一、高滴度逆转录病毒载体4种转染方法对小鼠脾脏T细胞转染率的比较（论文文献综述）
李守湖[1]（2020）在《虹鳟传染性造血器官坏死病-传染性胰腺坏死病二联活载体疫苗的研制》文中指出传染性造血器官坏死病病毒（IHNV）主要引起以鲑鳟鱼类感染为主的传染性造血器官坏死病（IHN）,该病能对自然条件下及人工养殖的鲑鳟鱼类造成主要以肾脏和脾脏等造血器官出血、坏死为主要特征的高度接触性传染病。该病的病原IHNV是一种负向单链RNA病毒,隶属于弹状病毒科的诺拉弹状病毒属。传染性胰腺坏死病（IPN）是由传染性胰腺坏死病病毒（IPNV）引起的一种以鲑鳟鱼类感染为主的传染病,该病给鲑鳟鱼类的养殖业造成了严重的经济损失。该病的病原IPNV是一种双RNA病毒,隶属于双RNA病毒科的水生双链RNA病毒属,是目前已知鱼类病毒病中最小的RNA病毒。该两种疫病主要危害鲑鳟鱼类的幼鱼和鱼苗,在鱼苗和幼鱼中致死率均在90%以上,IHN被我国水生动物口岸确定为一类检疫对象,也是我国农业农村部列为的二类动物疫病。IHN与IPN分别于1990年和1986年在我国东北地区首次被发现,该两种疫病均给世界各国的鲑鳟鱼类的养殖带来了沉重的打击,严重的影响了多个国家的水产养殖业。1.通过鲤鱼上皮瘤细胞（EPC）分别对IHNV和IPNV进行盲传培养,先在14℃时对病毒进行盲传,待到细胞接种病毒出现稳定的病变时开始升温,直至温度升高到18℃为止,将收集的病毒液进行正常EPC细胞的传代。本试验中成功的驯化出一株IHNV,16-18℃条件下48h可出现稳定的病变,命名为IHNV GS株。同时驯化出一株IPNV,18-20℃条件下48-60h可出现稳定的病变。利用PCR方法对分离出的IHNV GS株和IPNV GS株分别进行保守基因的扩增,从分子水平方面对两种病毒建立了诊断方法,对甘肃省永登县疑似暴发的IHN疫情和甘肃省永靖县疑似暴发的IPN分别进行了确诊,并对IHNV G基因和IPNV VP2基因分别进行了系统进化树的分析,结果显示,IHNV G基因与国外IHNV的代表性毒株IHNV Ch YU78、IHNV Auke77、IHNV Ch Ab76和IHNV HV7601有相对较近的遗传关系,IPNV VP2基因与与国外IPNV代表性毒株IPNV SP、IPNV Denizli05、IPNV HAH-3和IPNV Ka 470/07的遗传关系较近。对IHNV和IPNV分别建立的分子诊断方法,结合本试验中建立的通过细胞系对鲑鳟鱼类病毒进行分离、培养的方法,为临床上更好的对IHNV和IPNV的诊断提供了理论依据。2.为分别克隆传染性造血器官坏死病（IHNV）G基因、连接肽F2A基因和传染性胰腺坏死病VP2基因,构建IHNV G基因、F2A基因和IPNV VP2基因的重组腺病毒载体。利用PCR技术扩增出IHNV G基因、F2A基因和IPNV VP2基因,利用多片段快速融合技术将IHNV G基因、F2A基因和IPNV VP2基因插入到腺病毒穿梭载体中,经过线性化的腺病毒穿梭载体与腺病毒骨架载体在大肠杆菌内发生重组,构建成带有靶基因的重组质粒,利用PCR对靶基因的扩增及NotⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后,经PacⅠ酶切后,回收的目的片段用于转染293细胞而进行病毒的包装,获得带有靶基因的重组腺病毒,通过观察重组腺病毒的绿色荧光来监控病毒,用Western-blot法分别检测G蛋白和VP2蛋白的表达,并利用TCID50方法测定重组病毒的滴度。结果显示,本试验成功克隆出IHNV G基因、F2A基因和IPNV VP2基因,基因总长度为3036bp,。成功构建了IHNV G、F2A基因和IPNV VP2基因的重组腺病毒。绿色荧光蛋白（GFP）监测显示,带有靶基因的重组腺病毒被转染成功。重组腺病毒能在293细胞中分别表达出约58 k D产物（G蛋白）和54 k D（VP2蛋白）的产物,表达的分子质量与预期相符,重组病毒的TCID50能达到1.0×1010.0m L-1。结果表明,成功构建带有IHNV G基因和IPNV VP2基因的重组腺病毒载体,重组腺病毒的滴度稳定且较高。3.为评测IHN-IPN二联活载体疫苗对免疫后虹鳟在IHNV和IPNV感染时的保护效果。通过浸泡途径免疫虹鳟,含有IHNV G基因和IPNV VP2基因的活载体疫苗在虹鳟鱼中诱导了保护性免疫应答。q RT-PCR显示,在接种的虹鳟鱼脾脏中IHNV G基因和IPNV VP2基因的表达在3dpv（days post-vaccination,dpv）达到最高水平,在3dpv到15dpv之间逐渐降低。在3dpv到15dpv之间TLR-3、TLR-7和TLR-8的表达呈上调,IFN-1、Mx-1、Mx-3、Vig-1和Vig-2的表达水平在3 dpv时检测到最高表达。与对照组相比,3dpv和15 dpv之间,接种虹鳟的脾脏中适应性免疫应答的四个标记物（CD4、CD8、Ig M和Ig T）的表达持续增加。为获得最佳的保护效果,先将活载体疫苗以1:100的稀释度稀释,然后把幼体虹鳟在疫苗稀释液中浸泡10 min。疫苗接种的虹鳟和对照组（空载体对照病毒接种组）之间的累积死亡率百分比差异显着。抗体中和试验结果表明,接种的虹鳟显示出高水平的抗IHNV和抗IPNV感染的血清抗体,并且在IPNV攻击后相对存活率百分比（RPS）达到87.5%,在IPNV攻击后相对存活率百分比（RPS）达到86.84%。试验结果表明,我们构建的活载体疫苗,可用于保护虹鳟免受IHNV和IPNV感染。综上所述,本试验分别建立了IHNV和IPNV的细胞和分子诊断的方法,构建出带有IHNV G基因和IPNV VP2基因的重组腺病毒,评测了活载体疫苗免疫虹鳟后对于IHNV和IPNV感染时的保护效果,为下一步对传染性造血器官坏死病和传染性胰腺坏死病临床上更好的防控提供了参考。
王猛[2]（2020）在《shRNA沉默AFAP1L1基因对肺腺癌细胞增殖影响的体内外研究》文中指出目的:1、研究肌动蛋白丝相关蛋白1相似蛋白1（AFAP1L1）在非小细胞肺癌（NSCLC）表达的临床意义。2、探讨shRNA沉默AFAP1L1对肺腺癌A549细胞增殖、细胞周期、凋亡和侵袭的影响,并初步探讨AFAP1L1参与调控肺癌发生进展的分子机制。3、通过构建慢病毒表达载体介导shRNA沉默AFAP1L1基因,观察其对肺癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用,为肺癌的基因治疗提供实验依据。方法:1、应用Max Vision免疫组化技术分别检测84例癌组织和69例正常组织中AFAP1L1蛋白的表达水平,分析AFAP1L1蛋白在癌组织和正常组织的表达差异及其与患者临床病理特征、病理分期的关系。2、利用shRNA干扰技术敲减肺腺癌细胞株A549中的AFAP1L1基因,抑制其在细胞内的转录翻译水平。随后使用Celigo图像细胞仪检测细胞增殖,应用流式细胞术评估细胞周期,以Annexin V（锚定蛋白）作为标记,测定细胞凋亡水平。通过Transwell实验研究AFAP1L1敲减肺腺癌细胞侵袭能力。进一步通过Path Scan细胞内信号转导阵列分析AFAP1L1敲减A549细胞的下游癌症信号蛋白。3、构建重组AFAP1L1基因的shRNA慢病毒表达载体。通过裸鼠成瘤实验体内验证AFAP1L1敲减对肺腺癌细胞增殖侵袭能力的影响。结果:1、通过Max Vision免疫组化法我们在84例NSCLC癌组织中检测62例AFAP1L1的不同程度表达（73.8%）,而在69例正常组织中仅检测到16例（23.2%）。AFAP1L1在NSCLC癌组织中高表达,在正常组织中低或无表达（χ2=38.84且P<0.005）,具有显着统计学差异。2、进一步分析发现,AFAP1L1的表达与肺癌病理分期相关。在I期、II期NSCLC患者组织标本中分别检测到53.8%和65.6%存在AFAP1L1的表达,而在III期+IV期NSCLC病人中AFAP1L1的表达率为88.5%。具有明显统计学差异（χ2=5.596且P<0.05）。3、AFAP1L1的表达水平与肺癌淋巴结转移、胸膜侵犯和脉管浸润相关。存在淋巴结转移的患者标本的AFAP1L1表达阳性率为85.1%,而不存在淋巴结转移的患者标本的AFAP1L1表达阳性率为62.2%。组间对比结果为χ2=4.653且P<0.05,存在统计学差异。有胸膜侵犯组和无胸膜侵犯组的阳性率分别为82.5%和61.4%,差异有统计学意义（χ2=4.416,P<0.05）。有脉管浸润组和无脉管浸润组的阳性率分别为82.1%和57.1%,有统计学差异（χ2=4.811,P<0.05）。此外,AFAP1L1蛋白的表达水平与患者的病理类型、性别、年龄无统计学差异（P>0.05）。4、成功构建AFAP1L1-shRNA慢病毒表达载体。研究发现敲低肺腺癌A549细胞AFAP1L1基因后明显抑制其增殖和侵袭能力;在细胞周期方面研究发现敲低AFAP1L1基因促进细胞周期向G1和G2/M期转变,G1和G2/M期细胞比例增加;与阴性对照的shRNA转染细胞相比,细胞凋亡在AFAP1L1-shRNA转染的细胞中的增加。Transwell测定结果显示,与空白对照组和质粒对照组相比,干扰实验组穿膜的细胞数明显减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。使用Path Scan细胞内信号转导阵列分析,我们发现AFAP1L1的下调显着激活了P38和caspase3,并抑制PRAS40活化。5、利用活体成像技术通过裸鼠成瘤实验对移植瘤的生长情况分析显示,空白对照组、实验组肿瘤体积分别为:619.80±278.97mm3、289.50±47.07mm3,差异有显着性差异。空白对照组、实验组肿瘤重量分别为:0.966±0.185g、0.583±0.057g,实验组肿瘤重量明显低于空白对照组。此外,通过对实验组和空白对照组进行活体成像,结果显示相比空白对照组,实验组荧光表达量降低（P<0.05）。结论:1、AFAP1L1蛋白表达水平在NSCLC癌组织中显着高于正常组织,并且与NSCLC的病理分期、胸膜侵犯、淋巴结转移、脉管浸润密切相关,与性别、年龄、肿瘤类型无统计学意义。2、AFAP1L1加速肺腺癌细胞周期进程,抑制肺癌细胞凋亡,促进肺癌细胞的侵袭。3、RNA干扰作为一种高效基因编辑技术,可以沉默肺癌细胞目的基因的表达。构建稳定表达靶基因RNA干扰的慢病毒载体（shRNA-AFAP1L1-LVs）进行后续实验发现,于在体内外特异地抑制人肺癌细胞系中AFAP1L1基因的表达,可以抑制人肺腺癌细胞A549细胞株的生长增殖侵袭能力。利用活体成像技术,验证了沉默AFAP1L1基因对肺腺癌细胞生物学行为的影响。为进一步研究肺癌细胞的恶性行为奠定基础,为揭示肺癌发生发展的分子机制提供更多证据,AFAP1L1有成为肺癌基因疗法中作用靶点的潜力。
李菲[3]（2019）在《结核分枝杆菌抗原致骨髓造血细胞增殖分化异常实验研究暨烯醇化酶-1单克隆抗体制备与作用初步研究》文中研究指明结核分枝杆菌感染机体后主要激活CD4+T细胞和CD8+T细胞,CD4+T细胞分化为Th1型细胞,分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2等细胞因子,激活巨噬细胞等细胞免疫应答,CD8+T细胞分化为CTL细胞直接杀伤靶细胞,发挥清除结核分枝杆菌的作用。然而耐药结核、痰菌阳性的纤维空洞型肺结核等重症结核病患者体内结核分枝杆菌长期慢性感染会导致机体免疫功能低下。我们实验室前期应用结核分枝杆菌抗原持续刺激模拟临床结核分枝杆菌持续感染的状态,发现结核分枝杆菌抗原持续刺激会导致T细胞耗竭,表现为T细胞受特异性抗原刺激后增殖能力下降、产生细胞因子IFN-γ和IL-2减少。在该结核分枝杆菌抗原持续刺激致T细胞耗竭的动物模型上,进一步对T细胞耗竭进行治疗研究,发现给予IL-2干预可逆转其耗竭状态。在上述研究基础上,我们进而拟研究抗原持续刺激导致T细胞耗竭过程中骨髓造血功能的变化。维持骨髓造血干细胞（HSC）及前体细胞稳态是机体维持正常造血功能及建立有效抗结核免疫应答的基础。骨髓HSC的分化增殖受GM-CSF、IL-2、IFN-γ等细胞因子的调节。研究发现淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）等病毒及细菌感染过程中,细胞因子IFN-γ持续分泌,可引起造血功能障碍。重症结核病出现免疫耗竭及骨髓造血功能障碍的研究较少,相关机制尚不清楚。目的:我们推测结核分枝杆菌抗原持续刺激情况下,刺激产生的细胞因子持续作用于骨髓,造成骨髓HSC及造血前体细胞功能异常。本实验继续应用前期我们实验室建立的结核分枝杆菌抗原持续刺激引起T细胞耗竭的动物模型,研究结核分枝杆菌抗原持续刺激对骨髓造血功能的影响。方法:为了研究结核分枝杆菌抗原持续刺激对骨髓造血及T细胞免疫功能的影响,本课题应用结核分枝杆菌抗原持续刺激小鼠,观察结核分枝杆菌抗原持续刺激过程中骨髓造血细胞增殖能力的变化,并分析与造血细胞分化相关转录因子表达水平的改变,评价结核抗原刺激诱导的免疫应答对骨髓造血功能的影响。在此基础上进一步研究IL-2治疗对骨髓造血功能的影响。（1）抗原刺激及IL-2治疗程序。考虑到生物安全等因素,本课题应用结核分枝杆菌抗原持续刺激模拟临床结核分枝杆菌持续感染对免疫系统和骨髓造血功能的影响。本研究首先用卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin,BCG）免疫C57BL/6小鼠,然后用结核分枝杆菌抗原ESAT-6、CFP-10联合融合蛋白Mtb10.4-HspX（MH）与佐剂DDA和Poly（I:C）持续刺激,每周一次,反复皮下注射。抗原反复刺激12周后检测到骨髓造血细胞（Lin-c-Kit+,LK细胞）增殖能力降低,抗原刺激22次后检测到明显的T细胞功能障碍。采用IL-2对T细胞及骨髓造血细胞增殖分化异常的小鼠进行干预治疗,研究IL-2治疗后骨髓造血细胞增殖及分化能力的改变。研究中,我们设立蛋白抗原强化免疫2次作为抗原短暂刺激组对照。同时设立佐剂对照组排除佐剂对T细胞及造血细胞功能的影响。（2）T细胞功能分析。通过流式细胞术、细胞因子胞内染色法检测脾脏CD4+T淋巴细胞分泌IFN-γ的水平;应用MHC Ⅰ类分子-抗原表位肽五聚体染色技术检测TB 10.4 4-12特异性的记忆性CD8+T细胞的数量。（3）骨髓造血细胞的功能分析。无菌分离骨髓细胞,应用EdU增殖试验检测造血细胞的增殖能力;用ELISA方法检测骨髓造血微环境中IFN-γ和IL-2的水平;磁珠分选造血细胞,并应用实时荧光定量RT-PCR检测造血细胞分化相关转录因子Batf2、IRF8、GATA2和NOTCH1的表达水平,分析抗原刺激对造血细胞分化的影响。（4）IL-2对骨髓造血细胞的治疗作用及机制分析。IL-2干预后,检测上述指标的变化,分析IL-2的治疗效果及机制。结果:（1）结核分枝杆菌抗原持续刺激对T细胞功能的影响。应用结核分枝杆菌蛋白抗原持续刺激小鼠,对细胞因子的检测发现,与抗原短暂刺激组相比,抗原持续刺激12周时,脾脏CD4+T细胞受特异性抗原刺激分泌较高水平的IFN-γ（p<0.05）,但IFN-γ在持续抗原刺激22周后下降;应用MHC抗原表位肽五聚体技术检测发现持续抗原刺激12～22周,脾脏中TB10.4 4-12特异性记忆性CD8+T细胞的数量相比抗原短暂刺激组明显减少（p<0.01）。（2）结核分枝杆菌抗原持续刺激对造血细胞功能的影响。应用结核分枝杆菌蛋白抗原持续刺激小鼠,抗原持续刺激12周时,骨髓造血微环境中IFN-γ的水平明显升高（p<0.05）,但IFN-γ在抗原持续刺激后期下降。EdU增殖试验表明,与抗原短暂刺激组相比,抗原持续刺激12周及22周后LK细胞的增殖能力降低（p<0.05）。骨髓c-Kit+的细胞群中转录因子的表达水平与佐剂对照组相比也发生了明显变化:决定髓系分化的转录因子Batf2和IRF8表达上调,而促进淋巴系细胞分化的转录因子NOTCH1表达下调。（3）IL-2的治疗作用。在给予小鼠结核分枝杆菌蛋白抗原持续刺激的同时,我们应用IL-2进行干预治疗。结果发现,IL-2干预后,骨髓造血微环境中IL-2的水平升高。相比抗原持续刺激组,IL-2处理可下调Batf2和IRF8的表达,上调GATA2和NOTCH1的表达,LK细胞的增殖能力回升（p<0.05）。同时,T细胞耗竭也得到逆转:CD4+T细胞分泌IFN-γ的水平升高（p<0.05）,脾脏TB10.4 4-12特异性记忆性CD8+T细胞的数量显着增加（p<0.05）。（4）JAK3-STAT5信号通路的研究。JAK3-STAT5信号转导通路对造血细胞分化增殖起调控作用。相比佐剂组,抗原持续刺激组中JAK3和STAT5 mRNA表达水平较低。IL-2治疗后,JAK3和STAT5表达明显增强。结论:结核分枝杆菌抗原刺激诱导IFN-γ分泌为主的Th1型免疫应答。结核分枝杆菌抗原持续刺激诱导IFN-γ水平在一定时间内增高造成骨髓LK细胞增殖能力降低,并上调髓系分化相关的转录因子Batf2和IRF8的表达;补充IL-2可增强LK细胞的增殖能力,上调淋巴系分化相关转录因子GATA2、NOTCH1的表达,维持骨髓造血的稳态。此外,IL-2上调JAK3和STAT5的表达,推测IL-2也通过上调JAK3-STAT5途径分子表达调节造血细胞的增殖分化。因此,结核分枝杆菌抗原持续刺激会影响造血作用,导致造血细胞增殖能力降低,髓系分化相关的转录因子表达增高,而IL-2治疗可维持骨髓造血的稳态。本实验首次研究了结核分枝杆菌抗原持续刺激对骨髓造血细胞发育分化的影响,揭示了结核分枝杆菌持续感染状态下结核病患者免疫功能低下的机制及骨髓造血功能的改变,为进一步研究重症肺结核的精准诊治提供了思路。粟粒性肺结核是由于大量结核分枝杆菌在短时间内进入血液循环所引起的急性全身血行播散型结核病。其病情急且凶险、病死率较高。粟粒性肺结核患者由于体内结核分枝杆菌大量感染会导致机体造血功能障碍和免疫功能低下,但相关机制尚不清楚。目的:我们推测粟粒性肺结核是由大量结核分枝杆菌入血后,诱发T细胞过强的免疫反应,产生的细胞因子进一步作用于骨髓造血细胞,影响骨髓造血细胞的发育分化,淋巴细胞生成减少,最终引起机体免疫功能降低。为验证上述假设,本实验应用卡介苗（BCG）入血感染模拟临床粟粒性肺结核感染的免疫病理变化,研究其对骨髓造血系统和免疫系统的影响。方法:首先,调取临床粟粒性肺结核患者的病例资料,分析研究粟粒性肺结核临床病例外周血血细胞数量变化,研究骨髓造血功能的变化特点;其次,应用不同剂量BCG经尾静脉注射或滴鼻的方式感染小鼠,观察T细胞功能和骨髓造血功能的变化,并分析与造血细胞分化相关转录因子表达水平的改变,评价BCG感染对骨髓造血功能的影响和免疫应答特点,建立应用BCG感染模拟粟粒性结核造血功能受损的动物模型。（1）临床病例资料分析。分析2015年至2019年兰州市肺科医院收治入院的肺结核病例28,047例,其中粟粒性肺结核病例共118例。通过回顾性分析,研究粟粒性肺结核患者外周血血细胞数量变化。（2）BCG感染及IL-2治疗程序。根据文献报道及考虑到生物安全等因素,本课题应用大剂量BCG替代结核分枝杆菌感染小鼠来模拟临床粟粒性肺结核感染,首先用大剂量BCG（5×107 CFU/ml）分别以尾静脉注射和滴鼻的方式感染小鼠,分别于感染后3周、5周和8周,检测外周血血细胞数量、T细胞功能和骨髓造血细胞（LK细胞）增殖分化能力。研究中,设立低剂量BCG（5×105 CFU/ml）滴鼻感染小鼠作为对照,同时设PBS对照组排除外界因素和年龄对T细胞和骨髓造血细胞功能的影响。（3）外周血细胞数量、血清IFN-γ的水平和脏器指数的变化。将新鲜采集的小鼠血液加入抗凝管中,通过动物血液分析仪检测不同组血细胞数量的变化。未抗凝的外周血凝固后离心收集血清,用ELISA检测血清中IFN-γ的水平;通过称量脾脏、肝脏、肺脏及小鼠重量,观察BCG感染对脾脏指数、肝脏指数和肺脏指数的影响。（4）T细胞功能分析。通过ELISA检测脾脏淋巴细胞受BCG蛋白纯化衍生物（PPD）刺激后分泌IFN-γ和IL-2的水平;应用流式细胞术检测脾脏CD4+和CD8+T淋巴细胞表面表达抑制性受体PD-1的水平;应用EdU增殖试验检测脾脏CD4+和CD8+T淋巴细胞受PPD刺激后的增殖能力。（5）骨髓造血细胞的功能分析。无菌分离骨髓细胞并对其进行磁珠分选,得到LK细胞,用EdU增殖试验检测LK细胞的增殖能力;用ELISA的方法检测骨髓造血微环境中IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-6和GM-CSF的水平;提取LK细胞的总RNA,并应用实时荧光定量RT-PCR检测LK细胞中转录因子Batf2、IRF8、GATA2和NOTCH1的表达水平,分析BC G感染对LK细胞分化的影响。（6）IL-2治疗作用分析。在大剂量BCG入血感染后,应用IL-2对发生T细胞耗竭及骨髓造血细胞增殖分化异常的小鼠进行干预治疗。IL-2干预后,检测上述指标的变化,分析IL-2的治疗效果及机制。结果:（1）临床病例资料分析。我们回顾性分析了 2015年至2019年兰州市肺科医院收治的结核病病例28,047例,其中粟粒性肺结核病例共118例。根据患者外周血血细胞检测结果分析患者各类血细胞变化,发现118例粟粒性肺结核患者中89%发生淋巴细胞减少（105例）、23%发生白细胞减少（27例）、8.5%发生中性粒细胞减少（10例）、49.2%发生血红蛋白减少（58例）、11%发生红细胞减少（13例）、8.5%发生血小板减少（10例）、全血细胞减少6例,占4.2%。以上数据表明粟粒性肺结核常继发淋巴细胞减少,其次可继发白细胞减少、血红蛋白减少、血小板减少等各类血细胞减少症。（2）BCG感染对外周血血细胞数量和脏器指数的影响。在BCG感染后5周,与PBS组相比,大剂量BCG尾静脉注射组小鼠外周血白细胞、淋巴细胞和血小板减少,小鼠脾脏指数、肝脏指数和肺脏指数明显升高,提示脾脏、肝脏和肺脏明显肿大。（3）BCG感染对T细胞功能的影响。在BCG感染后3周、5周和8周,与PBS组、低剂量BCG滴鼻组和高剂量BCG滴鼻组相比,高剂量BCG尾静脉注射组脾脏CD8+T细胞明显高表达抑制性受体PD-1（p<0.05）。EdU增殖试验表明:低剂量BCG滴鼻组脾脏CD8+T细胞增殖能力明显强于其他组;相对于PBS组、低剂量BCG滴鼻组和高剂量BCG滴鼻组,高剂量BCG尾静脉注射组脾脏CD8+T细胞的增殖能力明显降低（p<0.05）。ELISA检测脾脏淋巴细胞受特异性抗原PPD刺激分泌IFN-γ和IL-2的水平,结果如下:在3-5周时高剂量BCG尾静脉注射组较低剂量BCG滴鼻组及PBS组产生较高水平的IFN-γ（p<0.05）,8周后产生IFN-γ的能力明显降低;在感染3-5周低剂量BCG感染组产生IL-2的水平高于PBS组和高剂量BCG尾静脉注射组（p<0.05）。（4）BCG感染对骨髓造血细胞功能的影响。在BCG感染后3周,高剂量BCG尾静脉注射组LK细胞增殖能力明显高于PBS组（p<0.01）,随后逐渐降低。骨髓上清液中细胞因子的变化如下:在BCG感染后5周,相比PBS组,高剂量BCG尾静脉注射组产生较高水平的IFN-γ和TNF-α（p<0.05）,IL-2、IL-6和GM-CSF的水平无明显变化,但低剂量BCG滴鼻组IL-2、IL-6和GM-CSF明显增高（p<0.05）。高剂量BCG尾静脉注射组骨髓LK细胞群中转录因子的表达水平与PBS对照组相比也发生了明显变化:髓系分化相关的转录因子Batf2和IRF8表达上调,而淋巴系分化相关的转录因子GATA2和NOTCH1表达下调。（5）IL-2的治疗作用。在大剂量BCG入血感染小鼠后,用IL-2进行干预治疗。结果发现,IL-2干预后,T细胞耗竭得以逆转。结论:回顾性分析临床粟粒性肺结核患者的病例资料,结果发现粟粒性肺结核患者会出现淋巴细胞减少、血红蛋白减少、血小板减少等造血功能受损表现,和文献报道一致。应用小鼠模型研究发现,大剂量BCG入血感染可致外周血淋巴细胞和血小板减少,诱导骨髓造血微环境中细胞因子IFN-γ和TNF-α的水平增高,导致骨髓LK细胞增殖能力降低,并上调髓系分化相关的转录因子Batf2和IRF8的表达,下调淋巴系分化相关转录因子GATA2和NOTCH1的表达,最终导致T细胞耗竭。补充IL-2后T细胞耗竭有所逆转。本研究结合临床病例资料和动物实验研究,从骨髓造血细胞发育分化的角度揭示粟粒性肺结核免疫功能低下的机制及骨髓造血功能的改变,为粟粒性肺结核防治提供了参考。T细胞发育分化过程需要糖酵解和氧化磷酸化提供能量,尤其是效应T细胞的糖酵解代谢更为活跃。上一章研究我们发现大剂量BCG入血感染会使T细胞过度活化,导致T细胞耗竭的发生。我们推测抑制糖酵解,减轻T细胞的活化,有可能阻断T细胞耗竭的发生。糖酵解也是肿瘤代谢的重要特征。我们实验室前期通过蛋白质组学筛选到宫颈癌组织高表达糖酵解酶烯醇化酶1（ENO1）。用ShRNA干扰沉默ENO1基因的表达可明显降低宫颈癌Hela和SiHa细胞的成瘤能力及侵袭转移能力,说明抑制ENO1表达可以阻断糖酵解,从而起到治疗肿瘤的作用。目的:虽然应用shRNA干扰ENO1表达可抑制肿瘤生长,但RNA干扰技术受到病毒载体和运输系统的限制。为了促进临床应用,本课题拟制备ENO1的单克隆抗体,进一步研究其抗肿瘤作用。此外,前两章的研究发现结核分枝杆菌抗原持续刺激和大剂量BCG入血感染会导致T细胞功能低下甚至耗竭,如何扭转耗竭对于结核病防治有重要意义。细胞代谢变化可决定T细胞功能,因而细胞代谢被认为是T细胞功能和分化的关键调节因子。本研究制备ENO1的单克隆抗体,后期将进一步通过干预T细胞代谢,研究治疗T细胞耗竭的新方法和策略。方法:本课题拟用真核表达系统表达ENO1蛋白,纯化ENO1蛋白,制备ENO1单克隆抗体。预期ENO1的单克隆抗体通过干扰肿瘤细胞表面ENO1可以降低肿瘤细胞迁移侵袭能力。我们筛选有较强抗宫颈癌SiHa细胞迁移侵袭能力的ENO1单克隆抗体。对编码ENO1单克隆抗体的基因进行测序,将其可变区基因序列重组构建在腺相关病毒上。后续我们将对腺相关病毒表达抗体可变区蛋白多肽的功能进行鉴定,对ENO1单克隆抗体对糖酵解的抑制作用展开深入研究。（1）ENO1的克隆、表达和纯化方案一:以pET30a-ENO1质粒为模板,将ENO1基因克隆入真核表达载体pcDNA中,构建重组质粒pcDNA3.1-ENO1,并将pcDNA3.1-ENO1以瞬时转染的方式成功转入人胚肾细胞（HEK-293T细胞）中,表达出ENO1蛋白,并用Ni-NTA介质进行纯化。方案二:将pcDNA3.1-ENO1以稳定转染的方式成功转染入中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1细胞）中,表达和纯化ENO1蛋白。方案三:将ENO1基因克隆入杆状病毒表达载体pFastBac1中,转入昆虫细胞Sf9中,表达和纯化ENO1蛋白。（2）ENO1单克隆抗体的制备。用ENO1蛋白反复免疫BALB/c小鼠,取出抗体滴度较高的小鼠脾脏细胞,与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。对阳性杂交瘤细胞进行反复筛选,获得效价较高的杂交瘤细胞株,诱导腹水产生,纯化得到ENO1单克隆抗体。（3）ENO1单克隆抗体的抗肿瘤作用评价。采用细胞划痕实验和Transwell小室实验检测五个ENO1单克隆抗体对宫颈癌SiHa细胞迁移、侵袭能力的影响,筛选出效果最佳的ENO1单克隆抗体。（4）ENO1单克隆抗体可变区基因测序。分别提取五株杂交瘤细胞的RNA,通过RT-PCR获得相应的cDNA。基于抗体重链和轻链恒定区的已知序列设计3’-末端基因特异性引物,联合5’-末端的通用引物用于cDNA基因的PCR扩增,通过对扩增产物进行测序,获得ENO1单克隆抗体重链和轻链可变区基因序列。（5）腺相关病毒包装ENO1抗体的可变区基因。选择对宫颈癌细胞的迁移、侵袭能力有明显抑制效果的ENO1单克隆抗体H1的轻链和重链可变区基因,中间用Linker--（GGGGS）3连接,克隆在pAAV-MCS载体上,由公司合成,简称rAAV-H1。对AAV辅助病毒系统中的pHelper、pAAV-RC和rAAV-H1菌液进行复苏、保种和扩增,并大量抽提质粒,将其转染入AAV-293细胞中,观察其转染效率、收集病毒并进行滴度测定。同时,将带有绿色荧光蛋白的pAAV-IRES-ZsGreen1转入AAV293细胞中,作为空载体对照（rAAV-GFP）。结果:（1）ENO1蛋白表达与纯化。首先将pcDNA3.1-ENO1以瞬时转染的方式成功转染入HEK-293T细胞中,表达纯化ENO1蛋白,但蛋白得率太低;将pcDNA3.1-ENO1以稳定转染的方式成功转染入CHO-K1细胞中,表达纯化目的蛋白,同样蛋白得率太低;最后将ENO1基因克隆入pFastBac1中,转入Sf9细胞中,蛋白表达量高,纯化出高纯度的ENO1蛋白。（2）ENO1单克隆抗体制备。ENO1蛋白免疫小鼠后,通过杂交瘤技术成功筛选到5株效价较高的阳性杂交瘤细胞株,纯化获得相应的单克隆抗体。（3）ENO1单克隆抗体对宫颈癌细胞迁移、侵袭作用的影响。应用细胞划痕实验和Transwell小室实验,初步评价5个ENO1单克隆抗体的抗肿瘤细胞迁移、侵袭作用。检测结果示五个ENO1单克隆抗体对宫颈癌SiHa细胞迁移、侵袭能力均有抑制作用,其中H1的抑制作用最强。（4）ENO1单克隆抗体可变区基因测序。在得到单克隆抗体的基础上,利用通用引物从杂交瘤细胞的RNA钓取抗体的重链和轻链可变区基因,对获得的抗体可变区基因进行测序,成功获得可变区基因序列。（5）腺相关病毒包装ENO1抗体的可变区基因。将得到的ENO1抗体重链和轻链可变区基因构建在腺相关病毒载体上,得到rAAV-H1。大量抽提得到浓度较高的pHelper、pAAV-RC和rAAV-H1质粒,将其转染入AAV293细胞中,结果示转染成功,且转染效率达到90%。结论:应用杆状病毒表达载体,成功表达和纯化出高纯度的ENO1蛋白;应用ENO1蛋白免疫小鼠,通过杂交瘤技术成功制备和筛选到5个高效价的ENO1单克隆抗体;通过ENO1单克隆抗体对宫颈癌细胞的迁移、侵袭能力的抑制作用评价,筛选出有明显抑制效果的ENO1单克隆抗体H1;成功获得ENO1单克隆抗体的可变区基因序列。将ENO1抗体的可变区基因重组到腺相关病毒载体上,得到rAAV-H1。ENO1单克隆抗体的制备和相关研究为下一步研究ENO1单克隆抗体抑制糖酵解抗肿瘤和T细胞耗竭作用奠定了基础。
张瑞仙[4]（2019）在《miR-5003调节ETS1-3’UTR促进SLE患者B细胞分化的机制研究》文中进行了进一步梳理[目的]筛选系统性红斑狼疮（SLE）患者外周静脉血单个核细胞（PBMC）中在转录水平与正常对照具有显着差异表达的基因;验证ETS1的表达水平,并分析该基因的表达与单核苷酸多态性（SNP）的相关性,探索SNP影响ETS1表达及其在B淋巴细胞中的机制及功能效应;根据SNP的基因位置,寻找影响ETS1变化的上游机制,并检测下游ETS1对B细胞功能的影响;同时,探索SNP对SLE患者不同临床表现的影响。本研究将为临床早期诊断和疾病预后提供潜在标记物。[方法]收集3例SLE患者和3例健康对照的外周静脉血,用二代测序技术筛查PBMC中具有显着差异性表达的基因,进而通过GO、KEGG和Cytoscape分析显着差异表达基因（DEGs）的富集情况。扩大样本量后,用定量聚合酶链反应（qPCR）检测ETS1在两组样本PBMC、B和Th淋巴细胞中的相对表达水平,SNaPshot技术进行基因分型;构建rs4937333位点为野生型C或突变型T的ETS1质粒并包装慢病毒,感染SLE患者外周静脉血B淋巴细胞,用qPCR和蛋白免疫印迹法（Western Blot,WB）检测并比较ETS1的表达。进而将不同等位基因质粒转染昆明小鼠脾脏B淋巴细胞,分别或联合使用anti-IgM、anti-CD40L、LPS、IL4进行体外刺激,采用流式细胞术（FCM）、酶联免疫吸附试验（ELISA）检测并比较两组间B细胞的激活、分泌、分化及浆细胞的分泌水平。最后,利用3个专业网站在线预测可能与rs4937333结合的miRNA,荧光素酶报告基因实验验证两者的体外结合情况,qPCR和WB检测miR-5003转染的细胞中ETS1的表达水平;并检测样本Th和B细胞中miR-5003的表达水平。[结果]PBMC转录组测序后,共发现117个显着上调和35个显着下调的功能基因,ETS1是显着下调基因之一;DEGs主要富集在与炎症和固有免疫相关的条目、SLE和固有免疫通路。扩大的样本量包括66名SLE患者和42名健康对照者,病例组的PBMC和B淋巴细胞中ETS1转录水平显着降低,而Th细胞中未发现显着差异;对ETS1 3’UTR的8个SNPs进行测序,发现rs4937333（C→T）的突变型在SLE患者组显着高于对照组（OR=1.800,95%CI（1.026-3.157）,p=0.040）。而且,SLE 患者 B 细胞中 ETS1 mRNA的表达水平与5种临床表型（蝶形红斑、光敏感、关节炎、血液病变及ANA阳性）相关。野生型和突变型ETS1病毒感染SLE患者B淋巴细胞后,发现突变型ETS1的转录和翻译水平均明显降低。野生型和突变型质粒转染小鼠脾脏B淋巴细胞后,经4种刺激物作用,激活标记物CD23、CD69、CD86的表达均未发现差异,上清中所分泌的IL-6、IL10、TNFα的表达也均未发现差异（p值均>0.05）;然而,经anti-IgM+IL4共同刺激后,突变型B细胞分化为浆细胞的能力显着增强,同时,突变型B细胞所分化的浆细胞培养上清中IgM、IgG、IgA和IgE的分泌也显着高于野生型组。荧光素酶报告基因实验结果表明,miR-5003通过与突变型ETS1 3’UTR结合活性增强,导致ETS1表达水平低于野生型;临床样本检测发现,SLE患者外周静脉血B细胞中miR-5003的表达显着高于健康对照及Th细胞。[结论]SLE患者外周静脉血B淋巴细胞中,miR-5003通过与ETS1-3’UTR的突变型rs4937333结合增强,促进了 ETS1 mRNA的降解,使其转录和翻译水平均降低,进而促进了 B细胞分化为浆细胞,并使免疫球蛋白分泌增多,与临床表现中的蝶形红斑、光敏感、关节炎、血液病变及ANA阳性相关。从临床意义来讲,rs4937333多态性可影响SLE活动度,可能有助于判断疾病预后,而且,B细胞中的miR-5003表达水平有望成为SLE早期诊断和评价疾病活动度的生物标志物。
孟淑芳,王佑春,吴雪伶,赵翔,黄维金,王斌,王萌,宋雪,贾芳英,霍艳,侯田田,黄瑛,文海若,李芊芊,屈哲,王歈,俞磊[5]（2018）在《CAR-T细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》文中提出一引言嵌合抗原受体T细胞（Chimeric antigen receptor T cell,CAR-T）,是指通过基因修饰技术,将带有特异性抗原识别结构域及T细胞激活信号的遗传物质转入T细胞,使T细胞通过直接与肿瘤细胞表面的特异性抗原相结合而激活,通过释放穿孔素、颗粒酶素B等直接杀伤肿瘤细胞,同时还通过释放细胞因子募集人体内源性免疫细胞杀伤肿瘤细胞,从而达到治疗肿瘤的目的,而且还可形成免疫记忆
姜大春[6]（2009）在《HO-1基因转染对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的实验研究》文中进行了进一步梳理研究背景:急性心肌梗死（Acute myocardial infarction,AMI）死亡率高,即使幸存者,心功能亦有不同程度的损害,严重危害人们健康。它不仅影响病人的生活质量,而且也给患者家庭和社会增加了过重的负担。近20年来,AMI的诊断和治疗取得了长足进步。一方面,溶栓、经皮冠状动脉介入治疗（Percutaneous Coronary Intervention,PCI）和冠状动脉旁路移植术（Coronary Artery Bypass Grafting,CABG）等血运重建治疗极大地改善了这些病人的预后,另一方面,却又引起了不容忽视的心肌缺血再灌注损伤（Ischemia Reperfusion Injury,IRI）,从而降低了其临床疗效。IRI的发生和发展过程是一个多因素相互作用的级联反应,主要的损伤机制有自由基损伤、钙超载、微血管损伤和白细胞的作用等。近年来研究发现,补体、选择素、内皮素和细胞凋亡等均参与了IRI的病理变化过程和结果。可见,IRI可能是多分子、多机制、相互影响、相互促进的病理变化。多年来,IRI一直是心肌缺血治疗中难以解决的问题。虽然尝试了大量的新药和多种防治措施,但由于其作用途径均是外源性的,所以对IRI治疗始终未获得突破性进展,到目前为止仍无系统性治疗措施。在心肌IRI中心肌保护因子的作用一直是研究的热点,血红素氧合酶（Heme Oxygenase,HO）作为一种新型的心肌保护因子,通过其产物的抗炎、抗氧化、抗凋亡和抗心律失常等作用,可在心肌缺血再灌注损伤中发挥重要的保护功能。HO是降解亚铁血红素（Heme）为一氧化碳（CO）、亚铁离子（Fe2+）和胆绿素的胞内限速酶。HO-1是3种HO同功酶中唯一呈诱导性表达的同工酶。HO-1（血红素氧合酶-1）又称HSP32,属于热休克蛋白（Heat Shock Protein,HSP）家族。和其它HSP一样,HO-1的诱导表达是细胞应激时最重要的保护机制之一。HO-1在生理条件下其基因表达处于低水平（除脾脏外）,但多种应激因素（如:炎症、缺血、高氧、低氧、或辐射等）可使其表达明显增加。以往的研究表明,HO-1的过度表达,可减轻缺血再灌注损伤,但目前国内外关于HO-1的研究多采用化学诱导剂氯化高铁血红素、钴原卟啉（如:Hemin、CoPP）或抑制剂锌卟啉（如:ZnPP）,而化学诱导剂在诱导体内HO-1表达增加的同时可能还会影响体内其他基因的表达,而且有研究显示Hemin本身可引起线粒体的损伤,同时锌卟啉在抑制HO-1的同时也会抑制其他酶（如:NO合酶、鸟苷酸环化酶）的活性,从而影响对HO-1抗缺血再灌注损伤评估。近年来,通过转基因技术将具有细胞保护的基因用于体外转染,逐渐成为组织抗损伤极具希望的策略。而过去对于HO-1转基因技术研究多集中肝、肾移植物的抗缺血再灌注损伤作用方面,其结果令人满意,而对于心肌的缺血再灌注损伤方面研究甚少。这些正是我们构建携带HO-1基因重组腺病毒对大鼠心肌缺血再灌注损伤研究的重要出发点。研究目的和途径:1.Ad-HO-1重组腺病毒载体构建和鉴定;2.将Ad-HO-1重组腺病毒载体感染培养的乳鼠心肌细胞,探讨Ad-HO-1感染靶细胞的效率、目的基因表达产物水平,并通过培养心肌细胞缺氧再复氧模型模拟缺血再灌注模型的建立,从细胞水平探讨HO-1基因对心肌细胞缺氧再复氧损伤的影响及其机制;3.Ad-HO-1重组腺病毒载体预先间接冠脉内转染大鼠心肌后建立心肌缺血再灌注损伤模型,观察Ad-HO-1在体转染对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制,为缺血再灌注损伤的防治提供新的途径。研究方法:应用高效的细菌内同源重组方法成功构建重组腺病毒质粒pAdEasy-HO-1,经293细胞包装后,扩增、浓缩,最终获得高效、稳定表达HO-1基因腺病毒Ad-HO-1。采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中带有GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。体外实验:采用改良方法分离和培养乳鼠原代心肌细胞,测定重组腺病毒介导的基因转导效率及HO-1表达;建立心肌细胞缺氧、复氧模型模拟心肌缺血再灌注,并进行目的基因转染。观察心肌细胞搏动和形态学变化,采用台盼蓝排斥法检测心肌细胞存活率,测定培养上清液乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸磷酸激酶同工酶（CK-MB ）含量,丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性,荧光成像系统测定细胞内钙离子浓度。RT-PCR及Western blot法检测心肌细胞HO-1表达,TUNEL法检测心肌细胞凋亡。体内实验:健康雄性SD大鼠随机分为4组:假手术组（SH组）,生理盐水组（NS组）,腺病毒-荧光蛋白组（Ad组）和腺病毒-HO-1组（HO组）。后3组用自制无损伤血管钳阻断主、肺动脉循环10秒钟,同时于心尖部分别注射单纯生理盐水1ml、含空载体腺病毒（5.0×109PFU）或含重组HO-1腺病毒（7.5×109PFU）的生理盐水1ml,术后3天采用结扎左冠状动脉前降支30min,再灌注120min的方法建立心肌缺血再灌注模型,采用颈动脉插管法测定大鼠缺血再灌注各时相血流动力学指标,再灌注120min后,抽血测定血清心肌酶LDH、CK-MB,并处死大鼠,取左心室缺血部位心肌标本,在荧光显微镜下观察心肌细胞荧光蛋白的表达,计算转染率,TTC法测定左心室心肌梗死面积,并测定心肌组织超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量,电镜下观察心肌细胞的超微结构,RT-PCR、Western blot和TNUEL法检测心肌组织HO-1mRNA、蛋白的表达和心肌细胞的凋亡。研究结果:1.成功构建了重组腺病毒载体Ad-HO-1,经293细胞大量扩增,获得病毒滴度约2×1011pfu/ml;2.心肌细胞转染重组腺病毒Ad-HO-1后12小时至3天均可检测到HO-1mRNA及蛋白的表达,表明HO-1的表达比较稳定;3.细胞实验结果:正常心肌细胞HO-1mRNA表达水平极低（0.093±0.037）,与正常对照组（C组）相比,缺氧复氧组（IR组）、空载体组（Ad组）和基因转染实验组（HO组）心肌细胞HO-1mRNA表达（分别为0.337±0.048、0.340±0.082、0.775±0.058）显着升高（ P<0.01）,与IR组和Ad组相比,HO组HO-1mRNA表达进一步显着增高（P<0.01）,各组HO-1蛋白表达与其mRNA表达类似;IR组的细胞存活率降低,基因转染组（HO组）的细胞存活率（87.3±2.6%）显着高于IR组和Ad组（83.0±1.6%、81.6±1.7%）（P<0.01）;与对照组（114.3±13.2次/min）相比,IR组和Ad组搏动频率（65.3±5.1次/min、58.9±4.4次/min）显着减慢（P<0.01）,HO组搏动频率（97±3.4次/min）显着高于IR组（P<0.01）,但显着低于C组（P<0.01）;IR组和Ad组LDH活性、CK-MB含量较C组显着升高（P<0.01）,HO-1基因转染预处理后LDH活性、CK-MB较IR组和Ad组显着降低（P<0.01）,但与C组比差异仍有显着性（P<0.01）;IR组和Ad组SOD活性（6.63±1.41、6.75±1.67 U/mg）较C组（12.88±1.46 U/mg）显着下降,HO-1基因转染预处理后SOD活性（9.25±1.04 U/mg）均较IR、Ad组升高（P<0.01）,但显着低于C组（P<0.01）;细胞内钙离子测定结果显示,IR组和Ad组细胞内游离钙离子（[Ca2+]i）离子浓度（483.6±4.5nmol/L、487.3±5.1nmol/L）较正常对照组（183.4±4.9nmol/L）显着升高（P<0.01）,HO-1基因转染预处理后[Ca2+]i含量（235.5±10.0 nmol/L）较IR组降低（P<0.01）;与C组（3.12±0.83%）比较,IR和Ad组凋亡率显着增加（P<0.01）,而HO-1基因转染预处理后心肌细胞凋亡率（13.13±1.72%）明显低于IR组和Ad组（27.88±2.23%、26.38±1.51%）（P<0.01）。IR组和Ad组各指标均无显着差异（P>0.05）。4.在体实验结果:仅Ad和HO组心肌观察到荧光蛋白的表达,两者无显着差异（P>0.05）,其转染率分别为54.2±6.3%和56.8±7.0%;SH组见心肌组织极少量HO-1mRNA、蛋白表达。在心肌缺血再灌注后,NS和Ad组心肌组织HO-1mRNA、蛋白表达高于SH组（P<0.01）,HO组心肌组织HO-1mRNA、蛋白表达非常显着地高于Ad和NS组（P<0.01）;与NS组比较,Ad组HO-l蛋白及HO-lmRNA表达差异无统计学意义（P>0.05）;Ad组、NS组和HO组SBP、DBP、MAP、±dp/dtmax绝对值在缺血30min和再灌注1h、2h时相点低于SH组,差异有显着性（P<0.01）,HO组SBP、DBP、MAP、±dp/dtmax绝对值均高于相同时相点NS组和Ad组（P<0.01）,各时相点HO组的SBP、DBP、MAP、+dp/dtmax和-dp/dtmax等指标恢复率（%）均相应显着高于NS组和Ad组（P<0.01）;与SH组相比,NS组、Ad组和HO组血清LDH和CK-MB水平均明显升高（P<0.01）,表明心肌组织因缺血再灌注而造成损伤,但HO组血清LDH和CK-MB水平与NS组和Ad组相比显着减少（P<0.01）;与NS组和Ad组比较,HO组心肌病理改变减轻,梗死心肌重量（ISW）和梗死面积（ISW/AARW）显着降低（P<0.01）;与SH组相比,NS、Ad组和HO组MDA含量均明显升高,SOD活性降低（P<0.01）,表明心肌组织因缺血再灌注损伤造成氧自由基的改变,但与NS和Ad组相比,HO组MDA含量明显减少,SOD活性显着升高（P<0.01）;SH组仅见极少数散在的凋亡细胞,心肌缺血再灌注后凋亡细胞数明显增加,NS、Ad和HO组心肌细胞凋亡指数显着高于SH组（4.53±1.81）（P<0.01）,但与NS、Ad组（26.46±4.23%、25.15±3.11%）比较,HO组心肌细胞凋亡指数（16.84±2.88%）显着下降（P<0.01）,NS和Ad组两组心肌细胞凋亡指数差异无统计学意义（P>0.05）。研究结论:1.本实验采用腺病毒AdEasy系统,应用细菌内同源重组方法成功构建重组腺病毒载体Ad-HO-1,经293细胞扩增,获得病毒滴度约2×1011pfu/ml。2.本实验成功建立了体外乳鼠心肌细胞缺氧复氧模型,腺病毒介导的HO-1基因高表达对乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤有显着的保护作用,这一作用与其抑制心肌细胞凋亡、抑制细胞内钙超载、减少氧自由基生成有关。3.本实验建立了在体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,通过腺病毒介导HO-1基因预先间接冠脉内转染致在心肌中高表达HO-1,能够促进再灌注后心功能恢复、减少心肌酶的释放、缩小心肌梗死面积、减轻心肌组织病理损伤,从而产生心肌保护作用。并进一步证实了HO-1抗缺血再灌注心肌损伤作用机制与抗氧化和抑制心肌细胞凋亡有关。4.本研究结果有利于加深对HO-1在心肌缺血再灌注损伤中的作用及其作用机制的认识,HO-1基因转染可望成为心肌缺血再灌注损伤防治的一种新途径和方法。
李玉艳[7]（2008）在《携带HBB基因shRNA的人脐血CD34+细胞构建及其应用基础研究》文中指出β-血红蛋白病是一组多相群的单基因疾病,重型可致死。为了探讨其基因治疗的可行性及潜在价值。本课题拟选择对β-珠蛋白基因具有靶向RNAi的特异序列,并构建慢病毒载体,采用体外筛选法获得目的序列及质粒,以期能与β-珠蛋白等位基因特异性结合抑制RNA的表达,并了解感染细胞的体内植入和增殖情况,以期在以后试验中与其它基因表达载体组合共同用于治疗β-血红蛋白病。内容和方法1.从GeneBank查找HBB mRNA序列,设计挑选3个RNAi靶点,每个合成两条单寡核苷酸链,退火后连入酶切的pGCL-GFP载体,将连接产物转染感受态细菌,对长出的克隆进行PCR鉴定,测序比对。对阳性克隆进行质粒抽提。2.用PCR方法从模板钓取相应的HBB序列片段,将片段与pdsRED2-N1载体进行双酶切后定向连接,转染感受态细菌,长出的克隆进行PCR鉴定,测序和比对分析后,对阳性克隆进行质粒抽提。3.HBB-RNAi-LV质粒和HBB过表达质粒,按低浓度组（0.5:1）和高浓度组（1:1）用Lipofectamine2000共转染293T细胞,48h后FM观察GFP表达,Western Blot检测FLAG-HBB融合蛋白表达。4.将HBB-RNAi-LV质粒和慢病毒包装载体pHelper 1.0及pHelper 2.0载体按4:3:2比例添加,转染293T细胞,培养48小时后收集培养上清,利用Plus-20离心超滤装置对病毒上清进行离心超浓缩。5.人脐血MACS法分离的CD34+细胞,加入细胞因子进行无血清无基质预培养,慢病毒感染,48h后FM观察感染率,Real-Time PCR检测感染2、4、5天的HBBHBG基因表达情况,Western Blot检测感染7天的HBB蛋白表达。6.人脐血CD34+细胞,体外用高浓度细胞因子预刺激培养过夜后感染慢病毒24小时,经皮注射入SCID新生小鼠腹腔,密切观察小鼠存活情况。7.移植后3周,用FM和FCM检测小鼠外周血中人HbF细胞和成人红细胞,外周血有核细胞中的GFP阳性细胞;骨髓细胞中的GFP阳性细胞,并观察小鼠肝、脾、肾脏、小肠等组织中的GFP阳性细胞分布。结果1.构建了3个HBB基因的RNAi-LV载体（PSC1、PSC2、PSC3）及一个对照质粒PSCNC。2.构建了含有相应HBB基因片段的过表达载体HBB- pdsRED2-N1-3Flag质粒。3.外源筛靶试验中PSC1、PSC3对HBB融合蛋白有明显敲减作用,随着浓度增加敲减作用增强,其中PSC1靶点的敲减效果最好。4.包装并获得高滴度的PSC1、PSC3和PSCNC慢病毒。5.慢病毒在CD34+细胞中的感染率为1530%,病毒感染明显激活细胞中的HBB和HBG基因表达,PSC1促进HBB珠蛋白表达,PSC3则显着抑制HBB和HBG珠蛋白表达,其抑制效果与感染率有关。6.移植CD34+细胞后,小鼠外周血中人HbF细胞及成人红细胞为0.11.2%;有核细胞中GFP细胞,PSCNC组为3.210.2%, PSC3组为4.48.8%;骨髓细胞中GFP细胞PSCNC组为1.55.5%, PSC3组为1.36.2%,各组间均无统计学意义。肝、脾、肾和小肠等组织均未见明显的GFP阳性细胞。结论1.系统建立了完整的人脐带血CD34+细胞分离、无血清无基质培养和慢病毒感染的实验方法。2.成功构建了3个β-珠蛋白基因shRNA的慢病毒载体,通过外源筛靶方法初筛出2个有效序列,经慢病毒包装获得了高滴度的病毒颗粒。3.成功筛选到一条对HBB基因有抑制作用的RNAi序列。4.人脐血CD34+细胞移植入未骨髓抑制的免疫缺陷病新生小鼠腹腔,可成功归巢、增殖,主要增殖为自身缺陷的淋巴系统,红系缺乏表达优势。
刘伟[8]（2007）在《Mdr1在肿瘤化疗中疗效及骨髓保护的实验研究》文中认为目的:克隆多药耐药基因1（MDR1）至腺病毒质粒载体中并导入包装细胞,产生表达目的基因的重组腺病毒。方法:PCR法体外克隆出目的基因并将该基因采用定向克隆的方法克隆进入穿梭质粒pAdTrack-CMV中,采用同源重组方法将该质粒和腺病毒质粒Adeasy-1连接,最后通过脂质体介导的方法导入包装细胞HEK293中,产生表达目的基因的重组腺病毒。结果:（1）PCR法克隆出目的基因MDR1,并通过基因测序筛选出正确的克隆,成功构建重组质粒pAdTrack-MDR1;（2）将MDR1基因克隆进入腺病毒质粒载体中形成重组腺病毒质粒Adeasy-MDR1,并将重组腺病毒质粒Adeasy-MDR1导入包装细胞HEK293中形成表达mdr1的高滴度重组腺病毒Ad5-MDR1。（3）收获的病毒感染液滴度达8.3×1011pfu/ml结论:克隆出正确的MDR1基因并重组含有目的基因MDR1的腺病毒,收获高滴度重组腺病毒Ad5-MDR1,为进一步的研究打下了良好的基础。目的:建立一套完整、稳定、高效的体外基因转染体系将外源性mdr1基因导入C57和Balb/c小鼠骨髓单个核细胞,评价转染后mdr1基因在靶细胞中功能性表达情况,为进一步将转染的骨髓细胞移植保护受体骨髓免受大剂量化疗药物的损伤实验提供基础。方法:采用乒乓交互感染收集并浓缩病毒上清,采用浓缩病毒上清转染法将mdr1基因导入肿瘤坏死因子α（TNF-α）预处理后的C57和Balb/c小鼠骨髓单个核细胞,采用RT-PCR法、Western-blot分别从基因、蛋白质水平检测mdr1基因在小鼠骨髓单个核细胞中的功能性表达,柔红霉素排出试验从功能水平检测mdr1基因在小鼠骨髓单个核细胞中的功能性表达情况,探讨转染时间和转染效率、功能之间的关系。结果:（1）建立了一套完整、稳定、高效的mdr1基因体外转染体系;（2）流式细胞仪测得体外转染率可达到26.26%,（3）柔红霉素排出试验证实导入的mdr1基因表达产物P-gp有药物外排泵功能。（4）RT-PCR法证实外源性mdr1基因有效地在小鼠骨髓单个核细胞基因组表达;（5）Western-blot测得转染后P-糖蛋白（P-glycoprotein P-gp）表达较转染前明显增高;结论:通过腺病毒载体可在体外将外源性mdr1基因有效的转入小鼠骨髓单个核细胞中,转染的mdr1基因能有效地在靶细胞基因组中表达,为进一步移植转染细胞保护骨髓免受大剂量化疗损伤的体内实验提供基础。目的:本研究旨在通过mdr1基因转染的骨髓造血细胞移植来提高C57和Balb/c小鼠肺癌和乳腺癌骨髓对化疗的耐受性,然后观察超剂量化疗中mdr1基因的骨髓保护及肿瘤治疗作用;并监测外源性mdr1基因在受体骨髓内表达的情况。方法:将小鼠骨髓单个核细胞与含有人全长mdr1 cDNA的腺病毒共培养4日后,将转染细胞经骨髓腔注射移植入经60CO放疗预处理的Lewis肺癌和4T1乳腺癌荷瘤小鼠体内,然后进行超剂量表阿霉素化疗实验,检测mdr1基因对受体骨髓的保护作用、超剂量化疗对肿瘤的治疗作用。同时采用RT-PCR法、Western blot法分别从基因、蛋白水平检测外源性mdr1基因在受体骨髓的表达情况。结果:（1）采用培养细胞移植法成功建立Lewis肺癌和4T1乳腺癌动物模型;（2）采用骨髓腔内注射移植将转染mdr1基因的骨髓单个核细胞回输入荷瘤小鼠,受体骨髓中有外源性mdr1基因的功能性表达;（3）超剂量化疗实验中,转染mdr1基因的荷瘤小鼠能耐受3倍剂量表阿霉素的化疗,外周血白细胞可维持在正常范围,同时肿瘤能被有效治疗,荷瘤动物的生存时间及生存质量明显高于对照组（P﹤0.05）,对照组荷瘤动物死于超剂量化疗所造成的严重骨髓抑制或肿瘤扩散。结论:mdr1基因转染的骨髓造血细胞移植后可于受体骨髓中功能性表达;mdr1基因能有效保护骨髓的造血功能,使超剂量化疗能更有效杀灭肿瘤。
田宏[9]（2006）在《猪水疱病和猪瘟基因工程亚单位疫苗的研究》文中进行了进一步梳理猪水疱病和猪瘟均被世界动物卫生组织（OIE）列入A类动物疫病。猪水疱病是一种急性传染病,该病的临床症状与口蹄疫及其它水疱性疾病相似,难以区分,从而妨碍了猪及猪产品的流通和国际贸易;猪瘟是一种急性烈性传染病,致病力强,危害严重。猪瘟弱毒疫苗对于控制猪瘟大流行虽然起到重要的作用,但使用弱毒疫苗后,难以区分疫苗免疫和野毒感染动物,不利于鉴别病猪。目前,国际上还没有预防猪水疱病的疫苗。研制安全高效并具有潜在标记的基因工程疫苗,将为控制猪水疱病和猪瘟探索新的技术方法。本研究通过一系列分子生物学技术制备了猪水疱病和猪瘟基因工程亚单位疫苗,研究其免疫效果,为猪水疱病和猪瘟新型疫苗的研究探索一条可供参考之路。1.构建了猪水疱病结构蛋白P1区重组逆转录病毒载体（pBABE puro-P1）,并与水疱性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293包装细胞,获得了包装完整的假病毒,测定滴度。假病毒经polybrene（8μg/mL）的介导使该假病毒感染靶细胞PK-15,嘌呤霉素筛选阳性细胞克隆。间接免疫荧光显示PK-15细胞表达的P1衣壳前体蛋白能被猪水疱病病毒（SVDV）阳性血清所识别,表明所表达的蛋白具有良好的反应原性;PCR可从不同代次（分别选取第1,8,16代和30代）的阳性细胞中扩增到SVDV的P1基因,证明靶细胞可稳定的携带目的基因传代。2.大量收获阳性细胞培养物,用弗氏佐剂乳化并免疫豚鼠。通过淋巴细胞增殖试验、阻断ELISA和细胞中和试验,对制备的疫苗效力进行了评价。结果显示,与对照组相比,免疫组豚鼠的外周血淋巴细胞有明显的增殖;阻断ELISA结果表明,免疫组4号豚鼠从首免后的第3周开始出现特异性SVDV抗体,而其他的免疫组豚鼠也从免疫后的第4周开始的全面出现SVDV抗体;应用微量细胞中和试验对免疫接种后第4周、第6周及第8周采集的豚鼠血清中和抗体的滴度进行了检测。结果表明,免疫接种4周时,免疫接种组2号豚鼠的中和抗体为1∶8,其余均小于1∶8;免疫接种组从第6周开始,中和抗体滴度均达到1∶8,甚至超过1∶8,而空白对照组血清中和抗体始终全部小于1∶4。3.采用与猪水疱病类似的方法建立了表达猪瘟病毒（CSFV）E2蛋白的细胞株。免疫荧光和ELISA显示,PK-15细胞表达的E2蛋白能被CSFV阳性血清所识别,表明所表达的蛋白具有良好的反应原性;PCR可扩增到不同代次（本次试验分别选取第1,10,20代和30代）阳性细胞基因中的E2基因,证明靶细胞可稳定的携带目的基因传代。4.大量收获表达产物,乳化并免疫家兔。通过T淋巴细胞增殖试验、阻断ELISA
孙逊[10]（2005）在《静脉注射用治疗基因靶向传递系统的研究》文中指出随着人类基因组计划的完成和人类疾病相关基因的阐明,疾病的基因治疗备受瞩目。基因治疗的关键问题之一在于开发安全、高效的基因传输系统。目前,基因传输系统主要分为病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体虽然具有较高的基因传递效率,但其临床应用存在着毒性和免疫原性等问题。因此,非病毒载体系统的研究成为另一重要的发展方向。非病毒载体具有使用方便、可大规模生产以及无免疫原性等优点,其中阳离子脂质体是研究应用得最为广泛的非病毒载体。但由于阳离子脂质体在体内的稳定性和靶向性较差,常常只能采取局部注射的给药方式。 为了构建一种可供静脉内注射的、具有靶向传输作用的基因载体,本文设计用由海洋鱼类提取的天然产物鱼精蛋白,作为聚阳离子材料缩聚质粒DNA,再让脂质体与缩聚后的DNA相互作用,从而使脂质双层重新排列,最终形成结构紧密的脂质-聚阳离子-DNA复合物（Lipid-polycation-DNA complexes, LPD）。 本研究中我们利用微生物发酵的方法大量培养转化有质粒的大肠杆菌,并采用阴离子柱层析的方法分离纯化质粒。采用紫外分光光度法和凝胶电泳法对质粒的纯度和含量进行了测定,纯度符合要求。 我们建立了用荧光染料Hoechst 33258来测定制剂中DNA含量的方法。采用薄膜-挤压法制备空白脂质体,然后与适量的鱼精蛋白-DNA复合物在室温孵育后,得到LPD;分别用单因素法和中心组合法优化了阳离子型LPD和阴离子型LPD的处方。 为了提高阳离子型LPD的物理化学及生物学稳定性,我们将其制备成冻干针剂。冻干后的LPD可以保持其结构的完整性。冻干后的LPD针剂外观饱满疏松,色泽均匀,表面细腻光洁,具有足够的强度;其粒径为132.5nm,Zeta电位为44.35mV,包封率为93.61%,微粒的形态和
二、高滴度逆转录病毒载体4种转染方法对小鼠脾脏T细胞转染率的比较（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、高滴度逆转录病毒载体4种转染方法对小鼠脾脏T细胞转染率的比较（论文提纲范文）
（1）虹鳟传染性造血器官坏死病-传染性胰腺坏死病二联活载体疫苗的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 传染性造血器官坏死病研究进展 |
| 1.1 传染性造血器官坏死病病原学概况 |
| 1.1.1 传染性造血器官坏死病病毒分类、命名 |
| 1.1.2 IHNV形态学结构 |
| 1.1.3 IHNV宿主系统 |
| 1.1.4 IHNV基因组结构 |
| 1.2 传染性造血器官坏死病流行病学 |
| 1.3 IHN临床症状和病理变化 |
| 1.4 IHN疫苗研究概况 |
| 2 传染性胰腺坏死病研究进展 |
| 2.1 传染性胰腺坏死病病原学概况 |
| 2.1.1 IPNV分类 |
| 2.1.2 IPNV形态结构 |
| 2.1.3 IPNV宿主系统 |
| 2.1.4 IPNV基因组结构 |
| 2.2 传染性胰腺坏死病流行病学特征 |
| 2.3 IPN临床症状和病理变化 |
| 2.4 IPN疫苗研究进展 |
| 3 腺病毒表达系统概述 |
| 3.1 腺病毒概况 |
| 3.2 腺病毒载体的发展历程 |
| 3.2.1 复制型腺病毒载体 |
| 3.2.2 复制缺陷型载体 |
| 3.3 重组腺病毒载体的构建方法 |
| 3.3.1 双质粒共转染法 |
| 3.3.2 Ad-Easy重组法 |
| 3.3.3 Ad-Max双质粒共转染法 |
| 3.4 腺病毒载体的应用 |
| 4 2A肽的概况 |
| 5 传染性造血器官坏死病-传染性胰腺坏死病二联重组腺病毒疫苗的研究展望 |
| 第二章 传染性造血器官坏死病病毒、传染性胰腺坏死病病毒的分离与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、细菌菌株、细胞和试剂 |
| 1.2 主要仪器和设备 |
| 1.3 IHNV的分离与鉴定 |
| 1.3.1 病料的处理 |
| 1.3.2 EPC细胞的复苏及传代 |
| 1.3.3 病毒的分离和培养 |
| 1.3.4 IHNV滴度的测定 |
| 1.3.5 IHNV总 RNA的提取 |
| 1.3.6 IHNV G基因的扩增 |
| 1.3.7 IHNV G基因与T载体的连接 |
| 1.3.8 连接产物的转化 |
| 1.3.9 质粒的提取 |
| 1.4 IPNV的分离与鉴定 |
| 1.4.1 病料的处理 |
| 1.4.2 病毒的分离、培养 |
| 1.4.3 IPNV滴度的测定 |
| 1.4.4 IPNV总 RNA的提取 |
| 1.4.5 IPNV VP2 基因的扩增 |
| 1.4.6 VP2 基因与载体的连接 |
| 1.4.7 连接产物的转化 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 IHNV的分离与鉴定结果 |
| 2.1.1 病毒驯化时在EPC细胞上的病变 |
| 2.1.2 病毒在EPC细胞的病变 |
| 2.1.3 IHNV滴度的测定 |
| 2.1.4 IHNV G基因的扩增和酶切结果 |
| 2.1.5 IHNV G基因的同源性分析 |
| 2.2 IPNV的分离与鉴定结果 |
| 2.2.1 病毒驯化时在EPC细胞上的病变 |
| 2.2.2 病毒在EPC细胞的病变 |
| 2.2.3 IPNV滴度的测定 |
| 2.2.4 IPNV VP2 基因的扩增和酶切结果 |
| 2.2.5 IPNV VP2 基因的同源性分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 传染性造血器官坏死病-传染性胰腺坏死病重组腺病毒载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 技术路线见图3-1 |
| 1.2 质粒、细菌菌株和试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 IHNV G基因、F2A基因和IPNV VP2 基因的扩增 |
| 1.4.1 IHNV G基因的扩增 |
| 1.4.2 F2A肽的扩增 |
| 1.4.3 IPNV VP2 基因的扩增 |
| 1.5 G基因、F2A肽基因和VP2 基因与p Ad-Track-CMV载体的快速连接 |
| 1.6 重组 p Ad-Track-CMV载体与p Ad-Easy-1 骨架载体的同源重组 |
| 1.6.1 电转化感受态细胞的制备 |
| 1.6.2 乙醇沉淀法进行大片段DNA回收 |
| 1.6.3 穿梭载体与骨架载体的同源重组 |
| 1.7 重组腺病毒质粒转染HEK-293 细胞 |
| 1.8 重组腺病毒抗原蛋白的Western-blot检测试验 |
| 1.8.1 重组腺病毒VP2 蛋白表达的Western-blot试验 |
| 1.8.2 重组腺病毒G蛋白表达的Western-blot试验 |
| 1.9 重组腺病毒滴度的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 IHNV G基因和IPNV VP2 基因的扩增结果 |
| 2.1.1 IHNV G基因的扩增结果 |
| 2.1.2 IPNV VP2 基因的扩增结果 |
| 2.2 重组腺病毒构建的结果分析 |
| 2.3 重组腺病毒G基因和VP2 基因的表达鉴定 |
| 2.4 重组腺病毒滴度的测定 |
| 3 讨论 |
| 第四章 传染性造血器官坏死病-传染性胰腺坏死病活载体疫苗的生物学评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒与实验动物 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 实验动物饲养条件 |
| 1.5 活载体疫苗的临床安全性评价 |
| 1.5.1 小白鼠的临床安全性试验 |
| 1.5.2 本动物的临床安全性试验 |
| 1.6 疫苗最佳使用剂量的确定试验 |
| 1.7 免疫试验 |
| 1.8 样品的处理 |
| 1.9 通过两步法定量逆转录PCR(q RT-PCR)测定基因的表达水平 |
| 1.10 病毒感染试验 |
| 1.10.1 IHNV感染试验 |
| 1.10.2 IPNV感染试验 |
| 1.11 抗体中和试验检测 |
| 1.11.1 抗IHNV血清抗体中和试验的检测 |
| 1.11.2 抗IPNV血清抗体中和试验的检测 |
| 1.12 结果统计分析方法 |
| 1.13 活载体疫苗的免疫持续期试验 |
| 1.14 活载体疫苗的保存期试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 活载体疫苗的临床安全性评价结果 |
| 2.1.1 小白鼠的临床安全性试验结果 |
| 2.1.2 虹鳟的临床安全性试验结果 |
| 2.2 疫苗最佳使用剂量的确定 |
| 2.3 活载体疫苗免疫后对IHNV G基因、IPNV VP2 基因、IFN-1、IFN诱导的基因、TLRs受体、CD4、CD8、Ig M和 Ig T基因表达的影响 |
| 2.4 病毒感染试验结果 |
| 2.4.1 IHNV感染试验结果 |
| 2.4.2 IPNV感染试验结果 |
| 2.5 血清抗体中和试验结果 |
| 2.5.1 抗IHNV血清抗体的检测 |
| 2.5.2 抗IPNV血清抗体的检测 |
| 2.6 活载体疫苗的免疫持续期试验结果 |
| 2.7 活载体疫苗的保存期试验 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介1 |
| 导师简介2 |
（2）shRNA沉默AFAP1L1基因对肺腺癌细胞增殖影响的体内外研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、AFAP1L1 在 NSCLC 中的表达及临床意义 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 主要仪器和试剂 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 AFAP1L1在NSCLC组和正常肺组织组中的表达 |
| 1.2.2 AFAP1L1 表达与 NSCLC 患者临床病理特征及病理分期的关系 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、shRNA 沉默 AFAP1L1 对肺癌细胞功能影响的体外研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 AFAP1L1基因在肺癌细胞系中的表达 |
| 2.2.2 shRNA靶点设计和AFAP1L1 基因慢病毒载体构建 |
| 2.2.3 RT-PCT检测AFAP1L1 m RNA表达 |
| 2.2.4 Western Blot检测AFAP1L1 的蛋白表达 |
| 2.2.5 shRNA沉默AFAP1L1 导致A549 细胞增殖降低 |
| 2.2.6 shRNA沉默AFAP1L1 抑制A549 细胞周期进程 |
| 2.2.7 shRNA沉默AFAP1L1 促进A549 细胞凋亡 |
| 2.2.8 shRNA沉默AFAP1L1对A549 细胞侵袭能力的影响 |
| 2.2.9 Path Scan细胞内信号转导阵列分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 AFAP1L1的结构与功能 |
| 2.3.2 RNA干扰及对AFAP1L1 基因的沉默作用 |
| 2.3.3 慢病毒载体介导的 RNA 干扰 AFAP1L1 表达对肺癌细胞 A549 生物学功能的影响 |
| 2.3.4 AFAP1L1抑制肿瘤生长的作用机制探讨 |
| 2.4 小结 |
| 三、AFAP1L1抑制肺腺癌细胞生长的体内试验研究 |
| 3.1 对象及方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 慢病毒转染A549细胞 |
| 3.2.2 MTT 检验细胞增殖能力 |
| 3.2.3 移植瘤的生长情况及活体成像情况 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 裸鼠移植瘤模型的建立 |
| 3.3.2 慢病毒载体及其介导的RNA干扰应用 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 APAP家族:结构、功能及在肿瘤中的作用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）结核分枝杆菌抗原致骨髓造血细胞增殖分化异常实验研究暨烯醇化酶-1单克隆抗体制备与作用初步研究（论文提纲范文）
| 缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 结核分枝杆菌抗原持续刺激致骨髓造血细胞增殖分化异常实验研究 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 结核病与免疫耗竭 |
| 1.1.2 T细胞免疫耗竭 |
| 1.1.3 骨髓造血干细胞及其增殖分化调节 |
| 1.1.4 分枝杆菌感染可影响造血干细胞的分化 |
| 1.1.5 造血干细胞功能障碍与T细胞耗竭 |
| 1.1.6 选题思路 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验材料和仪器 |
| 1.2.2 实验对象 |
| 1.2.3 实验方法 |
| 1.2.3.1 BCG的培养 |
| 1.2.3.2 SDS-PAGE蛋白电泳相关试剂配制及方法 |
| 1.2.3.3 蛋白抗原制备 |
| 1.2.3.4 结核分枝杆菌抗原持续刺激致骨髓造血细胞增殖分化异常模型的建立 |
| 1.2.3.5 IL-2对骨髓造血细胞增殖分化异常的干预治疗 |
| 1.2.4 统计学分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 BCG的培养 |
| 1.3.2 蛋白抗原的制备 |
| 1.3.3 结核分枝杆菌抗原持续刺激致骨髓造血细胞增殖分化异常模型的检测结果 |
| 1.3.3.1 结核分枝杆菌抗原持续刺激致脾脏抗原特异性CD4~+T细胞分泌IFN-γ水平降低 |
| 1.3.3.2 结核分枝杆菌抗原持续刺激致TB10.4 _(4-12)特异性的记忆性CD8~+T细胞数量减少 |
| 1.3.3.3 结核分枝杆菌抗原持续刺激致骨髓LK细胞增殖能力下降 |
| 1.3.4 IL-2对骨髓造血细胞增殖分化异常的治疗作用 |
| 1.3.4.1 IL-2治疗使脾脏抗原特异性CD4~+ T细胞分泌IFN-γ水平升高 |
| 1.3.4.2 IL-2治疗使TB10.4 _(4-12)特异性的CD8~+记忆性T细胞数量增加 |
| 1.3.4.3 IL-2治疗后骨髓LK细胞的增殖能力回升 |
| 1.3.4.4 结核分枝杆菌抗原持续刺激和IL-2治疗后,骨髓造血细胞转录因子的变化 |
| 1.3.4.5 结核分枝杆菌抗原持续刺激和IL-2治疗后,骨髓造血微环境中细胞因子的变化 |
| 1.3.4.6 结核分枝杆菌抗原持续刺激和IL-2治疗后,JAK3和STAT5的表达上调 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 应用结核分枝杆菌抗原持续刺激模拟结核分枝杆菌感染引起的免疫病理损伤 |
| 1.4.2 骨髓造血细胞的表型鉴定 |
| 1.4.3 骨髓造血细胞与T细胞互相作用 |
| 1.4.4 结核分枝杆菌抗原持续刺激对细胞因子IFN-γ和IL-2分泌的影响 |
| 1.4.5 IFN-γ对骨髓造血干细胞的调节作用 |
| 1.4.6 IL-2对骨髓造血干细胞的调节作用 |
| 1.4.7 不同结核分枝杆菌抗原诱导T细胞耗竭的能力不同 |
| 1.4.8 骨髓造血细胞增殖分化异常与T细胞耗竭的关系 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 粟粒性肺结核的临床病例分析和BCG感染诱导骨髓造血细胞增殖分化异常实验研究 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.1.1 粟粒性肺结核与骨髓造血功能障碍 |
| 2.1.2 分枝杆菌感染与造血干细胞分化 |
| 2.1.3 细胞因子网络对造血干细胞增殖分化的调节作用 |
| 2.1.4 选题思路 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料和仪器 |
| 2.2.2 实验对象 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.3.1 BCG感染动物模型的建立 |
| 2.2.3.2 IL-2对大剂量BCG入血感染小鼠的干预治疗 |
| 2.2.4 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 病例分析 |
| 2.3.2 BCG感染动物模型免疫检测结果 |
| 2.3.2.1 大剂量BCG入血感染致白细胞、淋巴细胞和血小板减少 |
| 2.3.2.2 大剂量BCG入血感染致小鼠脾脏、肺脏和肝脏肿大 |
| 2.3.2.3 大剂量BCG滴鼻感染致脾脏CD4~+T细胞表面高表达PD-1 |
| 2.3.2.4 大剂量BCG入血感染致脾脏CD8~+T细胞表面高表达PD-1 |
| 2.3.2.5 大剂量BCG滴鼻感染致脾脏CD4~+T细胞增殖能力增强 |
| 2.3.2.6 大剂量BCG入血感染致脾脏CD8~+T细胞增殖能力降低 |
| 2.3.2.7 BCG感染对外周血血清中IFN-γ的影响 |
| 2.3.2.8 BCG感染对脾脏T细胞分泌细胞因子的影响 |
| 2.3.2.9 BCG感染对骨髓LK细胞增殖能力的影响 |
| 2.3.2.10 BCG感染对骨髓造血微环境中细胞因子水平的影响 |
| 2.3.2.11 BCG感染对骨髓LK细胞转录因子表达的影响 |
| 2.3.3 IL-2治疗大剂量BCG入血感染动物模型的效果评价 |
| 2.3.3.1 IL-2治疗可降低脾脏CD8~+T细胞PD-1的表达 |
| 2.3.3.2 IL-2治疗可增强脾脏T细胞的增殖能力 |
| 2.3.3.3 IL-2治疗可部分逆转骨髓LK细胞的增殖能力 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 临床粟粒性肺结核的血液学变化 |
| 2.4.2 BCG感染途径和剂量对T细胞及骨髓造血功能的影响 |
| 2.4.3 BCG感染模型与临床粟粒性肺结核感染 |
| 2.4.4 BCG感染后骨髓造血微环境细胞因子的变化与骨髓造血细胞增殖分化异常 |
| 2.4.5 BCG感染后骨髓造血细胞增殖能力改变 |
| 2.4.6 后续研究计划 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 糖酵解酶ENO1单克隆抗体制备及其作用初步研究 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.1.1 糖代谢 |
| 3.1.2 烯醇化酶1(ENO1)与糖代谢 |
| 3.1.3 ENO1与肿瘤 |
| 3.1.4 ENO1与宫颈癌 |
| 3.1.5 单克隆抗体的制备 |
| 3.1.6 腺相关病毒(AAV) |
| 3.1.7 选题思路 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料和仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 重组质粒pcDNA3.1-ENO1的构建 |
| 3.2.2.2 PcDNA3.1-ENO1在HEK-293T细胞中的表达和纯化 |
| 3.2.2.3 PcDNA3.1-ENO1转染CHO-K1细胞 |
| 3.2.2.4 PFastBac1-ENO1的构建 |
| 3.2.2.5 ENO1蛋白的表达和纯化 |
| 3.2.2.6 ENO单克隆抗体制备 |
| 3.2.2.7 ENO1单克隆抗体对宫颈癌细胞迁移侵袭能力的抑制作用 |
| 3.2.2.8 杂交瘤细胞RNA提取 |
| 3.2.2.9 ENO1单克隆抗体可变区基因测序 |
| 3.2.2.10 腺相关病毒载体包装ENO1单抗可变区基因 |
| 3.2.3 统计学处理 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 重组质粒pcDNA3.1-ENO1的构建 |
| 3.3.2 PcDNA3.1-ENO1在HEK-293T细胞中的表达和纯化 |
| 3.3.3 PcDNA3.1-ENO1转染CHO-K1细胞 |
| 3.3.4 ENO1基因在杆状病毒表达载体中的克隆、表达和纯化 |
| 3.3.5 ENO1单克隆抗体的制备 |
| 3.3.6 ENO1单克隆抗体对宫颈癌细胞迁移侵袭能力的抑制作用 |
| 3.3.7 ENO1单克隆抗体单克隆抗体可变区基因测序 |
| 3.3.8 腺相关病毒包装ENO1单克隆抗体可变区基因 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 真核表达系统的选择 |
| 3.4.2 单克隆抗体的制备及测序 |
| 3.4.3 ENO1单克隆抗体对宫颈癌细胞迁移侵袭能力的抑制作用 |
| 3.4.4 腺相关病毒载体的应用 |
| 3.4.5 后续研究计划 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成果 |
| 致谢 |
（4）miR-5003调节ETS1-3’UTR促进SLE患者B细胞分化的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 高通量测序分析 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论及小结 |
| 第二部分 SLE患者淋巴细胞ETS1及其SNP检测 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论及小结 |
| 第三部分 SNP通过ETS1影响B细胞的分化 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论及小结 |
| 第四部分 miR-5003影响ETS1突变位点的功能 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论及小结 |
| 全文总结 |
| 局限性 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 ETS1在狼疮B细胞和Th细胞中作用机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）CAR-T细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点（论文提纲范文）
| 一引言 |
| 二适用范围 |
| 1本技术要点适用于哪类CAR-T细胞产品? |
| 2本技术要点包括哪些内容? |
| 3本技术考虑要点的基本原则是什么? |
| 三原材料和辅料及其质量控制 |
| 1 CAR-T细胞产品的原材料和辅料通常都要考虑哪些因素? |
| 2转导/转染T细胞的病毒载体/质粒载体是否可按照原材料管理? |
| 3如何进行原材料和辅料的选择和风险控制? |
| 4在载体物质或CAR-T细胞终产品中是否需要进行原材料残留的质量检测? |
| 四病毒转导载体及质粒转染载体制备及质量控制 |
| 1转导或转染载体制备的起始原材料包括哪些或如何定义转染载体的起始原材料? |
| 2起始原材料要建立种子库系统吗? |
| 3如何建立种子库系统?如何确定各级种子库的代次及数量? |
| 4种子库的质量要求是什么?如何管理种子库? |
| 5如何考虑质粒载体的生产工艺及规模?质粒载体的质量控制包括哪些? |
| 6病毒载体的生产规模要设计多大?是否可以采用细胞培养皿进行病毒载体的培养?关键工艺研究包括哪些?病毒载体制备过程中如何降低牛血清的风险? |
| 7是否要进行病毒载体生产终末细胞的检定? |
| 8如何开展病毒载体中的外源因子污染的检测? |
| 9病毒载体是否要纯化?纯化及浓缩工艺应考虑哪些因素?纯化的病毒载体如何保存? |
| 10纯化后的病毒载体的质量控制检测需要考虑哪些参数? |
| 11采用何种方法进行病毒载体的滴度测定?是否需要规定病毒载体的比活性? |
| 12采用何种方法进行RCR/RCL检测? |
| 13如何考虑病毒载体工艺杂质质量控制的要求? |
| 14是否要开展病毒载体的稳定性研究以及如何设定稳定性评价参数? |
| 15转导载体是否允许外包加工?如何控制外包加工的转导载体的质量? |
| 五建立可提供T细胞的供体资质标准 |
| 1选择T细胞供体的基本考虑是什么? |
| 2细胞供体 (者) 应进行哪些传染性疾病因子的检测?应采用何种方法检测? |
| 3自体细胞供体是否必须要进行传染性疾病因子筛查和检测? |
| 4如使用可建系的细胞制备CAR-T细胞, 如何评估其供体及细胞的风险? |
| 5在临床试验过程中如何进一步开展供体资质的研究? |
| 六CAR-T细胞产品的生产、质量控制研究及检测 |
| 1 CAR-T细胞产品的生产工艺研究应考虑哪些因素? |
| 2如何定义CAR-T细胞的批次及批量? |
| 3 CAR-T细胞产品的质量控制研究及检测至少应包括哪些项目?应如何设置这些质控项目更符合CAR-T细胞产品的特点? |
| 4选择或建立质量控制检测方法时应考虑哪些因素?如何制定其每一检测项目的质量标准? |
| 6是否要开展CAR-T细胞稳定性研究? |
| 七CAR-T细胞的非临床研究 |
| 1非临床研究的一般原则 |
| 2 CAR-T细胞产品的药效学研究 |
| 3 CAR-T细胞产品的药代动力学 (药代) 研究 |
| 4 CAR-T细胞产品的非临床安全性研究 |
| 结束语 |
| 提出意见及建议的单位: |
（6）HO-1基因转染对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词简表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 正文 HO-1 基因转染对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的实验研究 |
| 前言 |
| 第一部分 HO-1 腺病毒载体的构建及鉴定 |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 第一节 重组穿梭质粒pAdTrackCMV/HO-1 的构建与鉴定 |
| 材料 |
| 方法 |
| 第二节 重组腺病毒质粒pAdEasy-1/HO-1 的构建与鉴定 |
| 材料 |
| 方法 |
| 第三节 重组腺病毒载体pAdCMV/HO-1 的构建与鉴定 |
| 材料 |
| 方法 |
| 第四节 重组腺病毒载体pAdCMV/HO-1 的扩增与滴度测定 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第一部分照片 |
| 第二部分 HO-1 基因转染对大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用 |
| 前言 |
| 分题一 乳鼠原代心肌细胞的培养与鉴定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 分题二 体外培养的心肌细胞HO-1 基因转染 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 分题三 HO-1 基因转染对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分照片 |
| 第三部分 HO-1 基因转染对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分照片 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 血红素氧合酶-1 抗心肌缺血再灌注损伤的研究现状 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 基因治疗心肌缺血再灌注损伤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表的论文 |
| 英文论着 |
（7）携带HBB基因shRNA的人脐血CD34+细胞构建及其应用基础研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 正文 携带 HBB 基因 shRNA 的人脐血 CD34~+细胞构建及其应用基础研究shRNA |
| 前言 |
| 第一部分 HBB 基因 RNAi-LV 载体的构建、筛选和慢病毒包装 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 人 CD34~+细胞的分离培养及 RNAi 转染及效果观察 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 携带 HBB-RNAi 基因的人脐血 CD34~+细胞在 SCID新生鼠移植后的再殖情况 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 造血干细胞基因转染研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 β-地中海贫血和镰形细胞病基因治疗进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表论文情况 |
| 英文论着 |
（8）Mdr1在肿瘤化疗中疗效及骨髓保护的实验研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 正文：MDR1 在肿瘤化疗中疗效及骨髓保护的实验研究 |
| 前言 |
| 第一部分 多药耐药基因1（MDR1）的克隆及构建表达MDR1 的重组腺病毒 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第二部分 多药耐药（MDR1）基因转染C57 和BALB/C 小鼠骨髓单个核细胞的体外实验研究 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第三部分 MDR1基因转染骨髓移植联合超剂量化疗治疗LEWIS肺癌和4T1 乳腺癌小鼠的研究 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 全文小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（9）猪水疱病和猪瘟基因工程亚单位疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 猪水疱病及猪水疱病病毒研究进展 |
| 1.1 猪水疱病研究进展 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 猪水疱病的流行病学 |
| 1.1.3 猪水疱病的临床症状和发病机理 |
| 1.1.4 诊断 |
| 1.1.5 猪水疱病的防控策略 |
| 1.2 猪水疱病病毒研究进展 |
| 1.2.1 猪水疱病病毒的形态及理化特性 |
| 1.2.2 SVDV 基因组结构 |
| 1.2.3 SVDV 编码的蛋白及其功能 |
| 1.2.3.1 结构蛋白 |
| 1.2.3.2 非结构蛋白 |
| 1.3 猪水疱病疫苗研究进展 |
| 1.3.1 弱毒疫苗 |
| 1.3.2 抗独特型抗体疫苗 |
| 1.3.3 基因工程疫苗 |
| 1.3.3.1 基因缺失毒力致弱疫苗 |
| 1.3.3.2 亚单位疫苗 |
| 1.3.3.3 基因工程活载体疫苗 |
| 1.3.4 合成肽疫苗 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 猪瘟及猪瘟病毒研究进展 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 CSFV 的病原学及生物学特性 |
| 2.2.1 CSFV 的病原学 |
| 2.2.1.1 CSFV 病毒粒子结构 |
| 2.2.1.2 CSFV 的理化特性 |
| 2.2.2 CSFV 生物学特性研究进展 |
| 2.2.2.1 抗原性 |
| 2.2.2.2 病原性及病理特性 |
| 2.2.2.3 遗传特性 |
| 2.3 CSFV 致病机制的研究 |
| 2.3.1 CSFV 的免疫病理学 |
| 2.3.2 CSFV 在体内的复制过程 |
| 2.3.3 猪瘟病毒对体外培养细胞的影响 |
| 2.4 CSFV 的分子免疫学 |
| 2.5 猪瘟防制策略与防制新技术的研究进展 |
| 2.6 结束语 |
| 第三章 逆转录病毒载体系统的研究 |
| 3.1 逆转录病毒表达系统 |
| 3.1.1 逆转录病毒表达载体 |
| 3.1.1.1 辅助病毒互补的逆转录病毒质粒载体 |
| 3.1.1.2 不需要辅助病毒互补的逆转录病毒载体 |
| 3.1.1.3 广寄主的逆转录病毒载体 |
| 3.1.1.4 逆转录病毒表达载体 |
| 3.1.2 包装细胞系 |
| 3.1.3 水疱性口炎病毒载体 |
| 3.2 逆转录病毒表达系统基本原理 |
| 3.3 逆转录病毒载体的构建与应用 |
| 3.4 影响逆转录病毒载体表达效率的影响因素 |
| 3.5 逆转录病毒表达系统在基因治疗及表达研究中的应用 |
| 3.5.1 逆转录病毒载体系统在基因治疗中的应用 |
| 3.5.2 逆转录病毒载体在基因表达反面的应用 |
| 3.6 逆转录病毒载体系统的缺陷 |
| 3.7 小结 |
| 试验研究 |
| 第四章 猪水疱病亚单位标记疫苗的构建及体外表达 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 质粒载体、工程菌及主要试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 细胞及种毒 |
| 4.1.4 引物的设计与合成 |
| 4.1.5 目的基因的获取 |
| 4.1.6 重组质粒的构建、克隆及鉴定 |
| 4.1.6.1 构建策略 |
| 4.1.6.2 重组质粒的构建即克隆方法 |
| 4.1.6.2.1 大肠杆菌JM109 感受态的制备 |
| 4.1.6.2.2 PCR 产物及载体质粒的酶切、回收及连接 |
| 4.1.6.2.3 连接产物的转化 |
| 4.1.6.2.4 重组质粒的制备 |
| 4.1.6.2.5 重组质粒的鉴定 |
| 4.1.6.3 重组SCDV HK/70 P1 基因的逆转录病毒载体的构建 |
| 4.1.6.4 重组质粒的测序 |
| 4.1.7 体外转染质粒的制备 |
| 4.1.8 转染包装细胞GP2-293 |
| 4.1.9 重组假型病毒的收获 |
| 4.1.10 病毒滴度的检测 |
| 4.1.11 假型重组逆转录病毒感染PK15 细胞 |
| 4.1.12 P1 基因体外表达的检测 |
| 4.1.12.1 P1 基因的PCR 整合鉴定 |
| 4.1.12.2 间接免疫荧光检测P1 基因的表达 |
| 4.1.12.3 P1 基因在PK15 细胞中的稳定性鉴定 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 SVDV HK/70 P1 基因的PCR 扩增结果 |
| 4.2.2 重组质粒pBABE puro-P1 的鉴定结果 |
| 4.2.3 假型病毒感染PK15 细胞后PCR 鉴定P1 基因的整合结果 |
| 4.2.4 免疫荧光检测PK15 细胞中P1 基因的表达 |
| 4.2.5 P1 基因的稳定性整合鉴定结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 猪水疱病亚单位疫苗的豚鼠免疫实验 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 免疫原与实验动物 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 免疫用抗原的制备 |
| 5.1.4 重组抗原对豚鼠的免疫程序 |
| 5.1.5 T 淋巴细胞增殖实验 |
| 5.1.5.1 各种溶液的配制 |
| 5.1.5.2 淋巴细胞的分离方法 |
| 5.1.5.3 淋巴细胞的增殖实验 |
| 5.1.6 双夹心ELISA 检测免疫豚鼠的SVDV 特异性抗体 |
| 5.1.7 SVDV HK/70 的复壮及半数细胞感染剂量(TCID50)的测定 |
| 5.1.8 细胞中和实验测定豚鼠血清SVDV 抗体效价 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 T 淋巴细胞增殖实验 |
| 5.2.2 免疫豚鼠SVDV 特异性抗体的动态变化 |
| 5.2.3 SVDV 半数感染剂量的测定结果 |
| 5.2.4 细胞中和实验测定豚鼠中和抗体 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 猪瘟亚单位疫苗的构建及体外表达 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 质粒载体、工程菌及主要试剂 |
| 6.1.2 主要仪器 |
| 6.1.3 细胞 |
| 6.1.4 引物的设计与合成 |
| 6.1.5 目的基因的获取 |
| 6.1.6 重组质粒的构建、克隆及鉴定 |
| 6.1.6.1 构建策略 |
| 6.1.6.2 重组质粒的构建及克隆的基本方法 |
| 6.1.6.2.1 大肠杆菌JM109 感受态的制备 |
| 6.1.6.2.2 PCR 产物及载体质粒的酶切、回收及连接 |
| 6.1.6.2.3 连接产物的转化 |
| 6.1.6.2.4 重组质粒的制备 |
| 6.1.6.2.5 重组质粒的鉴定 |
| 6.1.6.3 重组CSFV Shimen E2 基因的逆转录病毒载体的构建 |
| 6.1.6.4 重组质粒的测序 |
| 6.1.7 体外转染质粒的制备 |
| 6.1.8 转染包装细胞GP2-293 |
| 6.1.9 重组假型病毒的收获 |
| 6.1.10 病毒滴度的检测 |
| 6.1.11 假型重组逆转录病毒感染PK15 细胞 |
| 6.1.12 E2 基因体外表达的检测 |
| 6.1.12.1 E2 基因的PCR 整合鉴定 |
| 6.1.12.2 间接免疫荧光检测E2 基因的表达 |
| 6.1.12.3 夹心 ELISA 检测 E2 蛋白的活性 |
| 6.1.12.4 E2 基因在PK15 细胞中的稳定性整合鉴定 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 CSFV Shimen E2 基因的PCR 扩增结果 |
| 6.2.2 重组质粒pBABE puro-E2 的鉴定结果 |
| 6.2.3 假型病毒感染PK15 细胞后PCR 鉴定E2 基因的整合结果 |
| 6.2.4 E2 基因的稳定性整合鉴定结果 |
| 6.2.5 免疫荧光检测PK15 细胞中E2 基因的表达 |
| 6.2.6 ELISA 检测细胞培养物中E2 蛋白的生物学活性 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 猪瘟亚单位疫苗的兔免疫保护实验 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 主要试剂 |
| 7.1.2 免疫用的抗原的制备 |
| 7.1.3 重组抗原对家兔的免疫实验 |
| 7.1.4 T 淋巴细胞增殖实验 |
| 7.1.4.1 各种溶液的配制 |
| 7.1.4.2 淋巴细胞的分离方法 |
| 7.1.4.3 T 淋巴细胞增殖实验 |
| 7.1.5 阻断ELISA 检测免疫家兔的CSFV 特异性抗体 |
| 7.1.6 实验兔子的病毒攻击保护实验 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 T 淋巴细胞增殖情况 |
| 7.2.2 免疫兔子CSFV 特异性抗体的动态变化 |
| 7.2.3 攻毒兔子的免疫保护实验结果 |
| 7.2.3.1 兔子体温变化 |
| 7.2.3.2 攻毒兔子脾脏变化 |
| 7.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）静脉注射用治疗基因靶向传递系统的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 绪论 |
| 第二章 质粒DNA的扩增和提取纯化 |
| 1. 仪器与试药 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 质粒DNA的扩增 |
| 2.2 质粒DNA的提取和纯化 |
| 2.3 质粒DNA的产量 |
| 2.4 质粒DNA的纯度分析 |
| 3. 讨论 |
| 第三章 脂质-聚阳离子-DNA复合物制备工艺的研究 |
| 第一节 DNA含量测定方法的建立 |
| 1. 仪器与试剂 |
| 2. 方法与结果 |
| 2.1 Hoechst 33258溶液的配制 |
| 2.2 荧光扫描 |
| 2.3 狭缝选择 |
| 2.4 标准曲线的绘制 |
| 2.5 LPD的回收率实验 |
| 2.6 LPD的重现性试验 |
| 3. 讨论 |
| 第二节 阳离子LPD的制备及其理化性质 |
| 1. 仪器与试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 阳离子型LPD的制备 |
| 2.2 阳离子型LPD的理化性质 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 聚阳离子-DNA复合物的形成 |
| 3.2 LPD的形态粒径和Zeta电位 |
| 3.3 LPD的形态 |
| 3.4 LPD的包封率 |
| 3.5 LPD的抗核酸酶能力 |
| 4. 讨论 |
| 第三节 中心组合设计优化LPD的处方 |
| 1. 仪器于试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 阴离子型LPD的制备 |
| 2.2 LPD的粒径和Zeta电位的测定 |
| 2.3 LPD的抗核酸酶能力的定量评价 |
| 2.4 确定实验范围 |
| 2.5 中心组合设计 |
| 2.6 数据处理 |
| 3. 结果和讨论 |
| 3.1 因素水平范围的确定 |
| 3.2 中心组合设计的试验结果 |
| 3.3 处方成分对LPD粒径的影响 |
| 3.4 处方成分对LPD抗核酸酶能力的影响 |
| 3.5 LPD的处方优化 |
| 第四章 脂质-聚阳离子-DNA复合物的体外细胞学实验 |
| 1. 仪器与试药 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞复苏 |
| 2.2 细胞传代 |
| 2.3 细胞转染 |
| 2.4 转染率的测定 |
| 2.5 X-Gal染色 |
| 2.6 目的基因IL-12的检测 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 处方优化 |
| 3.2 转染率的比较 |
| 3.3 目的蛋白的表达 |
| 4. 讨论 |
| 第五章 阳离子LPD冻干针剂的研究 |
| 1. 仪器与试剂 |
| 2. 方法与结果 |
| 2.1 LPD冻干针剂处方与工艺研究 |
| 2.2 LPD冻干针剂质量评价 |
| 3. 结论与讨论 |
| 3.1 冻干后的LPD的基本特征 |
| 3.2 冻干保护剂的作用 |
| 3.3 冻干LPD针剂中DNA的完整性和抗核酸酶能力 |
| 第六章 阳离子LPD冻干针剂在小鼠体内的靶向性和药效学初步研究 |
| 第一节 阳离子LPD冻干针剂在小鼠体内靶向性的初步研究 |
| 1. 仪器与试药 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 给药 |
| 2.2 取材 |
| 2.3 固定和包埋 |
| 2.4 冰冻切片 |
| 2.S X-Gal染色 |
| 2.6 复染和封片 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 第二节 pORFmIL-12阳离子冻干针剂治疗小鼠肺癌的药效学初步研究 |
| 1. 仪器与试药 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 荷瘤动物模型建立 |
| 2.2 给药 |
| 2.3 肿瘤大小测定与生存期计算 |
| 2.4 血清和组织样品的收集和检测 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 受试品对小鼠肿瘤生长的影响 |
| 3.2 荷瘤小鼠的生存期 |
| 3.3 肿瘤中mIL-12浓度 |
| 3.4 血清中mIL-12浓度 |
| 3.5 肺中mIL-12浓度 |
| 4. 讨论 |
| 第三节 阳离子LPD(pORFmIL-12)冻干针剂抑瘤机制研究 |
| 1. 仪器与试药 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 动物模型的建立和分组给药 |
| 2.2 NK、CTL效应细胞制备 |
| 2.3 NK、CTL靶细胞制备污~(51)Cr4小时释放试验 |
| 2.4 结果计算 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 NK细胞杀伤活性 |
| 3.2 特异性CTL杀伤活性 |
| 4. 讨论 |
| 第七章 肝细胞靶向脂质-聚阳离子-DNA复合物的研究 |
| 第一节 胆固醇半乳糖衍生物的合成 |
| 1. 仪器与试药 |
| 2. 合成路线 |
| 3. 合成方法 |
| 第二节 半乳糖化的质粒脂质纳米粒的肝细胞靶向性研究 |
| 1. 仪器与试药 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 Gal-LPD的制备 |
| 2.2 Gal-LPD的细胞转染试验 |
| 2.3 Gal-LPD的细胞毒性试验 |
| 3. 结果与讨论 |
| 3.1 配体分子结构对Gal-LPD转染率的影响 |
| 3.2 带不同电荷的Gal-LPD的转染率比较 |
| 3.3 转染后不同的孵育时间对转染率的影响 |
| 3.4 不同的转染剂量对转染率的影响 |
| 3.5 细胞毒性实验 |
| 4. 小结 |
| 结论 |
| 综述 肿瘤基因治疗的载体系统 |
| 1. 病毒载体系统 |
| 2. 非病毒载体系统 |
| 3. 结语 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 声明 |
四、高滴度逆转录病毒载体4种转染方法对小鼠脾脏T细胞转染率的比较（论文参考文献）
- [1]虹鳟传染性造血器官坏死病-传染性胰腺坏死病二联活载体疫苗的研制[D]. 李守湖. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [2]shRNA沉默AFAP1L1基因对肺腺癌细胞增殖影响的体内外研究[D]. 王猛. 天津医科大学, 2020(06)
- [3]结核分枝杆菌抗原致骨髓造血细胞增殖分化异常实验研究暨烯醇化酶-1单克隆抗体制备与作用初步研究[D]. 李菲. 兰州大学, 2019
- [4]miR-5003调节ETS1-3’UTR促进SLE患者B细胞分化的机制研究[D]. 张瑞仙. 昆明医科大学, 2019
- [5]CAR-T细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点[J]. 孟淑芳,王佑春,吴雪伶,赵翔,黄维金,王斌,王萌,宋雪,贾芳英,霍艳,侯田田,黄瑛,文海若,李芊芊,屈哲,王歈,俞磊. 中国药事, 2018(06)
- [6]HO-1基因转染对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的实验研究[D]. 姜大春. 第三军医大学, 2009(05)
- [7]携带HBB基因shRNA的人脐血CD34+细胞构建及其应用基础研究[D]. 李玉艳. 第三军医大学, 2008(05)
- [8]Mdr1在肿瘤化疗中疗效及骨髓保护的实验研究[D]. 刘伟. 重庆医科大学, 2007(02)
- [9]猪水疱病和猪瘟基因工程亚单位疫苗的研究[D]. 田宏. 西北农林科技大学, 2006(05)
- [10]静脉注射用治疗基因靶向传递系统的研究[D]. 孙逊. 四川大学, 2005(02)