一、人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的体外分子进化（论文文献综述）
严浩[1]（2014）在《ICOSL分子的克隆表达及ICOSL核糖体单链抗体库的构建及筛选》文中指出本研究旨在通过运用核糖体展示技术,在鼠源性单链抗体库中筛选出抗ICOSL的特异性抗体,以期在减轻器官移植的排异反应方面能有更广阔的应用。第一,通过RT-PCR从人B淋巴瘤细胞Daudi的总RNA中扩增出ICOSL胞外区基因,并将此基因插入到原核表达载体pET28a中进行表达。第二,以表达纯化的ICOSL蛋白为抗原免疫Balb/c、鼠,每两周免疫一次,共免疫4次。免疫后,取小鼠脾脏提取总RNA,通过RT-PCR扩增小鼠的重链可变区和Linker （VH-linker）序列,以及轻链可变区和Linker （Vκ-linker）序列。经重组PCR将两段基因连接起来,将VH/κ与pMD19-T载体链接产物转化E. coli DH5a, PCR鉴定并测序。第三,通过核糖体展示技术,使抗ICOSL单链抗体库经过体外翻译,形成“单链抗体—核糖体—mRNA"三元复合物。并用BAFF-His蛋白进行负筛,再将ICOSL蛋白做抗原,进行3轮正筛,从而获得抗ICOSL的特异性单链抗体基因序列,并将此序列嵌入到PET43.1a表达载体中进行蛋白表达。最后,对表达出来的蛋白进行间接ELISA检测,从而筛选出高效表达目的蛋白的克隆菌株。将表达产物经镍柱纯化得到抗ICOSL单链抗体,并经Western blot检测其特异性。本研究以重组ICOSL胞外区蛋白为抗原构建抗ICOSL单链抗体库,并通过核糖体展示筛选获得单链抗体,经过特异性与活性的检测,我们成功的筛选得到了对ICOSL具有高亲和的单链抗体。为抗ICOSL单链抗体的人源化改造,并利用其治疗器官移植引起的急慢性排异反应奠定基础。
杨彬[2]（2011）在《工程化的人抗人IgE抗体的制备》文中指出目的：重组人IgE C3-C4抗原,获得其特异性的高亲和力工程化的人抗体及人源化的鼠单克隆抗体。方法：用PCR的方法获得人IgE C3-C4基因,与原核表达载体pET-19b连接得到表达质粒并在大肠杆菌BL21（DE3） star pLysS中大量表达并纯化。构建人免疫球蛋白G基因文库,并用重组的IgE C3-C4抗原借助克隆印记法对基因文库进行筛选以获得特异性的高亲和力抗体,然后用ELISA、Western blotting、Biacore及组胺释放抑制试验等方法检测其反应性,并对抗体进行链替换和点突变以寻求更高的亲和力；同时用重组的IgE C3-C4抗原免疫BALB/c小鼠,将其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞,通过小鼠腹腔注射的方法从腹水中获得大量鼠单克隆抗体,检测其反应性并初步进行鼠单克隆抗体的人源化。结果：成功制备了反应性好的重组人IgE C3-C4抗原,成功构建了非依赖性克隆滴度为9×107的人免疫球蛋白G基因文库；用克隆印记法从所构建的基因文库中筛选到一个特异性的抗IgE C3-C4的抗体,体外试验检测其反应性好；获得了一个链替换和三个点突变抗体,反应性与原始抗体相当；获得了5株对重组IgE C3-C4抗原特异性反应的杂交瘤细胞株,对其中2株分泌的单克隆抗体进行初步人源化。结论：利用重组的人IgE C3-C4抗原从人免疫球蛋白G基因文库中筛选到一个特异性抗体,反应性好；用杂交瘤的方法获得的鼠单克隆抗体反应性亦很好,均可进行进一步的体内外试验以开发其应用价值。目的：溶组织内阿米巴感染在发达国家和发展中国家中都会引起比较严重的疾病,为了对我国溶组织内阿米巴的感染的血清流行病学情况有大致了解,特进行此次调查。方法：提取溶组织内阿米巴HK9株滋养体的粗抗原；构建表达质粒pET-19b-Igl-C,并在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中对Igl-C（溶组织内阿米巴滋养体表面半乳糖／乙酰氨基半乳糖可抑制性凝集素中间亚单位的C末端,可用于血清学诊断）进行大量表达并纯化；随后使用这两种抗原,通过酶联免疫吸附试验（ELISA）对总共1312份血清样本进行检测,最后再根据统计数据建立logistic回归模型,起到总结和预测发病概率的作用。结果：提取了溶组织内阿米巴滋养体粗抗原并大量表达了Igl-C蛋白,使用这两种蛋白进行了ELISA检测。共检测1312份血清（男：678,女：634）,各省基于Igl-C检测的感染率为：北京：1.06%（2/188）,上海：3.85%（5/130）,四川：7.04%（10/142）,广西：3.17%（6/189）,贵州：14.39%（41/285）,青海：0.53%（1/190）,新疆：9.04%（17/188）。根据此结果得出logistic回归模型：结论：本调查是我国第一次关于溶组织内阿米巴在健康人群中的感染情况的血清流行病学调查,其结果与1988-1992年的第一次全国人体寄生虫病分布情况调查的结果一致；所得的logistic回归模型与数据贴合,并能根据血清样本的基本资料（性别、年龄、地域等）进行验前概率的推测。目的：对无经验的工作人员来说,仅从形态学鉴定螨类十分困难,本研究旨在使用一种简便易行的方法来鉴别常见无气门螨类。方法：先对螨类进行形态学鉴定以确定其种类,然后用CTAB裂解法抽取其基因组DNA;随后用PCR的方法扩增其内转录间隔区2（ITS2）和细胞色素氧化酶亚单位I（COI）基因,与测序载体连接后进行测序。经测序后先用ClustalX软件进行序列对齐,再用PHYLIP软件计算遗传距离,构建邻近型系统发生树,并用PAUP软件构建最大简约型系统发生树。结果：成功获得了6种螨（椭圆食粉螨Aleuroglyphus ovatus,热带无爪螨Blomia tropicalis,粉尘螨Dermatophagoides farina,户尘螨Dermatophagoides pteronyssinus,埋内欧尘螨Euroglyphus maynei,腐食酪螨Tyrophagus putrescentiae）的ITS2基因,长度从316bp到488bp不等,基于ITS2计算所得各种螨种内遗传距离为0.00-0.077844,种间遗传距离为0.202426-0.912959；成功获得5种螨（椭圆食粉螨Aleuroglyphus ovatus,热带无爪螨Blomia tropicalis,粉尘螨Dermatophagoides farina,户尘螨Dermatophagoides pteronyssinus,腐食酪螨Tyrophagus putrescentiae）的COI基因,长度为377bp或378bp,基于COI计算所得种内遗传距离为0.000--0.029748,种间遗传距离为0.138403-0.279304；利用ITS2和COI基因构建了分子进化树,可起到种类鉴别的作用。结论：在形态鉴别困难的情况下,ITS2基因和COI基因可作为分子标记用于鉴别无气门螨类。
陶俊[3]（2010）在《人源性抗FGF-2中和性抗体的筛选，表达及鉴定》文中指出目的和背景FGF-2又称为碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,FGF-2）,是成纤维生长因子家族的一员,最早由Gospodarowicz （1974）从牛脑垂体中提取的一种对BALB／C 3T3细胞等有明显促进生长作用的细胞因子。FGF-2有五种分子量,从18kD到34kD不等。所有的FGF-2异构体都缺乏信号肽,是通过一种现在还不十分清楚的机制分泌到细胞外的,其中18kD FGF-2在体内分布广泛,存在于中胚层及神经外胚层来源的细胞及多种肿瘤细胞中,对这些细胞有促增殖分化功能,参与了胚胎发育、血管生成、损伤修复、神经再生、肿瘤生长、组织纤维化等多项生理及病理过程。FGF-2的生物学效应,除对成纤维细胞和血管内皮细胞具有显着的促增殖作用外,还参与肿瘤发生和发展,特别对肿瘤的浸润和转移具有重要作用。有相当部分的肿瘤（如乳癌、结肠癌、甲状腺癌、肺癌、膀胱癌、食道癌等）存在FGF-2的高表达（表2）。已知其作用环节主要有（1）FGF-2能促进表皮、内皮细胞再生,促进血管内皮细胞分裂,诱导其从基膜中分离出来,以刺激内皮细胞向肿瘤组织趋化运动,并形成管状结构,还提高组织中血纤维蛋白溶解酶原激活因子类及诱导内皮细胞产生其他蛋白酶,从而促进毛细血管的形成；（2）FGF-2能促进多种生长因子的分泌,如VEGF、HGF、FGF-1等,这些因子相互调节,共同促进肿瘤的生长；（3）肿瘤细胞存在FGF-2受体的高表达,通常比正常细胞上FGF-2R高10倍以上,许多肿瘤细胞（如神经胶质瘤、横纹肌肉瘤、白血病、肺瘤、黑色素瘤、肝癌等）既表达FGF2又表达FGFRs,因此FGF2可直接作用于肿瘤细胞,使肿瘤织的各种蛋白酶及胶原酸分泌增加,从而加速肿瘤细胞的转移过程；（4）FGF-2还与肿瘤的耐药性有关,增强肿瘤对药物诱导的细胞凋亡的抵抗能力[20]。故FGF-2与肿瘤生长、转移、预后有着非常密切的关系。FGF-2与肿瘤肿瘤生长、转移、耐药有关,用抗体阻断FGF-2的活性被认为是一种治疗肿瘤的有效方法。已有多株抗FGF-2抗体体内外抑制肿瘤试验的报道。在多种动物体内,一株中和性的的单抗（GD2）能抑制FGF-2或肿瘤组织诱导的血管新生。在大鼠体内内GD2能抑制骨肉瘤的生长。另一株单抗,3H3,能抑制十二指肠溃疡的血管新生,从而延迟溃疡的愈合,同时它还能抑制一种转染的致瘤性细胞在裸鼠体内的生长。Aonuma等制备了两株中和性单抗,2G11和1E6,前者识别的是FGF-2的肝素结合位点,后者识别的是FGF-2与受体结合的位点,体内实验证实1E6能抑制肿瘤生长,而2G11不具备抗瘤作用。国内,谢庆祥等[7]通过建立裸鼠皮下移植膀胱癌动物模型进行研究,发现FGF-2抗体治疗组皮下瘤体积和重量比对照组均显着减少,瘤组织中增殖细胞核抗原（PCNA）指数和微血管密度（MVD）也显着降低,表明FGF-2抗体对膀胱癌的生长具有明显抑制作用,其主要通过抑制膀胱癌细胞增殖和减少肿瘤血管形成的途径而在荷瘤裸鼠体内发挥抗肿瘤作用。林卫等观察了FGF-2抗体对人卵巢癌细胞的增殖、卵巢癌腹腔移植瘤裸鼠的生存率和人卵巢癌移植瘤血管生成和肿瘤生长的影响。研究结果显示,FGF-2抗体能明显抑制卵巢癌细胞的增殖,卵巢癌的生长和血管生成,并呈浓度依赖性,提示FGF-2单抗有望成为卵巢癌生物治疗的新方法。本实验室前期制备了19株鼠抗FGF-2单抗,通过体外实验证实,其中三株抗体能够诱导B16细胞凋亡,近期的体内试验发现其中一株抗体能够明显抑制黑色素瘤的生长和转移,延长荷瘤小鼠的生存期,同时与化疗药物顺铂、紫杉醇等联合使用能够明显抑制黑色素癌的生长,而对于那些对化疗药物耐药的肿瘤抗FGF-2单抗能逆转其耐药性。这些报道证实在多种试验条件下,抗FGF-2抗体能阻断血管新生和抑制肿瘤生长。但这些抗体都是动物来源的抗体,用于人类疾病的治疗存在半衰期短、血清病发生率高、易在人体内产生抗体导致不能重复使用等弊。制备全人源性的抗FGF-2抗体,是克服上述弊端有效方法。人源性抗体的制备技术主要有三种,第一种是通过表面展示技术从人源性抗体库中筛选人源性抗体,第二种技术是通过免疫转入人免疫球蛋白基因的转基因鼠来获得针对特异抗原的人源性抗体,第三种技术是通过细胞分选技术,从某些病人骨髓细胞或外周血细胞中筛选特异性针对某种抗原的B细胞或记忆性B细胞,通过某些技术如与人骨髓瘤融合或用EB病毒使其永生化,使得这些B细胞能在体外无限繁殖,从而分泌人源性抗体。这三种技术中第二种技术需要购买或构建转基因小鼠,需要耗费大量财力和物力。第三种技术需要特殊病人的血细胞,并且需要获得人源性杂交瘤或刺激B细胞的永生化,这些技术目前还不成熟。表面展示技术具有极强的筛选功能,将序列互不相同的一组多样化的抗体表达到细菌,酵母,病毒表面,得到抗体展示库因此,利用其表型与基因型的统一以及易于扩增的特性,可很容易的从库中筛选出针对某种特异抗原的抗体。其中以噬菌体展示技术应用最为广泛。从噬菌体抗体库中直接筛选获得高亲和力抗体,其主要影响因素是抗体库容量大小和抗体基因的成熟度,其多样性要能保证有这种抗体存,并且在经过扩增后具有被筛选出来所要求的拷贝数,因此增加噬菌体抗体库的库容量尤其重要。根据已有报道,从大于109的大容量天然抗体库中,往往可以得到高亲和力的抗体,无需进行抗体亲和力成熟。本研究所用的抗体库为经过单载体细胞内重组法（Lxop-cre定位重组系统）两次重组配对后的人源性大容量抗体库,重组后库容约为6×1010,沉淀浓缩后滴度约为1013cfu／ml,具有良好的多样性,可以充分满足筛选的需要,在获得高亲和力抗体以及进行抗体性能改造方面具有较强的优势。在抗体的进化过程中,基因突变并不是随机发生于可变区内的,而是倾向性的集中在CDR区的某些位置,即突变热点,有多种类型,其中研究较详细的热点类型有AGY／RGYW和TAY（R=A／G,Y=C／T,W=A／T）。这些位点也常常是位于和抗原直接结合的区域中。针对这类位点引入突变,相较于这类位点之外的区域将更可能得到亲和力提高的基因工程抗体,而且可以通过构建小型的突变库来实现。Ho等研究发现,CDR区的突变热点分为胚系热点和非胚系热点,只有突变胚系热点才能提高抗体的亲和力。因此对抗体胚系热点进行突变将是本文采取的方法。方法1.利用固相筛选技术从大容量噬菌体抗体库（6×1010）中筛选能特异性结FGF-2的克隆,经过三到四轮的洗脱筛选,将得到的阳性克隆通过酶切鉴定,可变区多样性分析,基因测序和序列比对,确定能特异性结合FGF-2的序列正确的阳性克隆。2.将测序正确的阳性克隆的基因插入到原核表达载体pComb3XSS中,在低温培养条件下,利用IPTG诱导scFv基因的可溶性表达,离心后收集菌体,PBS重悬后超声破碎,收集破碎上清,通过SDS-PAGE, Western-blot, ELISA鉴定上清中抗体的特异性,通过竞争ELISA检测者几株scFv能否抑制FGF-2与其高亲和力受体FGFR1的结合。3.将能够抑制FGF-2与其高亲和力受体FGFR1的结合的44克隆通过重叠延伸PCR构建成全长的人源性抗FGF-2抗体,插入到真核表达载体pIGG中,构建成真和表达载体pIGG-44,利用转染试剂FuGene HD转染HEK293T细胞,进行真核可溶性表达,收集细胞培养上清,通过SDS-PAGE, Western-blot,ELISA鉴定上清中抗体的特异性,通过硫酸铵沉淀和蛋白G纯化抗体,通过夹心ELISA测定抗体的浓度。4.表达的全长的人源性抗体通过体外细胞实验验证抗体的中和FGF-2的活性,通过血管内皮细胞促增值实验,迁移实验和成管实验验证抗体对血管内皮细胞的作用,通过肿瘤细胞增殖抑制试验验证抗体对肿瘤细胞的增值抑制作用,通过Hoechst 33258染色观察抗体作用后肿瘤细胞细胞核的变化情况,来观察细胞是否发上了凋亡5.对具有中和活性的44号克隆进行亲和力成熟,利用基因比对从Genebank中搜索出与44号克隆序列最接近的抗体胚系基因序列,然后通过IMTG中的抗体可变区基因在线分析工具V-QUEST,找出重链胚系基因中CDR区的突变热点,并与44号克隆进行比较,确定这些热点在44号克隆重链CDR区中的位置,随后我们通过定点突变对重链可变区CDR1区中的三个胚系热点进行定点随机突变,构建噬菌体抗体突变库,通过三轮洗脱筛选,每轮逐渐增加洗脱次数和减少包被的FGF-2的量来得到亲和力提高的抗体突变株,将高亲和力突变株进行可溶性表达后,通过异硫氰酸铵洗脱法测定抗体的相对亲和力。计算抗体亲和力提高倍数。同时通过竞争ELISA法检测突变株是否还能抑制FGF-2与其高亲和力受体FGFR1的结合。结果1.经过3到4轮筛选从104个随机挑选的克隆中,筛得39株抗FGF-2的抗体,通过对抗体可变区基因多样性分析,发现有8种不同抗体可变区基因型,挑选其中8株phage ELISA显色最高的克隆进行DNA酶切和测序鉴定,发现其中7株为正确的抗体基因序列,通过大肠杆菌HB2151成功的进行了scFv的可溶性表达,通过竞争ELISA发现其中三株scFv能够抑制FGF-2与其高亲和力受体FGFR1βⅢC的结合,其中44号克隆的抑制效果最好。2.通过对转染试剂,转染方法,培养温度,转染试剂与细胞的孵育时间,组蛋白抑制剂的加入等条件进行优化使人源性抗FGF-2抗体在HEK293T细胞中的表达量从1.5mg／L提高到了15.1mg／L。表达产物经硫酸铵沉淀,透析后上蛋白G亲和层析柱纯化,纯化后的产物经超滤管超滤除盐,最后经SDS-PAGE鉴定,获得纯度为90%的电泳纯抗体,双抗夹心法测定抗体含量,显示产量可以达到每升细胞培养上清12mg抗体。3.通过一系列体外实验证实44号克隆能够抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖,迁移和成管,同时还能抑制神经胶质瘤细胞株U87MG的增殖,Hoechst 33258染色后发现抗FGF-2抗体作用能够诱导U87MG的凋亡4.通过热点随机突变构建44号克隆的单链抗体噬菌体突变库,通过三轮洗脱筛选,筛选到了4株亲和力提高的抗体突变株,经过可溶性表达后,通过异硫氰酸铵洗脱法测定抗体的相对亲和力,显示其中最高的一株亲和力比44号克隆的亲和力提高了4倍。结论1.通过对人源性噬菌体抗体库的筛选得到了七株不同的人源性抗FGF-2抗体,经过体外实验证实其中一株抗体能够中和FGF-2的多种生物学作用,如促血管内皮增殖作用,促细胞迁移作用,内皮细胞成管作用等,更为重要的此株抗体还能诱导神经胶质瘤细胞株U87MG的凋亡。2.通过胚系热点突变使此株中和性抗体的亲和力提高了4倍,与此同时也提高了抗体的中和活性,从而证实了胚系热点突变提高抗体亲和力的可行性。本研究的创新处：1.成功筛选到三株人源性中和性抗FGF-2抗体,其中一株的抑制FGF-2与其高亲和力受体FGFR1结合的效果最好,通过细胞实验证实此株抗体能够中和FGF-2的多种生物学作用,为FGF-2抗体药物研究奠定基础。2.成功利用CDR区胚系热点突变提高了一株中和性抗体的亲和力,同时也使得抗体的中和活性增强,证实了此方法可在不改变抗原识别位点的情况下提高抗体的亲和力。
曾大地[4]（2010）在《计算机辅助设计进行抗VEGF抗体体外亲和力成熟》文中认为恶性肿瘤严重威胁人类健康,全球每年有700多万人死于恶性肿瘤,1000多万新增肿瘤患者。在我国,恶性肿瘤已成为城市人口的主要死亡原因,占死亡人口总数的21%。WHO预计,到2020年,全世界肿瘤发病率将是现在的两倍。对于肿瘤的治疗,早期主要采用手术及放、化疗的方法,但是这些方法存在着各自的缺点:手术治疗依赖于早期诊断,而放、化疗的副作用很大。因此迫切需要开发新型抗肿瘤药物,而抗血管生成的治疗性抗体的出现为肿瘤治疗开辟了新途径。新生血管的形成对肿瘤的生长和转移至关重要。血管内皮生长因子（ vascular endothelial growth factor, VEGF）与其受体VEGFR相互作用,能特异地促进内皮细胞分裂、增殖及迁移,在肿瘤新生血管生成过程中起着至关重要的作用。通过阻断VEGF/VEGFR,可以特异性阻断或抑制VEGF/VEGFR所介导的生物学活性,从而抑制肿瘤血管生成,达到治疗恶性肿瘤、抑制肿瘤进展的目的。因此针对VEGF开发治疗肿瘤的抗体成为人们关注热点。目前抗VEGF人源化抗体贝伐单抗（Bevacizumab,商品名Avastin ）已成功上市,并产生了巨大的社会效益及经济价值,2009年年销售额达到57.7亿美元,并被认为是最有市场开发前景的治疗性抗体。但是国际上还没有成功应用于临床的全人源抗VEGF抗体。因此,开发以VEGF为靶标的全人源抗体具有广阔应用前景和重大意义。本研究室通过对大容量全合成噬菌体人源抗体库的筛选,获得了近50株人源抗VEGF单链抗体,这为开发具有自主知识产权的抗VEGF治疗性抗体奠定了基础。为了便于研究,本研究将筛选到的两株抗VEGF单链抗体VA6、VK8改造为IgG1全抗体,并将这两株全抗体在FreeStyleTM293细胞中进行了瞬时表达,表达量可达20mg/L,获得的全抗体纯品为以后的实验提供了充足稳定的实验材料。改造的两株全抗体保持了VEGF-A165特异性结合的活性,利用Bia-core方法测定了两株全抗体的亲和力,VA6、VK8亲和力分别为12.7nM和0.77nM。体外活性试验结果显示,两株全抗体都具有一定的体外活性,具有进一步开发为治疗性抗体的潜质。由于VEGF/VEGFR2的亲和力在0.1nM水平,只有亲和力达到或超过这个水平的抗体才能较好地阻断VEGF和VEGFR结合,达到临床应用的要求。VA6、VK8两株抗体的亲和力尚不能达到此水平,因此需要进行体外亲和力成熟以提高这两株抗体的亲和力。本研究对这两株抗体进行了体外亲和力成熟,以期改善其体外、体内生物学活性,同时尝试建立可行的亲和力成熟方法,以便应用于其它抗体的开发研究,为治疗性抗体的研发提供技术支撑。我们以两株抗VEGF单克隆抗体为模版,采用计算机辅助设计的技术路线,根据构建的抗原-抗体复合物结构模型所提供的信息进行全抗体突变体设计,然后进行试验分析验证,寻找亲和力得以改善的突变体。在得到亲和力有所提高的突变体之后,再进行下一轮的突变体设计、分析与验证,如此反复进行,以期获得亲和力显着提高,功能有所改善的突变体。并在此基础上,通过进一步改进和完善,建立起高效的抗体亲和力成熟方法,为治疗性抗体的研发提供技术支持。首先,我们通过同源模建的方法,构建了VA6和VEGF复合物的三维结构模型,通过对该模型的深入分析,发现该抗体与VEGF的结合表位与VEGF受体1、受体2的结合表位交错重叠。推测该抗体能够抑制VEGF与其受体的结合,从而抑制VEGF的生物学活性。VA6轻链CDR3区第90位赖氨酸、第92位天冬氨酸两个氨基酸残基由于所带电荷性质和对应的VEGF界面上的残基电荷性质相同,存在排斥作用,明显不利于抗原抗体的结合。根据结构模型所获信息,我们设计并构建了一系列突变体。利用FreeStyleTM293-F细胞双载体瞬时表达系统,对所构建的突变体进行了全抗体表达,用Protein A柱进行亲和层析纯化。在对抗体突变体亲和力分析过程中,通过反复尝试,我们建立了一种简便的定性比较抗体相对亲和力的ELISA方法。运用该方法初步分析了所构建突变体的亲和力,结果表明,突变体A6L-K90DD92I和A6L-K90DD92V亲和力分别有了不同程度的提高。Bia-core测定这两株突变体的亲和力,分别达到亲本抗体亲和力的1.5倍和2.3倍。这一结果证明所构建的模型准确,该亲和力成熟方法可行有效。在此工作基础上,我们以A6L-K90DD92V为目标抗体,构建了新的三维结构模型。通过对该结构的详细分析,确定抗体重链57位的丝氨酸与VEGF上86位组氨酸距离较近,将重链57位氨基酸改变为带负电荷的残基可以增强抗原-抗体之间的作用力。同时在结构模型中分析发现,重链98位氨基酸在CDR3区的loop区顶端,与抗原距离较远,因此决定在该区域引入3个氨基酸,以增加该区域与抗原的作用界面面积。按照第一轮突变体构建与分析策略,构建了突变体并进行了全抗体的表达与分析。结果显示,在将重链57位丝氨酸突变为谷氨酸后,抗体亲和力有所提高（A6H-S57E,与轻链A6L-K90DD92V匹配）,比A6L-K90DD92V的亲和力高2倍,这样这一轮得到的突变体A6H-S57E亲和力达到亲本抗体的7倍。随后,按照和前两轮相同的策略,对第二轮获得的亲和力最高的突变体进行了新一轮的三维结构模建和分析。结果显示,该突变体重链52位和54位的丝氨酸空间与VEGF表面相应区域空间结构契合不是十分严密,并且VEGF表面相应区域有氢键受体,所以可以改变这两个位置的氨基酸以增加契合面积,同时增加供体氢原子,以使该区域抗原抗体间形成氢键。根据这些信息设计了20株突变体并进行了亲和力分析,结果显示将52位和54位的丝氨酸都突变为苏氨酸之后抗体亲和力得到了进一步的提高（A6H-S52TS54TS57E,与轻链A6L-K90DD92V匹配）,抗体亲和力达到初始亲本抗体的10倍以上。在获得了VA6高亲和力突变体的工作基础上,我们尝试用同样的方法对另外一株抗体VK8进行体外亲和力成熟,并选择界面残基相互作用能作为衡量突变体亲和力是否可能提高的参数,尝试将突变体设计的过程标准化,以便更高效地获得高亲和力突变体,但是却遇到了困难。按照构建的模型设计的所有突变体亲和力都未见提高。通过分析认为该模型与实际情况存在偏差。随后我们对模型构建策略进行了改进,通过“叠合优化”和“分子对接”两种方法分别获得了多个模型。通过分析这些模型,认为其中的模型5更有可能与真实的抗原-抗体复合物结构相符。通过对这些模型进行综合分析及实验验证,初步确定了正确的模型,并最终获得了亲和力有所提高的突变体。通过上述研究,我们初步确定了构建抗原-抗体复合物结构模型的方法,建立了抗VEGF单克隆抗体VA6、VK8的三维结构模型,并以此为依据,通过计算机辅助设计构建了大量突变体,最终获得了这两株抗VEGF单克隆抗体的高亲和力突变体。高亲和力突变体的获得,为进一步将VA6、VK8开发成治疗性抗体提供了有效的技术手段,而计算机辅助设计进行抗体体外亲和力成熟方法的建立,为开发人源治疗性抗体提供了技术支持。
田江红[5]（2010）在《核糖体展示人单链抗体库的构建及抗HCVNS5B蛋白的ScFv的筛选》文中研究表明丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus）引起的传染性疾病,主要通过血源途径传播,以慢性化程度高为主要特征。全球范围内HCV感染者为1.7～2.0亿,我国大约为4000万。HCV感染后有75～85%的感染者会形成慢性肝炎,进一步会发展为肝硬化和肝癌,目前HCV感染已成为严重危害人类健康的全球公共卫生问题之一。迄今为止抗HCV的治疗仅限于干扰素-利巴韦林联合使用,只有约50%的患者可获得持续的抗病毒反应,而且费用昂贵、有一定毒副作用,因此迫切需要研制更加安全有效的新型抗病毒药物和生物制品。HCV NS5B蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）,在病毒RNA复制中起着关键作用,而细胞中则没有相应功能的酶类,因此NS5B蛋白是抗HCV的理想靶位。近年来很多学者针对NS5B蛋白设计了多种核苷类与非核苷类抑制剂,疗效显着,然而临床试验发现用药后易出现耐药突变株,影响了抑制剂的进一步应用。鉴于NS5B蛋白晶体结构已经明确,它在复制基因组RNA中需要一定的空间构型转换才能发挥酶催化活性,可以克服抑制剂的耐药现象,因此构型抑制剂研究已成为拮抗NS5B酶活性研究的又一重要方向。单链抗体（ScFv）基因通过载体携带进入靶细胞内与与抗原特异结合,调节靶分子构型转换与细胞内定位,影响其生物功能的发挥,可将病毒复制的关键分子选择性的“敲除”,从而达到使目标分子生物学功能失活的目的。本研究从构建的核糖体展示人单链抗体库中,筛选出了抗NS5B蛋白的人源化单链抗体,有可能抑制NS5B蛋白的空间构型转换,为进一步研制抗HCV生物制剂带来了新的希望。【目的】以在HCV RNA复制中起关键作用的RNA聚合酶NS5B蛋白为靶标,从HCV阳性患者的PBLs中提取mRNA并构建ScFv基因文库,利用完全体外筛选、高库容的核糖体展示技术来筛选针对NS5B蛋白的人源性ScFv,将初步鉴定筛选到的ScFv生物学功能。【方法】1.运用软件设计引物,以BB7复制子为模板PCR扩增ns5bΔ21基因;克隆入原核表达载体pRSETA;将重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21转化BL21大肠杆菌,用IPTG诱导表达及可溶性分析;Western-blot检测NS5B蛋白的抗原性和特异性;用Ni2+-NTA亲和层析柱和电洗脱方法纯化NS5B蛋白;用纯化的NS5B蛋白免疫小鼠制备多抗血清。2.从6名HCV阳性患者的外周血淋巴细胞（PBLs）中提取总RNA,甲醛变性电泳检测RNA质量;以反转录的全长cDNA为模板PCR扩增全套重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的基因,将VH和VL的胶回收产物拼接,来构建核糖体展示的人单链抗体（ScFv）基因库;构建ScFv-pMD18T载体,转化后挑60个克隆提取质粒,将酶切鉴定正确的31个克隆送去测序。3.将纯化的NS5B蛋白包被磁珠;ScFv DNA库在兔网织红细胞裂解液中进行体外转录与翻译,形成ScFv-核糖体-mRNA（ARM）三聚体;用包被抗原从三聚体中筛选抗NS5B的ARM;筛选得到的ARM用Trizol试剂提取RNA,进行RT-PCR扩增,PCR产物进入下一轮循环;经三轮循环,从ScFv库中筛选抗NS5B的特异性ScFv基因并对其测序。4.运用软件设计引物,以测序正确的Anti-NS5B-ScFv-pMD18T重组质粒为模板PCR扩增Anti-NS5B-ScFv基因;克隆入原核表达载体pET16b;将重组表达质粒Anti-NS5B-ScFv-pET16b转化BL21感受态细胞,用IPTG进行诱导原核表达及可溶性分析,SDS-PAGE和Western-blot鉴定ScFv是否有表达。【结果】1.截断型HCVns5b基因克隆、表达及纯化酶切鉴定和序列测定表明成功的构建了重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21;IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析结果可见新生表达条带,Western-blot证实了其特异性和抗原性均良好;利用亲和层析和电洗脱方法获得了纯化的NS5B蛋白;制备了效价为1:3000的抗血清。2.核糖体展示人ScFv库的构建从6名HCV阳性患者的PBLs中提取总RNA,甲醛变性电泳结果可见28s和18s rRNA条带,表明RNA的质量很好;通过重叠PCR技术扩增抗体的VH和VL基因,并用linker将其拼接,成功构建了ScFv DNA文库;对31个阳性克隆进行序列分析,结果表明该文库有很好的多样性,库容量较大,约为7.86×1012。3.筛选针对NS5B的ScFv将ScFv DNA库体外转录和翻译,通过SDS-PAGE证实其有效形成了ScFv-核糖体-mRNA三聚体;用包被抗原从三聚体中筛选获得了针对NS5B的ScFv基因并测序正确。4.抗NS5B ScFv的原核表达及初步鉴定成功构建了ScFv-pET16b重组表达质粒,并转化E.coli BL21进行原核表达,经SDS-PAGE分析,在大小约为27kD处有新生表达条带, Western-blot进一步证明了ScFv的特异性。【结论】运用核糖体展示技术构建人源性ScFv文库,以HCV NS5B蛋白为靶标筛选到了其ScFv,本实验将为利用人单链抗体治疗HCV研究提供了实验基础。
廖世奇[6]（2008）在《核酸信标配基的构建、合成、活性鉴定及检测技术的研究》文中研究说明随着科学技术发展,对分子检测技术的特异性、灵敏度有着更高要求。尤其是在临床应用和基础研究中,分子的定性和定量检测具有非常重要的意义。因此,探索新技术或改进现有技术以提高分子水平的精确定量,突破检测技术这一瓶颈,是目前科研工作的重中之重。本课题研究目的是构建一个具有配体识别和信号扩增能力的检测分子。在核酸信标配基的研究中,本文首次利用指数级富集配基进化技术（SELEX）筛选到小鼠IgG抗体Fc片段的特异性寡核苷酸配基,并进行了克隆、测序、序列分析及采用多种方法进行特异性鉴定,如:利用PCR进行阳性克隆筛选,dot-blot阳性配基筛选,高压液相色谱,凝胶阻滞等活性鉴定。共筛选到16株特异性配基克隆。同时,首次建立了一套较为完整的SELEX硝酸纤维素滤膜快速筛选方法。在此基础上,本文首次发明了核酸信标配基,完成设计、合成及活性鉴定。核酸信标配基是通过巢式-PCR方法,在配基的5’端连接一段荧光标记探针的靶（Beacon）序列,该序列是由两端两个引物和中间Taqman探针的互补序列构成,和靶分子具有对应性,即双链核酸信息标记的核酸信标配基。由于核酸信标是双链,不影响配基和靶分子（Fc片段）的结合,因此通过核酸信标来完成信息传导和信号放大功能。本文首次利用琼脂糖凝胶阻滞放射自显影和考马斯亮兰双显色方法,对核酸信标配基和抗体结合特异性进行鉴定。另外,本文首次建立两种方法对核酸信标配基进行功能鉴定:一种方法是核酸信标配基免疫-PCR方法（NBA-iPCR）,该方法是通过核酸信标配基与抗体结合形成信标配基-抗体复合物作为检测分子,再利用配基-抗体与抗原结合形成信标配基-抗体-抗原复合物,完成抗原信号到核酸信号的传递。通过实时定量-PCR检测证明,核酸信标配基具有传感和扩增能力。另一种方法是核酸信标配基-PCR方法（NBA-PCR）,该方法是将核酸信标配基作为检测分子,通过核酸信标配基和靶分子（抗体）结合形成配基-靶分子复合物,完成靶分子信号到核酸信号的传递。通过实时定量-PCR检测证明,核酸信标配基自身具有配基和配体识别能力和信号放大功能。综上所述:核酸信标配基完全具有适配体识别能力和信号储存、传递、放大功能。该分子将成为一种全新的、构建灵活、检测特异性强、灵敏度高、使用范围广的检测分子。
朱琳琳[7]（2006）在《全合成人源抗体库的构建及抗BHL-1单链抗体的初步筛选》文中认为通过抗体库筛选针对特异抗原的噬菌体展示技术是目前获得人源性抗体最有效的方法,抗体库依据基因序列来源的不同,又可分为免疫库和天然库。利用全合成的方法可以获得序列随机分布的DNA文库,利用Kabat数据库公布的人抗体序列信息并结合已发表体骨架区序列,我们设计了全合成抗体库的骨架序列和CDR3随机区序列。根据统计和归纳,现有的人抗体的可变区基因可按重链和轻链分组,分别代表人抗体序列的七个胚系基因。其中重链分为VH1A、VH1B、VH2、VH3、VH4、VH5和VH6;轻链则按Kappa链和Lamda链的不同,将Kappa链和Lamda链各分为四个组和三个组,通过轻、重链的组合构成的单链抗体库可以涵盖超过95%的抗体胚系序列。在随机化过程中,利用DNA组合固相合成法来实现各位点氨基酸种类和频率的控制,以PCR的原理,无引物或低引物浓度来控制库冗余度,降低差错,经电击转化大肠杆菌最终建成了1.5×109库容的噬菌体展示文库,该抗体库的阳性率超过85%,正确序列超过50%,符合预期的目标。全合成抗体库的设计特征、构建方法和质控标准都可以保证其实用性。为进一步鉴定此抗体库的效率,我们以BHL-1（抗人卵巢癌×抗人CD3双特异抗体）蛋白为抗原,经生物淘选获得了数个具有较高亲和力的克隆,对其中C8进行亚克隆,转入表达载体进行表达,表达产物以包含体为主,经复性后进行活性检测,对靶抗原的ELISA测定具有特异的结合能力（OD490=0.727）,推测其结合位点在抗卵巢癌单链抗体部分,表明获得了有意义的“人源化”抗体,此抗体经进一步优化可用于测定BHL-1蛋白的样品浓度和残留。理论上,此抗体成库可针对任意抗原筛选单链抗体,有望成为科研用抗体制备、抗体人源化的工具,经序列优化还可以用来制备诊断试剂或治疗性中和抗体。
胡思怡[8]（2006）在《重组基因工程抗体和蛇毒C型凝集素类似蛋白在毕赤酵母中表达及结构功能研究》文中研究表明巴斯德毕赤甲醇营养型酵母（Pichia Pastoris）属于低等的真核表达系统，与其他表达系统相比，具有遗传操作简单、蛋白折叠和二硫键加工能力较强、易于高密度发酵、蛋白表达量较高等优点，已经成为重组蛋白研究和商业化生产的重要表达系统之一。本论文讨论了抗ErbB2基因工程抗体和重组蛇毒毒素蛋白在毕赤酵母中表达，以及结构和功能关系研究中，主要包括以下三部分内容： 1．密码子优化的抗ErbB2单链抗体在Pichia中表达、纯化和活性鉴定。ErbB2／HER2／P185属于具有酪氨酸激酶的表皮生长因子受体家族，在细胞生长发育和组织分化中起到了重要作用，ErbB2过表达经常在细胞癌化和肿瘤发生中起关键的作用，因此成为肿瘤诊断和治疗的一个重要靶分子。本实验室研制了一株具有肿瘤生长抑制活性的抗ErbB2单克隆抗体mA21，并且构建和表达了工程化的单链嵌和抗体chA21。本研究就是在前期工作基础上合成了密码子优化的单链抗体scFv全基因，并且在Pichia酵母中获得了高效表达，进一步优化表达条件后单链抗体表达量达到了10mg/L。单链抗体经Ni2+亲和柱一步纯化后，即可用于晶体生长、亲和力测定等结构和功能研究。 2．抗ErbB2胞外区抗体A21的表位鉴定、晶体结构分析和抗肿瘤机理的初步研究。我们联合使用噬菌体随机肽库表面展示技术、抗原在原核系统中分段表达、抗原点突变扫描等实验精细测定了A21抗体识别的抗原表位和关键性残基。在蛋白质结构晶体实验室的帮组下解析了A21单链抗体2.1A分辨率的晶体结构。并且利用大分子对接软件，基于实验结果预测并验证了A21抗体与ErbB2抗原可能的相互作用模型。结果显示A21抗体主要识别ErbB2胞外区靠近N端I区的空间表位。我们还测定了A21抗体对肿瘤细胞株的增殖抑制活性、抗体的内吞作用、抗体对ErbB2磷酸化的影响、以及抗体诱导的ErbB2受体下调作用，进一步解释了A21抗体表位和抗体功能之间的联系。 3．重组蛇毒C型凝集素类似蛋白ACFI在Pichia酵母中表达、纯化和结构功能关系研究。蛇毒C型凝集素类似蛋白具有非常相似的二硫键连接的异二聚体结构，但是具有多种不同的生物学功能。ACFI是从皖南尖吻蝮蛇蛇毒中分离到的一种可以与凝血因子结合的具有抗凝活性的C型凝集素类似蛋白。我们设计了一种新的共转化策略，使用两个不同抗生素选择标记的载体用于筛选ACFI两个亚基共表达的重组菌株。结果显示，重组ACFI亚基在Pichia酵母中单独表达时形成同二聚体，共表达时则可以形成异二聚体。重组ACFI具有与天然蛋白类似的凝血因子结合活性和抗凝活性，但是重组亚基却没有这些功能，说明ACFI两个亚基对维持其正常的生物学功能具有非常重要和不可替代的作用。我们的结果提示Pichia系统在蛇毒C型凝集素类似蛋白结构和功能关系的研究中具有重要的应用价值。
张吉斌[9]（2006）在《抗—牛朊蛋白单链抗体检测系统的构建、表征与应用》文中认为朊病毒(PrPsc)是一种新型蛋白质感染因子，能够引起人和动物的可转移性神经退化疾病，如牛海绵状脑病（BSE）（或称疯牛病）和人的新型克雅氏病（nvCJD）。BSE已在世界范围内对养牛业和世界经济造成了巨大损失，由于受污染的牛制品可将疯牛病传染给人类，给人类健康构成了巨大威胁，因此建立特异、灵敏的牛朊病毒检测方法十分重要。 免疫学检测是牛朊病毒主要的检测方法，目前，用于检测的抗体为单克隆抗体。本研究尝试建立单链抗体介导的夹心蛋白芯片用于牛朊蛋白的检测。要获得抗牛朊蛋白单链抗体，首先构建噬菌体抗体库。由于牛和小鼠的PrP基因同源性约90％，为了避免出现免疫耐受，采用牛朊蛋白融合蛋白免疫小鼠。通过PCR和DNA重组构建了牛朊蛋白基因的原核表达载体，在基因水平上构建了硫氧还蛋白（TrxA）基因和牛朊蛋白基因的融合基因，并在大肠杆菌中进行了IPTG诱导表达硫氧还蛋白-牛朊蛋白融合蛋白（TrxA-bPrPc）。Western blot分析表明该融合蛋白具有结合牛朊蛋白单克隆抗体的活性。采用TrxA-bPrPc融合蛋白免疫小鼠成功突破了小鼠免疫耐受，诱导了抗牛朊蛋白抗体。通过PCR从牛朊蛋白融合蛋白免疫的小鼠脾脏B细胞中扩增抗体可变区基因片段（VH，VL），然后通过Overlap PCR扩增抗体可变区基因，将体外组装的scFv基因片段克隆入噬菌体展示载体pCANTAB 5E，通过“吸附-洗脱-扩增”的富集过程，从噬菌体抗体库中筛选出针对牛朊蛋白特异的单链抗体Z163、Z186和Z1030。在此基础上构建了四个单链抗体融合蛋白：Z186-L-SBP、Z163-L-SBP、Z163-Fc和Z1030-Fc，采用Western Blot、SPR和Sandwich ELISA方法对其特性进行了研究。Western Blot结果表明Z186-L-SBP、Z163-L-SBP、Z1030-Fc和Z163-Fc可特异识别重组牛朊蛋白核心区片段的线性表位；用夹心ELISA对4个单链抗体融合蛋白及抗牛朊蛋白单克隆抗体KG9进行配对实验，Z186-L-SBP／Z163-Fc和Z163-L-SBP／KG9配对显示明显的阳性结果；用SPR方法测定了Z163、Z163-L-SBP、Z163-Fc和Z186-L-SBP的亲和力，其平衡解离常数（KD）分别为8.82×10-8M、4.11×10-8M、8.10×10-9M和3.24×10-8M。单链抗体融合蛋白Z163-L-SBP亲和力是单链抗体Z163的2.2倍，单链抗体融合蛋白Z163-Fc亲和力是单链抗体Z163的11倍，亲和力有明显的提
刘志刚,林建波,杜韫,俞炜源[10]（2005）在《重组单链抗体-低分子质量尿激酶融合蛋白在CHO细胞中的抗降解研究》文中研究指明抗人纤维蛋白单链抗体-低分子质量尿激酶（IIn-UK）融合蛋白,兼有单链抗体对纤维蛋白的亲和性和尿激酶的溶栓活性,有望开发成为新型导向溶栓药物.但基于通用连接肽（G4S）3的IIn-linker-UK融合蛋白在CHO细胞中表达时出现明显的降解.为了解决此问题,利用分子生物学方法,对IIn-UK融合蛋白进行了分子改造,包括置换连接肽,改变两个半分子（moiety）的相对位置,以及对连接肽附近明确的蛋白酶位点进行突变等方法,并分别研究了改造后的11种IIn-linker-UK或UK-linker-IIn突变体在CHO细胞中分泌性表达时的稳定性,最终筛选到一种抗降解的突变体.
二、人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的体外分子进化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的体外分子进化（论文提纲范文）
（1）ICOSL分子的克隆表达及ICOSL核糖体单链抗体库的构建及筛选（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 ICOSL的研究进展 |
| 1.1 ICOSL及其受体ICOS的结构 |
| 1.2 ICOSL的分布与表达 |
| 1.3 ICOSL的生物学功能及其信号传导的研究 |
| 1.4 ICOSL在疾病方面的研究 |
| 1.4.1 ICOSL对自身免疫性疾病的影响 |
| 1.4.2 ICOSL对器官移植排异反应的影响 |
| 参考文献 |
| 第二章 单链抗体的表达及应用 |
| 2.1 单链抗体的构建及其生物学特性 |
| 2.1.1 单链抗体的构建 |
| 2.1.2 单链抗体的生物学特性 |
| 2.2 单链抗体的表达系统 |
| 2.2.1 原核细胞表达系统 |
| 2.2.2 哺乳动物细胞表达系统 |
| 2.2.3 酵母细胞表达系统 |
| 2.2.4 植物细胞表达系统 |
| 2.2.5 昆虫细胞表达系统 |
| 2.3 单链抗体的应用 |
| 2.3.1 在生物学方面的应用 |
| 2.3.2 在基因治疗方面的应用 |
| 2.3.3 在肿瘤诊断方面的应用 |
| 2.3.4 在肿瘤治疗方面的应用 |
| 2.3.5 在抗器官移植排异反应方面的应用 |
| 2.4 单链抗体的前景与展望 |
| 参考文献 |
| 第三章 核糖体展示技术的建立及应用 |
| 3.1 核糖体展示技术概述 |
| 3.2 核糖体展示技术的原理 |
| 3.3 核糖体展示技术的具体过程 |
| 3.3.1 核糖体展示基因文库的构建 |
| 3.3.2 核糖体展示技术中的体外转录与翻译 |
| 3.3.3 核糖体展示技术中的亲和筛选与筛选效率的测定 |
| 3.4 核糖体展示技术的应用 |
| 3.4.1 在多肽筛选方面的应用 |
| 3.4.2 在筛选抗体方面的应用 |
| 3.4.3 在酶方面的应用 |
| 3.5 核糖体展示技术的应用前景及展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 ICOSL分子胞外区的克隆表达 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料与试剂配置 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ICOSL基因全长的扩增 |
| 2.2 ICOSL胞外区基因的扩增 |
| 2.3 ICOSL胞外区基因的克隆与表达 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 抗ICOSL核糖体展示单链抗体库的构建 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料与试剂配置 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ELISA分析 |
| 2.2 小鼠脾脏总RNA的提取 |
| 2.3 VH-linker、VK-linker链以及VH-linker-κ链的扩增 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 核糖体展示技术筛选抗ICOSL单链抗体 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 体外转录与翻译 |
| 2.2 单链抗体基因的亲和性鉴定 |
| 2.3 单链抗体的表达纯化及活性坚定 |
| 2.4 克隆菌株的序列分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 攻读硕士期间发表论文 |
（2）工程化的人抗人IgE抗体的制备（论文提纲范文）
| 目录 |
| 序言 |
| 第一章 工程化的人抗人IgE抗体的制备 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 重组IgE抗原的制备 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第二部分 人免疫球蛋白G基因文库的构建 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第三部分 抗体库的筛选 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第四部分 抗体的功能分析 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第五部分 抗体的功能优化 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第六部分 鼠抗人IgE单克隆抗体的人源化 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二章 中国溶组织内阿米巴感染的血清流行病学调查 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 溶组织内阿米巴滋养体粗抗原的制备 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第二部分 溶组织内阿米巴重组抗原Igl-C的制备 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第三部分 血清流行病学调查 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三章 内转录间隔区2和细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ基因在无气门螨类鉴别中的应用 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 无气门螨类的鉴定及基因组DNA的获取 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第二部分 内转录间隔区2和细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ基因的获取和序列测定 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第三部分 系统发生学研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）人源性抗FGF-2中和性抗体的筛选，表达及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 技术路线 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 噬菌体抗体库的筛选 |
| 第四章 人源性抗FGF-2抗体的原核表达 |
| 第五章 人源性抗FGF-2抗体的真核表达 |
| 第六章 抗体生物学活性的鉴定 |
| 第七章 抗体亲和力成熟 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 英文缩略词表 |
| 博士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 研究生毕业论文统计学审稿证明 |
（4）计算机辅助设计进行抗VEGF抗体体外亲和力成熟（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 一、VEGF/VEGFR2 |
| 二、VEGF/VEGFR与恶性肿瘤 |
| 三、靶向VEGF的抗肿瘤治疗性抗体 |
| 四、抗体体外亲和力成熟 |
| 参考文献 |
| 第一部分 抗VEGF 单链抗体的全抗体改造及特性分析 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 计算机辅助设计进行抗 VEGF 单克隆抗体 VA6 体外亲和力成熟 |
| 第一节 VA6 亲和力成熟——第一周期 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 第二节 VA6 亲和力成熟——第二周期 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 第三节 VA6 亲和力成熟——第三周期 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 计算机辅助设计进行抗 VEGF 单克隆抗体 VK8 体外亲和力成熟 |
| 第一节 VK8 亲和力成熟——第一周期 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 第二节 VK8 亲和力成熟——第二周期 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 研究总结 |
| 文献综述 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（5）核糖体展示人单链抗体库的构建及抗HCVNS5B蛋白的ScFv的筛选（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 第一部分 截短型HCV N558基因克隆、表达及纯化 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 核糖体展示人单链抗体的构建及筛选针对HCV NS5B 的ScFv 与表达 |
| 1 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）核酸信标配基的构建、合成、活性鉴定及检测技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 综述 |
| 参考文献 |
| 第二章 小鼠IgG Fc 片段寡核苷酸配基的筛选、克隆、测序及分析 |
| 2.1. 前言 |
| 2.2. 材料与仪器 |
| 2.3. 方法 |
| 2.3.1. 文库的合成 |
| 2.3.2. 抗体IgG，Fc 片段特异寡核苷酸配基的筛选 |
| 2.3.3. 感受态细胞的制备及测试 |
| 2.3.4. 次级核酸文库的连接、转化 |
| 2.3.5. 小片段DNA 阳性克隆的筛选 |
| 2.3.6. 斑点杂交法（dot blot）--阳性配基的初筛选 |
| 2.3.7. 寡核苷酸配基的测序 |
| 2.3.8. 寡核苷酸配基的序列分析 |
| 2.4. 结果与讨论 |
| 2.4.1. 抗体IgG Fc 片段特异寡核苷酸配基的筛选 |
| 2.4.2. 寡核苷酸配基的重组结果 |
| 2.4.3. 阳性克隆的筛选结果 |
| 2.4.4. 斑点杂交法初步筛选特异性寡核苷酸配基结果 |
| 2.4.5. 特异性寡核苷酸配基测序结果 |
| 2.4.6. 特异性寡核苷酸配基序列分析结果 |
| 第三章 小鼠抗体IgG 的Fc 配基活性鉴定 |
| 3.1. 前言 |
| 3.2. 方法 |
| 3.2.1. 寡核苷酸配基特异性鉴定——斑点杂交法（dot blot） |
| 3.2.2. 寡核苷酸配基特异性的检测分析 |
| 3.2.3. 寡核苷酸配基对不同小鼠I g G 亚型通用性的检测分析 |
| 3.2.4. 色普分离法对特异性寡核苷酸配基的鉴定 |
| 3.2.5. 琼脂糖凝胶阻滞方法 |
| 3.2.6. 聚丙稀酰胺凝胶凝胶阻滞方法 |
| 3.3. 结果与讨论 |
| 3.4. 结论 |
| 第四章 核酸信标配基分子的构建、克隆、测序及活性鉴定 |
| 4.1. 前言 |
| 4.2. 材料与仪器 |
| 4.3. 方法 |
| 4.3.1. 核酸信标配基分子的设计 |
| 4.3.2. 核酸信标配基分子的构建 |
| 4.3.3. 核酸信标配基分子的克隆、测序 |
| 4.3.4. 聚丙烯酰胺凝胶阻滞活性鉴定 |
| 4.4. 结果与讨论 |
| 4.4.1. 抗体IgG Fc 片段的核酸信标配基的构建 |
| 4.4.2. 信标配基连接转化结果 |
| 4.4.3. 阳性克隆测序结果 |
| 4.4.4. 核酸信标配基的活性鉴定 |
| 第五章 核酸信标配基检测方法的研究 |
| 5.1. 前言 |
| 5.2. 材料与仪器 |
| 5.3. 方法 |
| 5.3.1. 核酸信标配基介导的PCR原理 |
| 5.3.2. 核酸信标配基介导免疫-PCR检测方法的研究 |
| 5.3.3. 核酸信标配基介导PCR检测方法的研究 |
| 5.4. 结果与讨论 |
| 5.4.1. 核酸信标配基介导免疫－PCR检测（NBA-IPCR） |
| 5.4.2. 核酸信标配基介导PCR检测(NBA-PCR) |
| 5.5. 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
（7）全合成人源抗体库的构建及抗BHL-1单链抗体的初步筛选（论文提纲范文）
| 提要 |
| 关键词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 抗体药物的产生、应用及发展 |
| 1.2 抗体药物的生产历史及现状 |
| 1.2.1 发展历史 |
| 1.2.2 基因工程抗体 |
| 1.3 噬菌体抗体库技术 |
| 1.3.1 抗体库的发展技术 |
| 1.3.2 噬菌体展示技术的原理 |
| 1.4 噬菌体库的分类 |
| 1.4.1 免疫抗体库 |
| 1.4.2 天然抗体库 |
| 1.4.3 合成抗体库 |
| 1.5 噬菌体展示技术的应用 |
| 1.5.1 与蛋白质相互作用的研究 |
| 1.5.2 在筛选和制备多肽药物方面的应用 |
| 1.5.3 在疾病治疗和致病机理方面的研究 |
| 第二章 人源全合成抗体库的构建 |
| 前言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 单链抗体库构建的技术路线 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.3 小结 |
| 第三章 抗BHL1 蛋白单链抗体的生物淘选 |
| 前言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
（8）重组基因工程抗体和蛇毒C型凝集素类似蛋白在毕赤酵母中表达及结构功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 综述 |
| 第一章 ErbB2及ErbB家族蛋白基本结构与功能 |
| 1.1 ErbB受体生物学功能、结构特点及其配基 |
| 1.2 ErbB受体二聚化和活化 |
| 1.3 ErbB受体介导的信号转导 |
| 1.4 ErbB受体的循环 |
| 1.5 ErbB2作为信号转导调节分子的中心作用 |
| 参考文献 |
| 第二章 ErbB2过表达导致细胞癌化的分子机制 |
| 2.1 ErbB2过表达与肿瘤形成 |
| 2.2 ErbB2过表达引起受体异常活化和信号转导 |
| 2.3 ErbB2过表达影响细胞周期调控 |
| 2.4 ErbB2过表达和细胞凋亡 |
| 2.5 ErbB2过表达导致受体胞外区切割和持续活化 |
| 2.6 ErbB2过表达改变ErbB家族受体循环特性 |
| 2.7 ErbB2过表达导致肿瘤的浸润和迁移 |
| 参考文献 |
| 第三章 抗ErbB2抗体功能和作用机理 |
| 3.1 抗ErbB2抗体研究进展及其在肿瘤治疗中的应用 |
| 3.2 抗体表位与抗体功能的相关性 |
| 3.3 抗体对ErbB2二聚化和活化的影响 |
| 3.4 抗体对ErbB2磷酸化的影响 |
| 3.5 抗ErbB2抗体对ErbB2受体内吞和下调的影响 |
| 3.6 抗ErbB2抗体抑制ErbB2胞外区的切割 |
| 3.7 抗ErbB2抗体对肿瘤细胞周期、细胞凋亡和细胞分化影响 |
| 3.8 抗ErbB2抗体与化疗药物的协同作用 |
| 3.9 抗ErbB2抗体抑制肿瘤细胞的浸润和转移 |
| 3.10 抗ErbB2抗体作用机理研究中存在的问题 |
| 参考文献 |
| 第四章 抗体工程技术在抗ErbB2工程化抗体研制中的应用 |
| 4.1 抗体工程技术发展概述 |
| 4.2 小分子抗体片段和多价抗体 |
| 4.3 抗体人源化改造 |
| 4.4 基因工程抗体库技术筛选人源化抗体和提高抗体亲和力 |
| 4.5 双功能抗体和抗体导向药物 |
| 参考文献 |
| 第五章 Pichia酵母系统在工程化抗体在表达中的应用 |
| 5.1 基因工程抗体表达系统比较 |
| 5.2 外源蛋白在Pichia酵母中优化表达 |
| 5.3 Pichia酵母在基因工程重组抗体表达中的应用 |
| 5.4 密码子偏好与蛋白表达的关系 |
| 5.5 密码子优化以提高外源蛋白在Pichia酵母中表达水平 |
| 参考文献 |
| 第六章 蛇毒C型凝集素类似蛋白结构和功能研究进展 |
| 6.1 动物C型凝集素蛋白和蛇毒C型凝集素类似蛋白 |
| 6.2 C型凝集素类似蛋白序列和结构特点 |
| 6.3 与凝血因子结合的C型凝集素类似蛋白结构和功能研究 |
| 6.4 血小板在凝血和止血中的重要作用 |
| 6.5 蛇毒C型凝集素类似蛋白的抗凝血机理 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验工作 |
| 第一章 A21单链抗体在Pichia酵母中优化表达、纯化和性质鉴定 |
| 前言 |
| 第一节 实验材料和实验方法 |
| 第二节 实验结果 |
| 第三节 讨论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 第二章 A21抗体结合表位、晶体结构以及肿瘤生长抑制机理研究 |
| 前言 |
| 第一节 实验材料和实验方法 |
| 第二节 实验结果 |
| 第三节 讨论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 第三章 重组蛇毒C型凝集素类似蛋白表达和结构功能研究 |
| 前言 |
| 第一节 实验材料和实验方法 |
| 第二节 实验结果 |
| 第三节 讨论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 已发表论文 |
（9）抗—牛朊蛋白单链抗体检测系统的构建、表征与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 朊病毒分子生物学 |
| 1.1.1 致病性朊病毒的发现及其化学本质的研究 |
| 1.1.2 PrP基因 |
| 1.1.3 朊病毒蛋白的一级结构 |
| 1.1.4 朊病毒蛋白的高级结构 |
| 1.1.5 朊病毒的致病机理 |
| 1.2 抗PrP~(sc)及PrP~c的抗体研制现状 |
| 1.3 朊病毒疾病的检测 |
| 1.3.1 病理检测 |
| 1.3.2 免疫诊断 |
| 1.3.3 其他诊断方法 |
| 1.3.4 展望 |
| 1.4 基因工程抗体研究进展 |
| 1.4.1 基因工程抗体的种类 |
| 1.4.2 单链抗体的改进 |
| 1.4.3 双特异抗体 |
| 1.4.4 基因工程抗体融合蛋白 |
| 1.4.5 基因工程抗体库技术 |
| 1.4.6 基因工程抗体的应用及展望 |
| 1.5 蛋白芯片研究进展 |
| 1.5.1 蛋白芯片的分类 |
| 1.5.2 载体的选择 |
| 1.5.3 蛋白质的固定 |
| 1.5.4 蛋白质的标记及检测方法 |
| 1.5.5 蛋白芯片的应用 |
| 1.6 课题的研究意义及内容 |
| 第二章 重组牛朊蛋白的高效表达及活性鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 酶和试剂 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.2.4 牛总DNA的提取 |
| 2.2.5 PCR扩增牛PrP~c(bPrP~c)基因和牛PrP~c核心区(bPrP27-30)基因片断 |
| 2.2.6 DNA序列测定 |
| 2.2.7 bPrP~c基因和bPrP27-30基因片断克隆载体的构建 |
| 2.2.8 bPrP~c基因和bPrP27-30基因片断表达载体的构建 |
| 2.2.9 大肠杆菌感受态的制备 |
| 2.2.10 大肠杆菌的转化 |
| 2.2.11 大肠杆菌质粒的提取 |
| 2.2.12 硫氧还蛋白-牛朊蛋白融合蛋白(TrxA-bPrP~c)和硫氧还蛋白-牛朊蛋白核心区(TrxA-bPrP27-30)融合蛋白的诱导表达 |
| 2.2.13 TrxA-bPrP~c和TrxA-bPrP27-30融合蛋白的亲和纯化 |
| 2.2.14 Western Blot鉴定重组bPrP~c和bPrP27-30蛋白的抗原活性 |
| 2.2.15 SDS-PAGE分析蛋白质纯度及分子量 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 bPrP~c基因和bPrP27-30基因片断的克隆 |
| 2.3.2 bPrP~c基因和bPrP27-30基因片断克隆到T载体 |
| 2.3.3 bPrP~c基因和bPrP27-30基因片断的序列测定结果 |
| 2.3.4 bPrP~c基因和bPrP27-30基因片断表达载体的鉴定 |
| 2.3.5 TrxA-bPrP~c和TrxA-bPrP27-30的高效表达和纯化 |
| 2.3.6 重组bPrP~c基因和bPrP27-30基因片断表达产物的Western Blot鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 TrxA-bPrP~c和TrxA-bPrP27-30的高效表达 |
| 2.4.2 温度对融合蛋白TrxA-bPrP~c和TrxA-bPrP27-30表达的影响 |
| 2.4.3 融合蛋白的Western blot鉴定 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 噬菌体抗体库技术筛选抗牛朊蛋白单链抗体 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试剂与材料 |
| 3.2.2 菌株 |
| 3.2.3 质粒载体 |
| 3.2.4 PCR引物 |
| 3.2.5 培养基 |
| 3.2.6 实验程序 |
| 3.2.7 动物免疫 |
| 3.2.8 血清效价测定 |
| 3.2.9 抗体总RNA提取 |
| 3.2.10 第一链cDNA反转录合成 |
| 3.2.11 轻、重链基因的扩增 |
| 3.2.12 scFv DNA的组装与扩增 |
| 3.2.13 scFv DNA片断的sfiⅠ／NotⅠ酶切 |
| 3.2.14 大肠杆菌TG1感受态的制备 |
| 3.2.15 pCANTAB 5E-scFv重组质粒的构建 |
| 3.2.16 重组噬菌体的制备 |
| 3.2.17 单链抗体噬菌体抗体库的富集筛选(panning)(微孔板筛选法) |
| 3.2.18 用ELISA方法检测抗牛朊蛋白的单链抗体 |
| 3.2.19 ScFv的序列分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 牛朊蛋白抗血清效价测定 |
| 3.3.2 重链、轻链可变区基因(V_H、V_L)的扩增及产物的鉴定 |
| 3.3.3 scFv基因拼接产物的鉴定 |
| 3.3.4 scFv表达文库的构建及文库容量的测定 |
| 3.3.5 scFv噬菌体表面展示及亲和富集 |
| 3.3.6 特异的phage-scFv ELISA鉴定 |
| 3.3.7 scFv的PCR和酶切验证 |
| 3.3.8 scFv的序列分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 TrxA-bPrP~c融合蛋白突破小鼠免疫耐受产生特异性抗体 |
| 3.4.2 scFv基因设计和构建 |
| 3.4.3 ScFv噬菌体抗体库的构建 |
| 3.4.4 scFv抗体库的富集筛选及鉴定 |
| 3.4.5 scFv测序 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 牛朊蛋白单链抗体及其融合蛋白的特性研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株与质粒 |
| 4.2.2 培养基 |
| 4.2.3 试剂与材料 |
| 4.2.4 单链抗体及其融合蛋白表达载体的构建 |
| 4.2.5 大肠杆菌的转化 |
| 4.2.6 融合蛋白的诱导表达 |
| 4.2.7 融合蛋白的纯化 |
| 4.2.8 蛋白质的浓度测定 |
| 4.2.9 单链抗体Z163、Z186和Z1030抗原活性鉴定 |
| 4.2.10 融合蛋白Z163-L-SBP和Z186-L-SBP的SBP活性的检测 |
| 4.2.11 融合蛋白Z163-L-SBP和Z186-L-SBP的抗原活性的检测 |
| 4.2.12 融合蛋白Z163-Fc和Z1030-Fc的Fc活性 |
| 4.2.13 融合蛋白Z163-Fc和Z1030-Fc的抗原活性的检测 |
| 4.2.14 单链抗体融合蛋白识别bPrP27-30的线性表位 |
| 4.2.15 通过夹心ELISA筛选抗体配对 |
| 4.2.16 SPR方法测定单链抗体及其融合蛋白的亲和力 |
| 4.2.17 SPR方法测定与Z186融合后SBP与streptavidin的亲和力 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 单链抗体Z163、Z186和Z1030表达载体的验证 |
| 4.3.2 单链抗体融合蛋白Z163-L-SBP和Z186-L-SBP表达载体的验证 |
| 4.3.3 单链抗体融合蛋白Z163-Fc和Z1030-Fc表达载体的验证 |
| 4.3.4 单链抗体及其融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达和纯化 |
| 4.3.5 单链抗体Z163、Z186和Z1030抗牛朊蛋白活性鉴定 |
| 4.3.6 融合蛋白Z163-L-SBP和Z186-L-SBP的SBP活性鉴定 |
| 4.3.7 融合蛋白Z163-L-SBP和Z186-L-SBP抗牛朊蛋白活性鉴定 |
| 4.3.8 融合蛋白Z163-Fc和Z1030-Fc的Fc活性鉴定 |
| 4.3.9 融合蛋白Z163-Fc和Z1030-Fc的抗牛朊蛋白活性鉴定 |
| 4.3.10 单链抗体特异识别牛朊蛋白核心区(bPrP27-30)的线性表位 |
| 4.3.11 夹心ELISA筛选单链抗体融合蛋白与单克隆抗体配对和单链抗体融合蛋白配对 |
| 4.3.12 SPR方法测定抗体的亲和力 |
| 4.3.13 SPR方法测定Z186-L-SBP中SBP与streptavidin的亲和力 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 单链抗体与SBP融合的特点 |
| 4.4.2 单链抗体与Fc融合的特点 |
| 4.4.3 单链抗体特异识别牛朊蛋白核心区线性表位的应用价值 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 夹心抗体芯片检测朊蛋白的研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 单抗KG9在多聚赖氨酸包被的芯片上的共价固定 |
| 5.2.3 单链抗体融合蛋白scFv-L-SBP的定向固定 |
| 5.2.4 单链抗体融合蛋白Z163-Fc的Cy3荧光标记和纯化 |
| 5.2.5 鼠脑组织细胞膜的提取 |
| 5.2.6 基于单抗和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片的产生和评价 |
| 5.2.7 基于两种单链抗体融合蛋白的双单链抗体夹心抗体芯片的产生和评价 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 基于单抗和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片的专一性 |
| 5.3.2 基于单抗和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片的灵敏度 |
| 5.3.3 基于单抗和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片检测鼠朊蛋白 |
| 5.3.4 基于双单链抗体融合蛋白夹心抗体芯片的专一性 |
| 5.3.5 基于双单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片的灵敏度 |
| 5.3.6 基于单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片检测鼠朊蛋白 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 基于单抗和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片的特点 |
| 5.4.2 基于双单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片的特点 |
| 5.5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士在读期间已发表和待发表论文题录 |
四、人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的体外分子进化（论文参考文献）
- [1]ICOSL分子的克隆表达及ICOSL核糖体单链抗体库的构建及筛选[D]. 严浩. 南京师范大学, 2014(12)
- [2]工程化的人抗人IgE抗体的制备[D]. 杨彬. 复旦大学, 2011(02)
- [3]人源性抗FGF-2中和性抗体的筛选，表达及鉴定[D]. 陶俊. 南方医科大学, 2010(12)
- [4]计算机辅助设计进行抗VEGF抗体体外亲和力成熟[D]. 曾大地. 中国人民解放军军事医学科学院, 2010(04)
- [5]核糖体展示人单链抗体库的构建及抗HCVNS5B蛋白的ScFv的筛选[D]. 田江红. 第四军医大学, 2010(06)
- [6]核酸信标配基的构建、合成、活性鉴定及检测技术的研究[D]. 廖世奇. 西北师范大学, 2008(03)
- [7]全合成人源抗体库的构建及抗BHL-1单链抗体的初步筛选[D]. 朱琳琳. 吉林大学, 2006(10)
- [8]重组基因工程抗体和蛇毒C型凝集素类似蛋白在毕赤酵母中表达及结构功能研究[D]. 胡思怡. 中国科学技术大学, 2006(04)
- [9]抗—牛朊蛋白单链抗体检测系统的构建、表征与应用[D]. 张吉斌. 华中农业大学, 2006(01)
- [10]重组单链抗体-低分子质量尿激酶融合蛋白在CHO细胞中的抗降解研究[J]. 刘志刚,林建波,杜韫,俞炜源. 生物化学与生物物理进展, 2005(06)