筛选出的供受差异SNP位点,基因GAPDH校正误差,5个浓度梯度GAPDH质粒建立标准曲线,最后通过公式计算出供者嵌合率（DC）；5.通过对已知嵌合比例的模拟嵌合标本进行嵌合率检测,以及同时进行XY-FISH、STR-PCR及特殊融合基因检测来验证方法的准确性及敏感度；6.统计学处理：利用SPSS11.0软件进行统计学分析,数据以均数±标准差表示,相关性检验用直线回归分析,批间差及批内差采用单样本t检验,检验水准α=0.05。结果1.标准品扩增的17次标准曲线,平均斜率为-3.39（-3.22～3.65）,平均截距为39.97（37.33～43.19）,相关系数均大于0.995, RQ-PCR反应体系的扩增效率接近理想水平,实验结果可信；批间差为1.1%,批内差为0.50%,均在可控范围；2.内参GAPDH及各SNP位点所构建的质粒扩增效率基本一致,所以最后仅利用内参一条标准曲线来计算两者的拷贝数；3.95.4%移植前供受者经定量PCR反应后均能找到相互差异的位点。其中阳性率较高的位点有S2、S7b、S10b、Sgst等；4.与模拟混合嵌合相关系数在0.99以上,可重复敏感度可达0.01%,与FISH、STR-PCR结果相比,差异均没有统计学意义,并且与特定白血病融合基因结果比较,供者型100%CC标本,融合基因结果均为0%,相反MC标本,融合基因均为阳性,且同一患者供者细胞的比例越少,融合基因的表达率越高。第二部分异基因移植后早期（+7d、+14d）免疫细胞供者嵌合率的预后意义方法1.收集的标本同前,收集此65名移植患者的一般信息,包括性别、年龄、疾病种类、疾病状态、移植前化疗次数、移植物来源、HLA配型、预处理强度、血型、外周血植入速度、移植后并发症、结局、存活时间；提取基因组DNA（方法同第一部分）,-20℃冻存备用；2.采用SNP-PCR方法（同第一部分）对650份标本进行嵌合率检测,分析+7d、+14d嵌合率与移植并发症及结局的关系；3.收集2008年7月至2009年9月长海医院32例异基因移植后+14d、+30d、+60d、+90d、+6m、+1年等的EDTA抗凝骨髓标本共150份,收集患者的一般信息（具体内容同上）；4.免疫磁珠法分选CD3+、CD56+、CD4+CD25+细胞亚群,提取基因组DNA,-20℃冻存备用；3. SNP-PCR对标本行嵌合率检测（方法同第一部分）,分析+14d各细胞亚群的嵌合率与移植并发症及结局的关系；5.采用SPSS11.0统计分析软件包进行数据的统计分析,数据以均数±标准差表示,两组计数资料用Fish精确概率法分析,计量资料采取t检验,生存分析采用Kaplan-Meier方法,检验水准α=0.05。结果1.无论清髓性还是减低剂量移植,患者均能很好耐受,在65例患者中,2例未植入,2例移植物被排斥,余均顺利植入；2.中性粒细胞平均恢复时间（NRT）以及血小板平均恢复时间（PRT）分别为14天及16天；NRT（PRT）>14天患者的+7d平均嵌合率要低于NRT（PRT）<14d患者,分别是69.6%vs 77.3%以及69.5%vs 78.4%,但差异没有统计学意义（P>0.05）；+7天嵌合率<65%组与>65%组的平均白细胞、血红蛋白以及血小板计数均没有显着差别,分别是0.38±0.75 vs 0.33±0.65×109/L（P=0.819）,83.6±11.8 vs 77.4±17.8g/l（P=0.207）以及22.9±26.9 vs 25.5±37.6x 109/L（]P=0.801）,+7d嵌合率水平与外周血象的高低无直接联系；3.在65例患者中,13例复发,复发患者的+7d及+14d平均嵌合率均明显低于非复发患者,分别为51.86%vs 83.02%及82.89%vs 95.37%（P<0.01）；共24例患者发生GVHD,包括14例aGVHD及13例cGVHD（10例局限型和3例广泛型）,ⅡtoⅣ级aGVHD共有8例；4.随着+7d嵌合率逐渐增加,复发率逐渐降低（P=0.0001）、GVHD发生率逐渐升高（P=0.001）,髓外复发差异不明显；+7d嵌合率<65%组的复发或排斥率显着高于>65%组,为68.8%vs 8.7%（P=0.0001）；+7d嵌合率>85%组GVHD（包括总GVHD及cGVHD）的发生率明显高于<85%组,为46.43% vs 9.52%（P<0.01）, aGVHD在两组之间的差异无统计学意义（P=0.091）；5.随着+14d嵌合率水平的逐渐增加,复发率亦逐渐降低（P=0.002）,而GVHD发生率上升趋势不明显（P>0.05）；但进一步将嵌合率按85%及95%分组后,>85%组复发率显着降低（P<0.01）,>95%组总GVHD及cGVHD的发生率明显升高（P<0.01）；6.共有21名患者在随访的两年半中死亡,24个月总体生存率（OS）为56%,+7d嵌合率在65-85%的这组患者OS明显高于<65%及>85%组,分别是82.6%vs.47.0%（P=0.04）,我们将其定义为+7d的“最佳生存区间”。+14d嵌合率85-95%的区间并没有得到同样的结论（P>0.05）。7.+7d嵌合率在65-85%之间与区间之外的患者相比,疾病类型、移植前化疗次数、疾病状态、移植物类型、年龄、HLA配型、血型、干细胞来源均没有显着差别（P>0.05）。8.32例患者T、NK细胞亚群均分选成功,纯度在75-95%之间；在32例拟分选CD4+CD25+细胞亚群的患者中,2例无差异位点,2例未采集标本,3例分选失败,最后成功的有25例,成功率89.3%,纯度在70-80%之间；9.+14d T细胞嵌合率<80%易于复发,40%vs 4.5%（P=0.024）,但其比例与GVHD的发生尚无统计学联系；+14d NK细胞的嵌合率与复发及GVHD的发生关系并不密切（P>0.05）；10.+14dCD4+CD25+嵌合率的比例与排斥复发及GVHD的关系无统计学意义（P>0.05）,但其与+14d CD4+T细胞嵌合率的差值是否大于零与GVHD的发生有密切联系,如果+14dCD4+CD25+嵌合率高于CD4+T细胞,则不易发生GVHD,反之则GVHD发生明显升高GVHD发生率分别是6.7%vs 50%（P=0.014）。结论1.SNP-PCR方法检测嵌合率方便、准确、可靠,95.4%移植前供受者经定量PCR反应后均能找到相互差异的位点,适宜在中国人群推广应用；与模拟混合嵌合相关系数在0.99以上,可重复敏感度可达0.01%,与FISH、STR-PCR结果相比,差异均没有统计学意义,与特殊融合基因结果相符；2.NRT>14天患者的+7d平均嵌合率要低于NRT<14d患者,但差异没有统计学意义,PRT同样如此；+7天嵌合率<65%组与>65%组的平均白细胞、血红蛋白以及血小板计数均没有显着差别；+7d供体嵌合率水平与外周血象的高低无直接联系；3.在较强预处理作用下,移植后+7d平均嵌合率即达到76.36%,+14d达到CC的患者>50%,植入速度明显快于报道的非清髓移植（NST）；供体T细胞植入相对缓慢,明显慢于NK细胞；4.随着+7d及+14d嵌合率增加,复发率逐渐降低、GVHD发生率逐渐升高；+7d嵌合率<65%组复发或排斥率显着高于>65%组；>85%组GVHD发生率明显高于<85%组；将+14d嵌合率按85%及95%分组后,>85%组复发率显着降低,>95%组总GVHD及cGVHD的发生率明显升高；+7d嵌合率<65%及+14d<85%可以作为排斥或复发的预警标志,+7d嵌合率>85%及+14d>95%可以作为GVHD发生的预警标志；5.+14d T细胞嵌合率<80%易于复发（P=0.024）,但其比例与GVHD的发生尚无统计学联系；+14d NK细胞的嵌合率与复发及GVHD的发生关系并不密切；6.可以采用磁珠分选的方法分选CD4+CD25+细胞亚群,分选成功率在90%左右,+14d CD4+CD25+嵌合率高于CD4+T细胞,则不易发生GVHD,反之则GVHD发生明显升高,可以作为+14d达到高比例嵌合患者的补充预警标志；7.本组移植患者24个月OS为56%,+7d嵌合率在65-85%的这组患者OS明显高于<65%及>85%组,定义为+7d的“最佳生存区间”,我们认为+7d嵌合率在65-85%之间是指导长期生存的又一重要指标。
胡彬,阎慧芝,刘晓华,李长缨,冯智慧,温振科,焦淑贤[10]（2009）在《STR-PCR定量检测嵌合体供者嵌合率准确性探讨》文中提出目的探讨用荧光标记复合扩增短串联重复序列（STR-PCR）结合序列分析仪毛细管电泳法检测嵌合体供者细胞嵌合率的准确性。方法采集健康献血者外周血按白细胞比例两两混合制备不同供受者比例的体外嵌合体模型,对15个STR位点进行荧光标记复合扩增,扩增产物进行序列分析仪毛细管电泳,计算嵌合率。结果实验测得嵌合率与扩增前样本嵌合率呈显着直线相关,r=0.999 7,最小检出供者细胞嵌合率<1%。供者嵌合率≥5%的嵌合体模型嵌合率的检测值与理论值差别无统计学意义（P>0.05）,<5%的模型嵌合率检测值与理论值差别有统计学意义（P<0.05）。结论荧光标记复合扩增STR基因结合序列分析仪毛细管电泳检测嵌合率方法个体识别力高、特异、敏感,当供者嵌合率≥5%时能准确反映异基因造血干细胞移植后患者的嵌合状态。
二、STR-PCR定量检测供受者嵌合体方法的建立及临床应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、STR-PCR定量检测供受者嵌合体方法的建立及临床应用（论文提纲范文）
（1）定量检测微嵌合体对造血干细胞移植的意义分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 主要英文缩略词表 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一章 文献综述 |
| 参考文献 |
| 第二章 定量检测微嵌合体对造血干细胞移植的意义分析 |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）各系免疫细胞嵌合状态监测在异基因造血干细胞移植后的意义（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 一.病例和方法 |
| 1. 研究对象 |
| 2. 研究方法 |
| 二. 结果 |
| 1. 供受者嵌合状态与造血干细胞植入 |
| 2. 供受者嵌合状态与急性移植物抗宿主病 |
| 3. 供受者嵌合状态与原发病复发 |
| 4. 供受者嵌合状态与移植后CMV、EBV感染 |
| 5. 移植后CMV、EBV感染与aGVHD |
| 6. 预处理方案与供受者嵌合状态 |
| 7. 移植后早期T细胞嵌合状态的多因素分析 |
| 三. 讨论 |
| 四. 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 免疫细胞分选嵌合监测在异基因造血干细胞移植后的意义 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间所取得的科研成果 |
（3）数字PCR监测造血干细胞移植嵌合体的初步研究及HLA-DPB1与rs9277534连锁关系分析（论文提纲范文）
| 第一部分 数字PCR监测造血干细胞移植嵌合体的初步研究 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料及方法 |
| 1 研究对象 |
| 1.1 四川骨髓库汉族志愿者 |
| 1.2 四川省脐带血库同胞供受者 |
| 1.3 临床样本 |
| 2 实验试剂 |
| 3 实验仪器设备 |
| 4 实验耗材 |
| 5 生物学软件及数据库 |
| 6 实验方法 |
| 6.1 临床样本采集 |
| 6.2 全血基因组DNA提取 |
| 6.3 DNA微量提取: |
| 6.4 DNA纯度及浓度的测定: |
| 6.5 SNP位点的筛选 |
| 6.6 SNP分型 |
| 6.7 测序验证Taqman探针 |
| 6.8 SNPs复合分型体系个人识别率的计算 |
| 6.9 CD3~+T细胞分选 |
| 6.10 数字PCR定量 |
| 6.11 模拟供受者嵌合样本 |
| 6.12 未知样本嵌合率的计算 |
| 6.13 嵌合状态的判定 |
| 6.14 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 样本特征 |
| 2 SNPs位点复合分型体系 |
| 2.1 SNPs位点复合分型体系的构成 |
| 2.2 SNPs位点的基因分型情况 |
| 2.3 测序验证 |
| 2.4 四川骨髓库汉族人群中SNPs位点等位基因频率的分布情况 |
| 2.5 四川骨髓库汉族人群与千人基因组计划数据库中人群数据之间SNPs位点等位基因频率的比较 |
| 2.6 无关个体之间SNP的有效识别性 |
| 2.7 同胞供受者之间差异性SNP位点的分析 |
| 3 数字PCR定量检测模拟嵌合样本 |
| 3.1 按细胞比例混合制备样本 |
| 3.2 按DNA比例混合制备样本 |
| 4 临床样本分析 |
| 4.1 临床样本分类 |
| 4.2 临床样本中差异性SNP位点情况 |
| 5 外周血中CD3~+T细胞分选 |
| 6 临床样本定量检测 |
| 7 嵌合动态变化的监测 |
| 8 疾病的转归 |
| 讨论 |
| 1 SNPs复合分型体系的构建 |
| 2 SNPs复合分型体系的有效识别性 |
| 3 SNP-dPCR定量检测方法 |
| 4 微嵌合 |
| 5 临床移植后患者早期CD3~+T细胞嵌合率的检测 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 四川骨髓库汉族人群HLA-DPB1与rs9277534等位基因频率的分布及连锁关系的研究 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料及方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 实验试剂 |
| 3 实验仪器 |
| 4 实验耗材 |
| 5 生物学软件及数据库 |
| 6 实验方法 |
| 6.1 全血基因组DNA提取 |
| 6.2 DNA纯度及浓度的测定 |
| 6.3 HLA-DPB1基因分型 |
| 6.4 rs9277534基因分型 |
| 6.5 rs9277534位点测序验证 |
| 6.6 连锁关系分析 |
| 6.7 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 HLA-DPB1等位基因频率分布 |
| 2 SNP基因分型 |
| 3 rs9277534测序结果 |
| 4 四川汉族人群rs9277534基因频率分布 |
| 5 四川汉族人群中HLA-DPB1与rs9277534等位基因之间的连锁关系与欧裔美国人和非裔美国人之间的比较 |
| 讨论 |
| 1 等位基因分型 |
| 2 HLA-DPB1与rs9277534的分布与连锁关系分析 |
| 3 rs9277534与移植预后的关系 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 硕士期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（4）红细胞血型基因监测同种异基因造血干细胞移植术后嵌合状态的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 目次 |
| 前言 |
| 第一部分 红细胞血型基因高杂合度多态性位点筛选 |
| 一、ABO血型基因5’侧翼转录调控区、外显子5~7和内含子5、6的序列多态性#选 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 二、Kidd血型SLC14A1基因外显子4 ~ 11序列多态性位点傩选 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 红细胞血型基因多态性位点实时定量PCR |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 在读期间发表的论文、课题资助 |
（5）荧光标记短串联重复序列复合扩增监测嵌合体的应用研究（论文提纲范文）
| 材料和方法 |
| 一般资料 |
| 样本采集及外周血单个核细胞的制备 |
| 试剂和仪器 |
| DNA提取 |
| PCR扩增 |
| 毛细管电泳 |
| 信息分析 |
| 嵌合率的计算 |
| 统计学处理 |
| 结 果 |
| STR信息位点的选择 |
| 移植后嵌合体检测 |
| MC患者的嵌合体动态监测 |
| 移植物抗宿主病 (GVHD) 的发生 |
| 讨 论 |
（6）异基因外周血造血干细胞移植后供受者血细胞嵌合状态的临床研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 STR-PCR 定量检测异基因造血干细胞移植后供者细胞植入技术的建立 |
| 材料与方法 |
| 1. 主要试剂 |
| 2. 主要仪器设备 |
| 3. 实验流程 |
| 4. 人工模拟混合嵌合样本 |
| 5. 标本采集 |
| 6. 分离单个核细胞 |
| 7. 基因组DNA 抽提 |
| 8. STR-PCR 扩增 |
| 9. 全自动毛细管电泳 |
| 10. 信息分析 |
| 11. 计算嵌合率 |
| 结果 |
| 1. 人工模拟混合嵌合样本的峰面积比例 |
| 2. 有效STR 信息位点 |
| 3. 方法的敏感性 |
| 4. 异基因造血干细胞移植后造血恢复情况 |
| 5. 动态监测移植后早期嵌合体 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Allo-HSCT 后不同细胞植入动力学以及与aGVHD 关系 |
| 材料与方法 |
| 1. 临床资料 |
| 2. 主要试剂 |
| 3. 主要仪器设备 |
| 4. 标本采集 |
| 5.分离 MNC、分选 T 细胞和 粒细胞 |
| 6. 嵌合率检测 |
| 7. 统计学处理 |
| 结果 |
| 1. 有效STR 信息位点 |
| 2. 移植后造血恢复情况 |
| 3. 移植后早期嵌合体的检测及其植入顺序 |
| 4. 嵌合率与aGVHD 的关系 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 嵌合体检测动态变化在疾病复发和移植物被排斥中的应用 |
| 材料与方法 |
| 1. 病例资料 |
| 2. 标本采集 |
| 3. 单个核细胞提取 |
| 4. 基因组DNA 抽提 |
| 5. 供体嵌合率检测 |
| 结果 |
| 1. 疾病转归 |
| 2. 移植后供者细胞嵌合率动态变化 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录A：综述 |
| 参考文献 |
| 附录B：中英文缩略词 |
| 附录C：攻读学位期间发表的学术论文目录及获得奖励 |
| 致谢 |
（8）造血干细胞移植后嵌合体检测的研究进展（论文提纲范文）
| 1 嵌合体的概念及发展 |
| 1.1 嵌合体概念的提出及分类 |
| 1.2 建立嵌合体的方法 |
| 1.2.1 清髓性造血干细胞移植 (Myeloablative stem cell transplantation, MST) |
| 1.2.2 非清髓性造血干细胞移植 (Nonmyeloablative stem cell transplantation, NST) |
| 2 造血干细胞移植后监测嵌合体的意义 |
| 3 嵌合体的检测方法 |
| 4 总结 |
（9）异基因造血干细胞移植后供体嵌合率检测方法的建立以及免疫细胞供体嵌合率的动态变化研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 异基因造血干细胞移植术后供体嵌合率SNP-PCR检测方法的建立 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 异基因造血干细胞移植后+7d、+14d免疫细胞亚群供体嵌合率与预后的关系 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 博士期间发表文章及承担课题 |
| 致谢 |
（10）STR-PCR定量检测嵌合体供者嵌合率准确性探讨（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 标本 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.4 数据分析、计算嵌合率 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 混合样本供者嵌合率 |
| 2.2 方法的敏感性 |
| 2.3 实验测得嵌合率与实验前嵌合率的相关性分析 |
| 3 讨论 |
四、STR-PCR定量检测供受者嵌合体方法的建立及临床应用（论文参考文献）
- [1]定量检测微嵌合体对造血干细胞移植的意义分析[D]. 杜胜男. 东南大学, 2019(05)
- [2]各系免疫细胞嵌合状态监测在异基因造血干细胞移植后的意义[D]. 洪睿敏. 浙江大学, 2019(04)
- [3]数字PCR监测造血干细胞移植嵌合体的初步研究及HLA-DPB1与rs9277534连锁关系分析[D]. 于浩. 北京协和医学院, 2018(02)
- [4]红细胞血型基因监测同种异基因造血干细胞移植术后嵌合状态的研究[D]. 陈舒. 浙江大学, 2012(04)
- [5]荧光标记短串联重复序列复合扩增监测嵌合体的应用研究[J]. 李素霞,朱宏丽,郭搏,达万明. 中国实验血液学杂志, 2011(03)
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- [7]STR-PCR半定量检测嵌合体方法在异基因造血干细胞移植中的应用[J]. 刘靓,丁家华. 现代医学, 2011(02)
- [8]造血干细胞移植后嵌合体检测的研究进展[J]. 李幼奇,刘冠贤,石咏军. 中国免疫学杂志, 2010(10)
- [9]异基因造血干细胞移植后供体嵌合率检测方法的建立以及免疫细胞供体嵌合率的动态变化研究[D]. 邵宇. 第二军医大学, 2010(10)
- [10]STR-PCR定量检测嵌合体供者嵌合率准确性探讨[J]. 胡彬,阎慧芝,刘晓华,李长缨,冯智慧,温振科,焦淑贤. 中国输血杂志, 2009(08)