一、用T7噬菌体展示系统筛选与晚期糖基化终产物受体胞内段相结合的蛋白（论文文献综述）
曾冬[1]（2020）在《造血干细胞S100A8特异性敲除鼠表型分析及S100A8对红系前体细胞发育的影响探讨》文中提出研究背景:贫血是肿瘤患者常见的并发症,高达40%的恶性肿瘤患者在接受治疗前已合并贫血,即恶性肿瘤所致贫血。已有众多研究证实,肿瘤合并贫血患者预后差,抗感染及抗瘤免疫应答能力显着低下,是影响肿瘤患者不良预后的重要因素。因此,深入认识恶性肿瘤所致贫血对提高抗瘤疗效、延长患者生存预后具有重要意义。本课题组前期发现,在荷瘤机体中存在一个新的免疫抑制细胞群体:CD45阳性红系前体细胞（Erythroid progenitor cells,CD45+EPCs）,其不能正常分化成为成熟红细胞,而发挥着类似髓系细胞的免疫抑制作用,不仅是抗瘤免疫应答缺陷的重要因素之一,也是晚期荷瘤机体贫血发生的重要原因之一。该群细胞可显着抑制CD8+T细胞抗瘤免疫应答,并且成熟分化能力显着降低。因此深入探讨CD45+EPCs分化受阻的原因及机制是解除宿主贫血状态的关键。前期有研究报道Rps14缺失引起的髓系细胞S100A8表达增加,进一步诱导P53信号通路活化是巨幼细胞性贫血患者红系分化受阻的分子机制,且加入外源性重组S100A8处理正常的小鼠来源的造血祖细胞（Hematopoietic progenitor cells,HPCs）细胞,可复制Rps14缺失所致的红系分化受阻,提示S100A8活化P53通路在红系分化受阻中发挥了重要作用。然而,对于荷瘤情况下S100A8对于红系分化发育的具体作用尚不明确。更为重要的是,在荷瘤状态下机体脾脏、外周血中S100A8水平明显升高。为此,本研究拟从S100A8出发,探讨其在荷瘤情况下红系前体细胞发育障碍中的可能。因此,在本研究中,我们通过研究S100A8及其受体在CD45+EPCs表达情况、构建造血干细胞S100A8基因特异性敲除鼠并进行初步表型分析及研究EPCs分化发育情况,探索研究S100A8对于红系分化发育的影响。通过本研究,可探索S100A8在红系分化发育中的作用,为后续的研究提供理论基础。方法:1分析荷瘤鼠和癌性贫血患者CD45+EPCs表达S100A8及受体情况1.1分析CD45+EPCs成熟分化能力;1.2分析荷瘤鼠和贫血患者CD45+EPCs表达S100A8及受体情况;2造血干细胞S100A8特异性敲除鼠的构建2.1委托北京百奥赛图公司构建造血干细胞S100A8特异性敲除鼠;2.2造血干细胞S100A8特异性敲除鼠的鉴定;2.3造血干细胞S100A8特异性敲除鼠初步表型分析。3研究分析自然和贫血状态下造血干细胞S100A8特异性敲除对红系分化的影响3.1分析自然状态下外周血和脾脏EPCs比例;3.2分析自然状态下尾静脉血血红蛋白（Hemoglobin,HGB）、红细胞（Red blood cell,RBC）、平均红细胞体积（Mean corpuscular volume,MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（Mean corpuscular hemoglobin,MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（Mean corpuscular hemoglobin concentration,MCHC）和血细胞比容（Hematocrit,HCT）水平;3.3分析自然状态下细胞形态变化;3.4分析贫血模型下EPCs和HGB、RBC、MCV、MCH、MCHC和HCT水平。4研究分析荷瘤状况下造血干细胞S100A8特异性敲除对红系分化的影响4.1分析肿瘤体积;4.2分析尾静脉血EPCs比例;4.3检测分析尾静脉血HGB和RBC水平。结果:1 CD45+EPCs红系分化障碍,且表达S100A8及晚期糖基化终末产物受体1.1荷瘤鼠CD45+EPCs分化受阻;1.2荷瘤鼠CD45+EPCs高表达S100A8和晚期糖基化终末产物受体（Receptor of advanced glycation endproducts,RAGE）受体;1.3癌性贫血患者CD45+EPCs高表达S100A8和RAGE受体。2成功构建了造血干细胞S100A8特异性敲除鼠2.1委托北京百奥赛图公司成功地构建了造血干细胞S100A8特异性敲除鼠;2.2造血干细胞S100A8特异性敲除可对子代鼠部分表型产生影响。3在自然和贫血状态下,造血干细胞S100A8特异性敲除未对红系分化产生明显的影响3.1自然状态下外周血EPCs比例未见明显差异;3.2自然状态下脾脏组织EPCs比例未见明显差异;3.3自然状态下尾静脉血HGB、RBC、MCV、MCH、MCHC和HCT水平未见明显差异;3.4自然状态下脏器细胞形态结构发育正常;3.5贫血模型下EPCs比例未见明显差异;3.6贫血模型下尾静脉血HGB、RBC、MCV、MCH、MCHC和HCT水平未见明显差异;4在肿瘤微环境中,造血干细胞S100A8特异性敲除未对造血能力的产生明显影响4.1敲除型（Knock out,KO）鼠肿瘤体积高于野生型（Wild type,WT）鼠;4.2流式检测分析尾静脉血EPCs比例未见明显差异;4.3血球分析仪检测分析尾静脉血HGB和RBC变化比例未见明显差异。研究结论:1.首次成功构建了造血干细胞S100A8特异性敲除小鼠;2.造血干细胞S100A8特异性敲除未对红系前体细胞分化发育产生明显影响;3.造血干细胞S100A8特异性敲除可对小鼠毛发和体重等表型产生影响,KO鼠肿瘤体积高于WT鼠。
杨柳[2]（2019）在《TIM-3单域抗体的制备及其功能研究》文中研究指明肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一。近年来以嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）和免疫检查点抑制剂型抗体为代表的肿瘤免疫治疗技术为肿瘤的治疗带来了革命性的进步。免疫检查点是表达在免疫细胞（T细胞、单核/巨噬细胞）表面的一类调节蛋白,肿瘤细胞表面高表达的抑制性配体与免疫检查点蛋白结合后可以抑制免疫细胞的活性,帮助肿瘤细胞逃避免疫系统的监视。靶向免疫检查点的单克隆抗体可以阻断肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用,强化免疫细胞的抗肿瘤活性。目前已经有多个靶向免疫检查点CTLA-4和PD-1的单抗药物被FDA批准,还有更多的免疫检查点被陆续鉴定,这些新的免疫检查点是抗体药物研发的重要靶点,TIM-3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3）就是其中的一个代表。TIM-3最初发现表达在产生IFNγ的CD4+辅助性T细胞（Th1）和CD8+杀伤性T细胞（Tc1）上,后来在Th17细胞、Treg细胞和先天免疫细胞（DC、NK细胞、单核细胞）上也发现了TIM-3的表达。TIM-3的配体是Galectin-9（beta-galactoside lectin protein）,后者高表达于淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌等多种肿瘤类型中。Galectin-9与TIM-3结合后能够引起T细胞的功能耗竭。靶向TIM-3的单克隆抗体能阻断这个过程的发生。传统的单克隆抗体有VH和VL两个抗原结合域,分子量比较大,而小型化的VH单域抗体（domain antibody）具有多方面的独特优势,比如更强的组织渗透性（tissue penetration）,更容易改型和用以构建多特异性抗体等。在抗体药物研发中最具吸引力的单域抗体是骆驼来源的VHH抗体（也称纳米抗体）、人源和兔源的VH domain。本课题的主要研究内容是以TIM-3为靶点,采用重组TIM-3蛋白免疫家兔和噬菌体展示相结合的技术,制备靶向TIM-3的VH单域抗体,为研发小型化的TIM-3抗体药物奠定基础。取得的主要结果如下。1)克隆了TIM-3和Galectin-9的cDNA,构建了TIM-3胞外域、Galectin-9全长蛋白的表达质粒和TIM-3全长蛋白的慢病毒表达载体。以人胚肾细胞HEK293F细胞为表达系统,表达纯化了TIM-3胞外域和Galectin-9蛋白。以慢病毒为载体,构建了超表达TIM-3全长蛋白的A431细胞。2)以TIM-3胞外域作为免疫原,免疫家兔,获得了效价超过100000的兔多抗血清。3)以免疫后家兔的脾脏为材料,提取总RNA,经过反转录和PCR扩增,构建了噬菌体展示的兔VH单域抗体文库,最后经过TIM-3胞外域亲和淘选,获得了5个TIM-3特异性的VH单域抗体序列,分别命名为TIM3-R1,TIM3-R6,TIM3-R23,TIM3-29,TIM3-R53,从序列多样性看,代表了3种明显不同的结构类型（R1,R23,R53）。4)利用大肠杆菌和哺乳动物细胞细胞表达系统,表达纯化了这些单域抗体,采用ELISA、Western Blot、Flow Cytometry等方法确定了TIM-3单域抗体结合重组TIM-3蛋白和细胞膜TIM-3蛋白的亲和力和特异性。根据ELISA方法测得的单域抗体对重组TIM-3的Kd值（EC50）范围为278-8740nM,结合活性最强的为R53,Kd值为278 nM,而重组Galectin-9在同样条件下对TIM-3的Kd值经测定为204 nM,其余单抗的亲和力均低于Galectin-9。Flowcytometry证实R53单抗具有明显的细胞结合活性。5)ELISA竞争结合实验显示,2个TIM-3单抗（R23,R53）能够阻断Galectin-9和TIM-3的结合,R53的阻断活性强于R23,两者在1-200μg/mL的范围呈现浓度梯度依赖性的阻断效应。其余3个单抗没有显示出阻断活性。6)以CAR-T细胞为模型,在细胞水平上研究了TIM-3单抗对CAR-T细胞肿瘤杀伤活性的影响。通过激活PBMC细胞,CAR病毒感染PBMC细胞,构建CAR-T细胞,流式分析证实CAR-T细胞能够表达TIM-3。将TIM-3单抗与CAR-T细胞、带有Luciferase标记的H9肿瘤细胞共同孵育,结果发现,R53单抗在10ng/mL以上的浓度下可以显着提高CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性,肿瘤杀伤活性提高了25%。7)以移植瘤小鼠为模型,研究了R53单抗在小鼠体内对CAR-T细胞抑瘤活性的影响。在裸鼠皮下接种表皮癌H9细胞,待成瘤后,分别用CAR-T细胞、CAR-T细胞联合R53单抗进行治疗,观察肿瘤生长速率,结果发现TIM-3单抗可以提高CAR-T细胞的抑瘤活性,TIM-3单抗联合CAR-T治疗可以使肿瘤的生长速率更缓慢。总之,本课题成功地制备了能够阻断Galectin-9和免疫检查点TIM-3结合的单域抗体,并对这些单域抗体的性质和抗肿瘤活性进行了初步的研究,这些研究结果将为研发靶向TIM-3的肿瘤治疗性抗体奠定坚实的基础。
史云凤[3]（2019）在《糖基化反应对花生过敏原Ara h 1致敏性的影响及机理研究》文中指出花生过敏影响全世界约5%的儿童和1.42%的成人的健康,是人类健康的重大威胁之一,其中Ara h 1是花生主要过敏原之一。已有的研究显示热处理会改变花生的致敏性,实验室前期研究结果表明,水煮和油炸会导致花生致敏性降低,而烘烤处理可以使花生致敏性升高,推测烘烤时发生的糖基化反应影响了花生过敏原的致敏性。故本文以花生Ara h 1蛋白为研究对象,原核表达重组Ara h 1蛋白,用干热法模拟糖基化反应获取终末糖基化Ara h 1蛋白,并分析了干热处理导致Ara h 1蛋白结构的改变;进一步以BALB/c小鼠和RBL细胞为致敏性评估模型综合评估糖基化对花生Ara h 1致敏性的影响;并在此基础上研究了糖基化修饰影响Ara h 1致敏性的机理,揭示了糖基化修饰对过敏原在过敏反应的各个阶段产生的影响。主要研究内容和结论如下:1重组花生Ara h 1蛋白和糖基化Ara h 1蛋白的获取提取花生总RNA,反转录为cDNA,PCR扩增得到Ara h 1基因序列,将该序列克隆至pET-28a载体中,构建Ara h 1-pET-28a表达载体,进行验证和测序,将测序成功的质粒转入Rosetta（DE3）表达宿主菌中诱导表达,将以包涵体形式表达的重组蛋白溶解后透析复性,镍柱纯化获取重组蛋白,经质谱鉴定为重组花生Ara h 1蛋白（R-Ara h 1）。用干热处理模拟糖基化反应,随处理时间增长蛋白中游离氨基含量减少、结合糖含量增多,有果糖胺和高荧光水平小分子产生,推测有糖基化反应发生,质谱检测和ELISA结果表明,在100℃干热处60min后有终末糖基化特征结构产生,表明获取了终末糖基化Ara h 1蛋白（AGE-Ara h 1）。2糖基化修饰对重组花生Ara h 1蛋白致敏性影响的研究用BALB/c小鼠和RBL细胞致敏性评估模型分别研究了糖基化修饰的重组花生Ara h 1蛋白的致敏性。用AGE-Ara h 1蛋白以皮下注射的方式免疫BALB/c小鼠,结果表明与对照R-Ara h 1相比,AGE-Ara h 1致敏的小鼠体重增长率较低,脾脏质量分数较高,空肠和肺出现了更严重的炎性浸润和充血现象,腹腔灌洗液中的肥大细胞和嗜碱性粒细胞有更高程度的脱颗粒现象;此外小鼠血清中有更高含量Th2型细胞因子（IL-4、IL-5、IL-13）、特异性抗体（IgE、IgG）和组胺,小肠和肺中有更高水平的TSLP基因表达,表明糖基化组小鼠体内有更严重的Th2型过敏反应;RBL细胞实验表明,AGE-Ara h 1致敏的小鼠血清有更高的使RBL脱颗粒能力。综上所述,AGE-Ara h 1致敏性更高,即糖基化修饰上调了R-Ara h 1蛋白的致敏性。3糖基化反应上调花生Ara h 1蛋白致敏性的机理研究本文通过模拟胃液消化实验、IgE结合力实验和树突细胞、RBL细胞模型分析了糖基化反应对重组Ara h 1蛋白在过敏反应不同阶段产生的影响,结果表明糖基化修饰使花生Ara h 1抗消化能力上升;树突细胞对糖基化Ara h 1有更高的摄取能力,且糖基化Ara h 1可上调树突细胞RAGE表达和IL-10释放;最后虽然糖基化使Ara h 1与IgE的结合能力略有下降,但增加了使RBL细胞脱颗粒的能力,进而引发更严重的过敏反应。
孙得良[4]（2016）在《24-脱氢胆固醇还原酶（DHCR24）相互作用蛋白的初步筛选研究》文中研究说明阿尔茨海默病（Alzheimer’s diseases, AD）是一种缓慢发展的临床上以进行性的认知损害、记忆缺失和人格改变为特征的神经退行性疾病,其与大脑及神经组织中异常的胆固醇代谢有关。24-脱氢胆固醇还原酶（DHCR24）是人体合成胆固醇最终阶段的酶,能够催化链甾醇还原为胆固醇。阿尔茨海默病相关蛋白24-脱氢胆固醇还原酶（DHCR24）是一个广泛表达的,兼具胆固醇合成功能以及抗细胞凋亡等多样化生理功能的蛋白,其神经细胞保护作用得到公认,但其在信号转导通路中的位置和功能尚未明确。为高通量筛选与DHCR24有相互作用的蛋白质,进一步揭示DHCR24影响细胞命运的分子机制,本次实验拟体外表达并纯化获得人源DHCR24蛋白,并在此基础上联合采用以DHCR24蛋白为诱饵的免疫共沉淀联合质谱分析技术及人脑cDNA文库T7噬菌体展示技术,初步筛选与DHCR24发生相互作用的候选蛋白。首先,我们以质粒pcDNA3.1a-DHCR24和pT7CFE1-CHis为原料构建质粒PT7CFE1-HIS-DHCR24,通过蛋白体外表达系统得到过表达的DHCR24蛋白。利用免疫沉淀技术用已知可以和DHCR24相互作用的MDM2蛋白验证体外表达的DHCR24的功能；DHCR24功能得到确认后,进行免疫共沉淀联合蛋白质谱实验并进行分析,得到了部分可能与DHCR24相互作用的候选蛋白质。另外,我们再以体外表达得到的DHCR24进行蛋白包被,使用人脑cDNA文库T7噬菌体展示技术,筛选与DHCR24相互作用的蛋白质。将两部分得到的数据进行综合分析,确定与DHCR24存在相互作用的候选蛋白质。综上所述,本论文以pT7CFEl-HIS-DHCR24重组质粒的DHCR24蛋白体外蛋白表达及纯化为基础,证明重组质粒体外过表达的DHCR24具有良好的与其相互作用蛋白结合活性,并进行了以DHCR24蛋白为诱饵蛋白的免疫沉淀联合质谱分析筛选DHCR24互作候选蛋白和噬菌体展示实验并初步确定了与DHCR24相互作用的候选蛋白,为进一步研究DHCR24相互作用蛋白并理解DHCR24的神经保护作用的机制奠定了基础。
唐瑞,杨勇波[5]（2014）在《噬菌体展示技术筛选人肠道病毒71型3A蛋白相互作用蛋白》文中研究表明目的利用T7噬菌体展示技术筛选与人肠道病毒71型3A蛋白相互作用的蛋白。方法构建3A蛋白的原核表达载体,表达并纯化3A蛋白,以3A蛋白为靶蛋白,应用T7噬菌体展示技术对人肝细胞cDNA文库进行筛选,对筛选到产物进行DNA序列分析及同源性研究。结果表达并纯化了3A蛋白,经过4轮筛选后,选择37个阳性克隆,采用T7特异性引物扩增插入片段,将PCR产物送公司进行测序。经过同源性分析,确定了2个与人肠道病毒3A蛋白相互作用蛋白。结论通过T7噬菌体展示技术可以得到与3A蛋白相互作用蛋白,通过研究此蛋白的功能就可以初步推测出3A蛋白可能的功能,为进一步研究人肠道病毒的致病机制鉴定了基础。
洪英洽[6]（2013）在《晚期糖基化终产物受体通过AKT通路作用视网膜母细胞瘤蛋白促进前列腺癌的增殖及机制研究》文中认为背景前列腺癌是男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一,在癌症的分类上,前列腺癌是全球第六大癌症,又是全球男性第二大癌症。同时其发病率增长速度也明显增快,由2001年的第8位上升到了2010年的第6位。欧美国家发病率在100/10万以上,美国年发病13万例。虽然欧美国家发病率显着高于我国,但一些大城市的流行病学调查表明,目前前列腺癌的发病率已经直追欧美国家。前列腺癌发病率在我国显着增长可能跟人口的老龄化、饮食结构的改变、生活环境的污染以及检测技术的发展息息相关。随着前列腺癌发病率的显着增长,对前列腺癌的研究也越来越多。目前对前列腺癌发病机制研究的主要方面在细胞调节信号通路和雄激素受体的突变、基因扩增上。其中研究的热点主要集中在对前列腺癌的发病机制中信号传导通路的研究,因为它是从分子水平层面上得到更多疾病的发生与发展的信息,为彻底治疗疾病提供良好的依据。某些研究表明,原癌基因ras、Fos、c-my、c-met、 Bcl-2等的激活和表达上调,抑癌基因Rt、p53、p16、PTEN、CDKN2等的失活、蛋白AR （androgen receptor,雄激素受体）、前列腺干细胞抗原（prostate stem cell antigen, PSCA）等的异常表达以及启动子甲基化及DNA损伤应答通路异常可能参与前列腺癌发生发展的过程中。而最近研究发现,晚期糖基化终产物受体（receptor for advanced glycation end products, RAGE）与前列腺癌也密切相关。晚期糖基化终产物受体（receptor for advanced glycation end products, RAGE）是晚期糖基化终产物（advanced end products, AGE）的受体,其编码基因位于III类主要组织相容性复合物（maj or histocompatibility complex, MHC III）区域。RAGE最早在1992年报导,且在过去的20年里,它被认为在糖尿病、败血症、炎症和肿瘤发展中有重要作用。现有研究已经证实,RAGE作为信号通路的一个转导受体和其配体在单核巨噬细胞、血管内皮细胞、神经细胞、血管平滑肌细胞及多种肿瘤细胞表面结合,从而激活内部各种信号转导机制,发生病理效应。RAGE在肿瘤的作用是近十多年才发现的,目前的研究表明,RAGE在除肺癌之外的许多肿瘤表达上调,并且与肿瘤的发生、发展和不良预后密切关联。我们前期的研究表明,RAGE可能与视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma Protein, Rb）蛋白相互作用促进前列腺癌的增殖。Rb基因是人类最早发现的一种抑癌基因,基因产物是110kd的具有DNA结合能力的核磷蛋白质,参与细胞周期的调节对细胞生长起负调控作用。未磷酸化的Rb蛋白起抗癌作用,而磷酸化的Rb蛋白则没有这个作用。Rb蛋白和转录因子E2F结合并抑制其活性,使细胞停滞在G1期,从而抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,而Rb蛋白被磷酸化时,就会从转录因子E2F解离下来,导致促使DNA合成相关的酶的转录启动,使细胞从G1期进入S期,引起细胞增殖。前列腺癌中大多数Rb等位基因丢失而导致Rb蛋白作用丧失。同时在60%前列腺癌临床病例可观察到Rb杂合子的丢失。Maddison的研究表明,Rb的失活引起E2F表达增多,促进前列腺癌的发生发展和转移。Taneja SS等研究表明在泛素-蛋白酶体系统降解Rb蛋白的过程中,可能有雄激素的参与,且其降解过程可为cyclin A/Cdk2和cyclin B/Cdk1诱导的Rb磷酸化所加速,从而促进了]LNCaP细胞的生长。也有研究表明Rb蛋白能够与雄激素受体蛋白特异性结合增强雄激素受体的转录活性,从而促进前列腺癌的发生发展。在我们前期的工作中,我们证实AGE与RAGE间相互作用能促进前列腺癌细胞的增殖,且这种作用可能跟RB蛋白的表达有关,但是具体的作用方式尚未清楚。Ning等人的研究证明,跟细胞周期调控有关的某些蛋白如RB可能受AKT信号通路调控,我们推测RB蛋白的变化可能是通过AKT通路引起的。Akt是存在于人类染色体中的病毒原癌基因v-Akt的同源物,本质也是一种原癌基因；其编码的蛋白质产物PKB是分子量约为57kd的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,为PI3K/Akt信号转导通路中的核心蛋白。Akt家族的成员有Aktl/PKBa, Akt2/PKBp, Akt3/PKB7三种亚型,分别定位于14q32.32,19q13.1-q13.2,1q44。Akt三个亚型均能活化下游底物,其中又以Akt2的作用最明显。Sale利用亚型特异的反义寡核苷酸探针策略对Akt及其三个亚型的功能进行研究,Akt的三个亚型不但有80%以上的同源性的氨基酸序列,而且均有共同结构特征。其共同结构特征包括三个不同的功能区域,分别为氨基末端的PH区域、中央区的重要激酶区以及羧基末端的调节区。这三个功能区在PI3K/Akt信号转导通路中分别担当着重要的作用。PH区域由约100个氨基酸序列和3-磷酸肌醇结合区域组成,主要调节蛋白质-脂质和蛋白质-蛋白质的相互作用；中央区的重要激酶区与PKA、PKC有高度的相似性,Akt部分活化所必需的Thr-308位于该区域；羧基末端的调节区由40个氨基酸系列组成,其中包含有蛋白激酶的一个特征性疏水基序F-X-X-F/Y-S/T-Y/F（X是任意氨基酸）,Akt完全活化所必需的丝/苏氨酸残基的磷酸化也位于这个区域。研究表明,Akt的活化参与肿瘤的发生发展。可能的主要机制是由于基因PIK3CA编码的PI3K蛋白的扩增和其他各种因素导致的Akt的过度活化,或者是缺失了某些调控成分的功能,如PTEN。在前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、滤泡状甲状腺癌、多发性骨髓瘤、恶性黑色素瘤中都存在Akt的过度表达,而约50%～80%进展期前列腺癌患者中存在PTEN功能的缺失,从而导致了第二信使（PIP3）的过量表达,引起Akt蛋白的过度激活,增强前列腺癌细胞的存活。Gao等证实了在前列腺癌患者中Aktl通过干扰APC/Cdh1与Skp2结合从而促进肿瘤的进展。在肿瘤的发生发展过程中,Akt除了促进细胞生长、增殖外,还抑制细胞凋亡。Akt通过多种途径抑制细胞凋亡。同时AKT跟凋亡有关的多个家族和蛋白之间存在相互作用,如Bcl-2家族、Foxo家族、IAPs（inhibitor of apop-tosis proteins）和caspase-9。总之,细胞存活通路PI3K/Akt中的重要分子-AKT,在促进细胞生长和增殖、侵袭和浸润,以及抑制细胞凋亡中起着核心的作用。我们已经初步证明了RAGE与Rb蛋白在前列腺癌中存在某种关系,但两者之间的这种相互作用是直接的还是间接的,它们发生联系是依靠何种方式,有什么信号通路参与其中,且这种相互作用对前列腺的发生发展有何意义?当弄清楚这些问题的答案时,我们不但能够更清楚理解RAGE及Rb蛋白的功能,而且将对前列腺癌乃至其它相关疾病的发生发展及预防诊治提供新的思路和理论依据。方法基于以上认识,本研究首先进行用Western Blotting检测前列腺癌细胞系PC-3细胞中的胞质和胞核中RAGE的表达,以明确RAGE的定位,同时推测RAGE与RB蛋白的作用方式；接着我们用AGEs对前列腺癌进行不同时间段和不同浓度刺激,以观察前列腺癌细胞中Rb蛋白及RB蛋白磷酸化Ser-807/811位点的表达情况。然后我们检测同一条件下,AKT蛋白及AKT蛋白磷酸化Ser473、Thr308位点的表达情况。我们在PC-3细胞中转染了干扰RB蛋白的RNA小片段,以寻求一种阻断RB蛋白表达的方法。最后我们构建缺失RAGE胞外段不同功能段V/VC1的真核表达载体,以确定RAGE与Rb蛋白两者间相互作用的条件。结果通过以上研究,我们得到了以下结论：1、证实RAGE主要在前列腺癌细胞的细胞浆中分布；2、初步证实AGEs刺激PC-3细胞能导致RB蛋白的表达下调及磷酸化增强,Rb蛋白的表达下调及磷酸化增强可能通过是RAGE与AGEs作用所激活的AKT信号通路所介导的；3、初步证实AGEs刺激PC-3细胞能导致AKT蛋白的磷酸化增强,AKT蛋白磷酸化增强是可能通过RAGE与AGEs作用所激活的；4、成功干扰了前列腺癌中RB蛋白的表达；5、成功地构建了缺失RAGE胞外段不同功能段V/VC1的真核表达载体,其能够在PC-3细胞中表达。结论本研究对RAGE与Rb蛋白的相互作用方式进行了初步研究。AGEs与前列腺癌细胞的RAGE受体结合,导致AKT蛋白的活化及磷酸化增强,AKT通路被激活,从而导致Rb蛋白的下调及磷酸化增强,促进前列腺癌的增殖。这些研究结果不但加深了我们对RAGE与Rb蛋白生物学功能的认识,而且还有可能从根本上影响和改变临床上对前列腺癌的认识和治疗方案,因此具有极为重要的基础理论和临床治疗意义。
姚毅冰[7]（2012）在《肺癌早诊蛋白质谱的筛查鉴定及SWI/SNF染色质重组复合物失调研究》文中进行了进一步梳理目的:鉴定出一组可能会作为非小细胞肺癌（NSCLC）早期诊断生物标志物的肿瘤相关自身抗体。背景:肺癌包括小细胞肺癌（SCLC）的和非小细胞肺癌,后者约占所有肺癌类型的80%。肺癌是全球癌症相关死亡的首要病因,因为大多数肺癌在诊断时已经出现晚期转移。最近的研究表明,肺癌患者的外周血中存在肿瘤相关的特异性抗原的自身抗体,可用来作为一种肺癌早期检测的生物标志物。材料与方法:我们用20例非小细胞肺癌组织标本（Ⅰ至IV期）构建了一个噬菌体展示文库。然后用肺癌患者和正常健康对照血清对这个文库进行生物淘洗富集和血清免疫学分析。噬菌体表达肿瘤相关蛋白的初步挑选是建立在患者与正常健康对照组患者的血清抗体的亲和力差别的基础上。噬菌体表达蛋白的基因序列确认后,从非小细胞肺癌细胞株和组织标本的基因芯片中可以查找那些读码框内表达蛋白对应的基因表达水平。表达上调的基因编码的噬菌体表达蛋白被选定用于酶联免疫吸附测定（ELISA）。我们进一步用40例非小细胞肺癌患者和36例健康对照组血清来检测这些肿瘤相关自身抗体的有效性。逻辑回归模型（Logistic regression models）和弃一交叉验证法（Leave-one-out cross validation）被用来评估单一和联合标志物预测肺癌能力,而后一种统计方法也用于分析这些标志物与疾病分期的关系。结果:1、初步挑选了 148个肿瘤相关的噬菌体表达克隆,其中35个是单一的读码框内表达的噬菌体蛋白。2、经过基因芯片分析后,有4个蛋白质被选定用于进一步研究。3、Affymetrix基因芯片数据库表明,这4个噬菌体表达蛋白在非小细胞肺癌细胞株中的mRNA转录水平均高于正常的人支气管上皮细胞株（HBECs）（P<0.05）。4、Illumina基因芯片数据库显示,编号96-12和BT9-3的蛋白在非小细胞肺癌细胞株和83例非小细胞肺癌组织样本中的基因表达水平均显着高于正常的人支气管上皮细胞株/小支气管上皮细胞株（HSAECs）和83例配对良性肺组织（P<0.05）。5、逻辑回归分析这4个标志物联合预测非小细胞肺癌的灵敏性达47.5%,特异性达97.3%,而弃一交叉验证法检验得到66.7%的敏感性和60.0%特异性。6、受试者工作特征曲线分析和弃一交叉验证法均表明,4种抗体联合检测比任何单一抗体标志物能产生更好的预测准确度。弃一交叉验证还表明,4个联合标志物对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期非小细胞肺癌诊断的准确性分别达到63.6%,62.5%,82.4%和 50%。结论:（1）本研究证明了肺癌患者血清中自身抗体的存在;（2）成功筛选鉴定出4个可能与早期肿瘤产生的特异性自身抗体有关的肺癌相关蛋白,并且这组肿瘤相关的自身抗体可能会作为非小细胞肺癌（NSCLC）早期诊断的生物标志物。目的:研究肺癌中SWI/SNF染色质重组复合物异常调节的现象和机制,两个ATP酶催化蛋白BRG1（SMARCA4）和BRM（SMARCA2）,以及辅助蛋白BAF250a（ARID1A）是此项研究的重点。背景:每个哺乳动物细胞中的DNA被压缩成染色质时,体积缩小约5000倍,而在压缩状态的DNA是无法进行转录的。调控DNA压缩的三个机制中包括ATP依赖的染色质重组复合物SWI/SNF,它是由20个基因组编码的约12个蛋白质亚基组成,其中有些蛋白亚基可以互相替代。有超过280种可能的亚基排列影响转录,染色质的结合和重组,组织和基因特异性。有些亚基基因具有抑癌基因的功能,包括ATP酶催化蛋白BRG1（SMARCA4）和BRM（SMARCA2）,以及辅助蛋白BAF250a（ARID1A）。已有研究发现在包括肺癌的多种癌症中发现ATP酶催化蛋白失活,在卵巢癌中也发现BAF250a（ARID1A）频繁突变和蛋白缺失。材料与方法:（1）来自吸烟者与非吸烟者的101例肺癌细胞株和83例非小细胞肺癌及配对良性肺组织样本用于此项研究。（2）应用NextGen测序和Sanger测序技术用于对肺癌细胞株DNA的SWI/SNF染色质重组复合物基因进行测序。（3）应用Western Blot技术检测肺癌细胞株核蛋白提取物中部分SWI/SNF染色质重组复合物的蛋白表达水平。（4）应用化学诱导甲基化用于检测BRM蛋白缺失的细胞株。（5）应用基因芯片用于检测肺癌细胞株和组织样本中全基因组基因的表达水平。（6）应用单核苷酸多态性芯片分析用于检测肺癌细胞株和组织样本中全基因组基因的拷贝数变化。（7）应用免疫组化芯片染色用于对肺癌组织中BRG1和BAF250a的表达进行分析。结果:1、NextGen测序和Sanger测序证实SMARCA4和SMARCA2的突变率分别为28%（主要是纯合子缺失突变）和0%,ARID1A的突变率为11%（主要是杂合子点突变）。2、Western Blot检测证实BRG1和BRM蛋白表达缺失率分别为32.5%和25%,BAF250a的蛋白表达缺失率为23%,且这3个蛋白中至少有1个在41%的肺癌细胞株缺失,两个或两个以上蛋白缺失的细胞株比例为16%。3、基因芯片和免疫组化芯片的综合分析表明这3个基因在肺癌细胞株和组织中的表达水平普遍降低。4、单核苷酸多态性芯片分析DNA的拷贝数,表明组成SWI/SNF染色质重组复合物的多个基因有等位基因缺失。5、甲基化研究证实有些SWI/SNF染色质重组复合物异常调节与表观遗传有关。结论:（1）肺癌中存在SWI/SNF染色质重组复合物异常调节的现象,而且这种现象与多种机制有关,包括缺失,突变,表观遗传,转录和翻译控制等。（2）SWI/SNF染色质重组复合物异常调节可能为肺癌治疗提供新的靶点。
李炬聪[8]（2012）在《晚期糖基化终产物受体与视网膜母细胞瘤蛋白的相互作用对前列腺癌增殖的影响及机制研究》文中研究表明背景在全球范围内,前列腺癌的发病率居所有恶性肿瘤的第5位和男性恶性肿瘤的第2位。在美国,前列腺癌发病率在男性恶性肿瘤中已高居第一位,而死亡率则仅次于肺癌,居第二位。目前我国的前列腺癌发生率约为美国的1/10；但随着生活方式的西方化、人口的老龄化及前列腺癌肿瘤标志物如前列腺特异性抗原（prostate specific antigen, PSA）、前列腺干细胞抗原（prostate stem cell antigen, PSCA）、前列腺特异性膜抗原（prostate specific membrane antigen, PSMA）、DD3基因、人类腺体激肽释放酶-2（human kallikreins-2, hK2）、α-甲基-辅酶A消旋酶（Alpha-methylacyl-CoA racemase, AMACR）及尿激酶型纤溶酶原激活物系统等早期筛查技术的应用,前列腺癌的发病率和诊断率呈上升趋势。随着对前列腺癌研究的深入,多种与前列腺癌有关的基因及蛋白以及它们的作用机制受到关注,如：p53、p16、PTEN. NKX3.1、Rb、LKB1等抑癌基因的失活或缺失,C-MYC、met、ras等癌基因的异常表达,TMPRSS2:ERG等融合基因的异常表达,AR （androgen receptor,雄激素受体）、前列腺干细胞抗原（prostate stem cell antigen, PSCA）等蛋白异常表达、启动子甲基化及DNA损伤应答通路异常。但是,前列腺癌的发病机制及其发生发展的分子生物学基础仍不清楚。而最近研究发现,晚期糖基化终产物受体（receptor for advanced glycation end products, RAGE）与前列腺癌也密切相关。虽然RAGE最初是作为晚期糖基化终产物（advanced glycation end products, AGEs）受体被发现并因此得名,但其配体并不止一个,而是一个配体家族,除AGEs之外,还包括双性素（amphoterin）、β-淀粉样多肽（amyloid-P peptide）、钙结合蛋白家族（S100蛋白家族）、免疫球蛋白轻链以及朊病毒等,RAGE与各配体间的相互作用在肿瘤的发生发展及转移中起着重要的作用；阻断RAGE与其配体间的相互作用,能够抑制肿癌的生长和转移。而RAGE与前列腺癌的作用关系是最近才被发现的。研究对前列腺癌标本进行分析,发现癌组织中RAGE表达水平较正常组织较高,且在癌变程度较高或者已发生远处转移的标本中尤为明显；RAGE与amphoterin、AGEs、 S100A8、‘S100A9间相互作用对前列腺癌的发生、发展起着重要作用。除此之外,在雄激素阻断过程中,RAGE-amphoterin系统通过旁分泌途径促进肿癌细胞与间质细胞的相互作用,从而加速前列腺的发展和转移。Allmen等进一步研究证明RAGE胞外段的V区在整个RAGE蛋白中起主导调节作用,其与AGEs作用是介导前列腺癌生长所必须的。利用RNAi技术沉默RAGE的蛋白表达可介导前列腺癌细胞的凋亡,从而抑制前列腺癌细胞的增殖。然而,RAGE受到amphoterin、AGEs、S100A8、S100A9等各配体刺激后如何将细胞外信号转化为细胞内信号分子,细胞内信号分子又通过什么样的方式促进细胞的增殖等,这些问题至今尚未阐明。以往的工作中,我们已经成功构建了人RAGE胞内段的原核表达载体,并进行了人RAGE胞内段融合蛋白的表达与纯化,并利用T7噬菌体展示系统,初步筛选得到了25种与其有结合关系的蛋白或多肽。进而我们用ELISA法对这些蛋白或多肽进一步验证,并以BLAST软件在GenBank中对所得到的序列进行搜索和同源性分析,最终得到了9个为已知蛋白,其中一个便为视网膜母细胞瘤蛋白。Rb蛋白能够抑制前列腺癌细胞的生长与增殖。Tyagi A等以水飞蓟素（silibinin）刺激雄激素依赖型前列腺癌细胞LNCaP,下调CDK蛋白家族作用于Rb蛋白的丝氨酸位点从而抑制Rb蛋白磷酸化,从而促进了Rb蛋白与E2F蛋白结合,因此抑制前列腺癌的增殖。Rb蛋白还能特异性地与SV-40大T抗原,E1A和E7结合并起到抑制肿瘤活性的作用。但是在包括前列腺癌在内的多种肿瘤中,Rb蛋白的生物学功能常受到干扰或者丧失；而在前列腺癌中,大多数是由于Rb等位基因丢失导致Rb蛋白作用的丧失。Bookstein等研究发现前列腺癌细胞DU145的突变Rb蛋白丢失外显子21编码的35个氨基酸,但将Rb基因导入前列腺癌细胞DU145,随着正常Rb蛋白的表达前列腺癌细胞在裸鼠体内的致瘤性受到了明显的抑制,尽管DU145细胞的形态、生长速度均无变化。除此之外,Taneja SS等研究表明在雄激素作用下,泛素-蛋白酶体系统参与Rb蛋白的降解,而由cyclin A/Cdk2和cyclin B/Cdkl诱导的Rb磷酸化又加速了其降解过程,从而促进了LNCaP细胞的生长。也有研究表明Rb蛋白能够与雄激素受体蛋白特异性结合,该结合可以诱导雄激素受体的转录活性,从而促进前列腺癌的发生发展。我们已经初步证明了RAGE与Rb蛋白存在结合关系,但两者确切的相互作用关系还需要进一步的体内免疫共沉淀实验加以验证,并且两者相互作用的结构域是什么?Rb本身是一种核蛋白,它在与RAGE相互作用过程对前列腺癌又有怎样的生物学意义?对这些问题的回答,不仅能够阐明RAGE及Rb蛋白功能,而且将对前列腺癌乃至其它相关疾病的发生发展及预防诊治提供新的思路和理论依据。方法基于以上认识,本研究主要进行了以下实验：1、Western Blotting检测3种前列腺癌细胞系中RAGE与Rb蛋白的表达,以选择合适研究对象；2、利用CCK-8检测AGEs刺激下前列腺癌细胞的增殖情况；3、通过免疫共沉淀实验和免疫荧光实验,进一步确定RAGE与Rb蛋白在前列腺癌细胞中的相互作用；4、通过AGEs对前列腺癌进行不同时间段和不同浓度刺激,观察前列腺癌细胞中Rb蛋白的表达情况；5、最后我们构建RAGE胞外段不同功能段真核表达载体,进而观察RAGE与Rb蛋白两者间相互作用的结果域。结果1、验证RAGE蛋白在前列腺癌细胞系LNCaP、DU145、PC-3的表达,但只有在LNCaP、PC-3细胞中能检测到Rb蛋白表达,DU145细胞中未检测到Rb蛋白的表达；2、在前列腺癌LNCaP、PC-3细胞中AGE-BSA刺激组与BSA刺激组、空白对照组存在统计学差异（P<0.05）,BSA刺激组和空白对照组之间没有统计学差异（P>0.1）,说明AGE-BSA可能通过RAGE促进前列腺癌细胞的增殖；3.RAGE在前列腺癌LNCaP、PC-3细胞的细胞浆和细胞核中均有分布,内源性RAGE与Rb蛋白在两种前列腺癌细胞内均存在共定位,这表明两者间存在相互作用的可能；4、用RAGE抗体进行免疫共沉淀,沉淀下来的复合物存在Rb蛋白；用Rb抗体进行免疫共沉淀,沉淀下来的复合物存在RAGE。说明在前列腺癌LNCaP. PC-3细胞中内源性RAGE与Rb蛋白存在相互作用；5、给予400ng/ml及800ng/ml AGE-BSA刺激48h后,LNCaP细胞和PC-3细胞中Rb蛋白的表达明显下调,表达量随刺激浓度的增加而减少,而BSA对照组则没有出现表达下调现象；在不同时间点内给予400ng/ml AGE-BSA刺激LNCaP细胞和PC-3细胞,Rb蛋白的表达量随刺激时间的延长而减少,刺激72h后,Rb蛋白的表达明显下调；6、成功构建pcDNA3-HA-RAGEV和pcDNA3-HA-RAGEVC1重组质粒；7、转染后的质粒能在PC-3细胞中高效表达,且过表达的蛋白主要定位于细胞浆中。结论通过以上研究,我们得到了以下结论：1、初步证实AGE与RAGE间相互作用能促进前列腺癌细胞的增殖；2、证实RAGE在前列腺癌细胞的细胞浆和细胞核中均有分布,内源性RAGE与Rb蛋白在两种前列腺癌细胞内均存在共定位；3、证实在前列腺癌细胞中内源性RAGE与Rb蛋白存在相互作用；4、初步证实AGEs刺激前列腺癌细胞能导致Rb蛋白的表达下调,Rb蛋白的表达下调可能通过与RAGE司的相互作用而介导的。5、成功地构建了RAGE不同功能段V/VC1真核表达载体,其能够在前列腺癌细胞中表达。
方晨[9]（2011）在《Her2全人源抗体的制备及生物学功能研究》文中认为目的：Her2是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白,它的过表达与肿瘤形成、恶性程度及预后密切相关。本研究的目的是通过构建全人源大容量噬菌体抗体库从而筛选鉴定具有高效抗肿瘤活性的Her2全人源抗体。方法：本实验构建了全人源大容量噬菌体抗体库,表达纯化了人Her2膜外区蛋白（Her2ECD）,并利用Her2 ECD对噬菌体抗体库进行筛选,获得了异性结合Her2的噬菌体单链抗体ScFv,并构建完整L/pcDNA3.1（+）和H/pcDNA3.1（+）表达载体,在真核细胞CHO细胞中成功地表达了抗Her2抗体并对它们的体外抗肿瘤作用进行了研究。结果：我们制备的Her2抗体在体外能有效抑制乳腺癌细胞的MAPK、Akt信号通路,抑制Her2高表达乳腺癌细胞系SK-BR-3和BT-474的生长。结论：通过噬菌体抗体库的筛选,我们获得了具有抗肿瘤活性的Her2全人源抗体。
陆斌[10]（2010）在《晚期糖基化终产物受体在前列腺癌中的异常表达及其与视网膜母细胞瘤蛋白的相互作用》文中指出随着人类平均寿命的延长和诊断技术的不断提高,前列腺癌的发病率呈不断上升趋势。在美国,前列腺癌发病率在男性恶性肿瘤中居第一位,死亡率仅次于肺癌居第二位。在我国,前列腺癌的发病率虽低于西方国家,但随着生活方式的改变、人口的老龄化以及前列腺癌组织学肿瘤标志物等筛查技术的广泛应用,前列腺癌的发病率也在不断上升,目前已跃居男性泌尿生殖系统恶性肿瘤发病率第三位。前列腺癌的发病机制及发生发展的分子生物学基础至今仍不清楚。以往的研究表明,前列腺癌的发生发展与野生型p53、p16、PTEN、mn23、NKX3.1、Rb等抑癌基因的失活,c-myc、c-met、bcl-2、ras等癌基因的异常表达,AR、PSA、VDR等基因多态性及DNA甲基化等过程有关。而最近的研究表明,晚期糖基化终产物受体（receptor for advanced glycation end products, RAGE）也与前列腺癌的发病密切相关。2003年,Kuniyasu等对40名前列腺癌术后患者的标本进行分析,发现肿瘤细胞及间质细胞中的RAGE及其配体amphoterin共同表达且水平较高,对已有转移的患者尤为明显；通过进一步的细胞学实验,他们认为在雄激素阻断过程中,RAGE-amphoterin系统通过旁分泌途径促进肿瘤细胞与间质细胞的相互作用,从而加速前列腺的发展和转移。2005年,Ishiguro等和Hermani等也通过研究提出,RAGE与配体amphoterin、AGE、S100A8、S100A9的相互作用对前列腺癌的发生、发展均有重要作用。2008年Allmen等进一步证明RAGE胞外端的V区域是其与配体作用介导前列腺癌生长所必须的。对RAGE的进一步研究,不但有利于揭示前列腺癌的发病机制,而且对前列腺癌的预防、诊断和治疗都将产生积极意义。然而目前RAGE促进前列腺癌细胞生长的机制尚不清楚。Rb基因位于人13号染色体q14,含有27个外显子,转录4.7kb的mRNA,编码Rb蛋白（928个氨基酸）。Rb蛋白的活性可以调控细胞周期。大量研究表明,转录因子E2F与DNA启动子近端元件结合后,促进转录预始复合物（PIC）的组装,使结构基因稳定表达,从而促进细胞生长。Rb蛋白作为一种修饰蛋白,有磷酸化和去磷酸化两种形式,去磷酸化为其活性形式。去磷酸化Rb与转录因子E2F有亲和力,可与之形成复合体,从而阻断其与顺式作用元件的结合,进而阻遏基因的表达。如Rb蛋白与E2F结合后,可阻断编码DNA聚合酶、胸苷激酶、二氢叶酸还原酶等的相关基因的表达,使这些酶类不能合成,DNA的生物合成亦受阻,抑制了细胞的生长。近年的研究表明Rb蛋白与前列腺癌的发生密切相关,但具体作用方式及机制还不明确。多数研究显示Rb蛋白能够抑制前列腺癌细胞的生长与增殖。其抑癌作用主要通过两种途径实现：第一,Rb蛋白通过影响细胞周期抑制前列腺癌细胞的生长。Rb蛋白与E2F蛋白结合为复合体,使E2F失活；而E2F是细胞从G1期进入S期的决定因子,它能够诱导多种与细胞生长有关基因的表达。因此,前列腺癌细胞的增殖受到了抑制。也有研究也表明在雄激素作用下,Rb蛋白的降解促进了LNCaP细胞的生长,其降解过程与泛素化和26S蛋白酶体的参与有关,而由cyclin A/Cdk2和cyclin B/Cdk1诱导的Rb磷酸化加速了其降解过程。第二,Rb蛋白可以通过特异性结合肿瘤发生相关的蛋白抑制肿瘤细胞活性。Rb蛋白能特异性地与3种DNA肿瘤病毒（SV-40,腺病毒和人类16型乳头瘤状病毒）的转化蛋白结合,即与SV-40大T抗原,E1A和E7结合并起到抑制肿瘤活性的作用。前列腺癌细胞DU145的突变Rb蛋白因丢失外显子21编码的35个氨基酸而不能与SV-40大T抗原和腺病毒E1A形成复合物。总之,Rb蛋白在前列腺癌的发生发展中起到重要作用,对Rb蛋白的深入研究,对进一步探讨前列腺癌的发生机制、寻找更为效的预防和治疗措施都极具意义。以往的工作中,我们已经克隆了人RAGE胞内段的原核表达载体,成功进行了人RAGE胞内段融合蛋白的表达与纯化,并利用T7噬菌体展示系统,初步筛选得到了25种与其有结合关系的蛋白或多肽,进而用ELISA法对这些蛋白或多肽进一步验证,并以BLAST软件在GenBank中对所得到的序列进行搜索和同源性分析,最终得到了9个为已知蛋白,其中一个便为视网膜母细胞瘤蛋白。本研究在此基础上力求进一步验证RAGE与Rb的相互作用,进而研究其生理意义,从而揭示RAGE在前列腺癌发病中的作业与机制,为前列腺癌的治疗和预防提供新的理论依据。本研究采用免疫组化法检测了前列腺癌病理标本和正常前列腺组织中RAGE的表达,结果在10例正常前列腺和前列腺癌组织标本中均能检测到RAGE的表达,而且前列腺癌组织中RAGE的表达量显着高于其在正常前列腺组织中的表达。检测结果与体外细胞培养检查结果是相同的。由此我们推测RAGE蛋白与细胞增生活跃之间可能有一定的相关性。由于免疫组化法不能精确定量,为进一步明确RAGE的表达与前列腺癌的关系,我们采用实时荧光定量PCR,量化RAGE在上述不同前列腺组织中的表达。结果表明,前列腺癌中RAGE的mRNA表达水平显着高于正常前列腺组织RAGE的mRNA表达水平（t=8.130,P=0.000）,前列腺癌中RAGE的mRNA表达水平为正常前列腺组织中RAGE的：mRNA表达水平的4.22±1.25倍。在生物体内,mRNA的表达与蛋白质的表达丰度并不总是一致,而只有蛋白质才有生物学功能,因此我们用Western blot的方法,在正常前列腺和前列腺癌组织均检测到相对分子质量为46 kDa的蛋白质条带,这与期望的人RAGE蛋白分子量的大小是一致的,表明前列腺组织有RAGE蛋白质的内源性表达,统计分析结果表明前列腺癌中RAGE蛋白的表达水平显着高于正常前列腺组织RAGE蛋白的表达水平（t=12.458,P=0.000）,前列腺癌组织RAGE的表达量是正常前列腺组织的1.42±0.36倍（P=0.000）,以上实验结果说明RAGE在前列腺癌组织和正常前列腺组织的表达存在显着差异,RAGE在前列腺癌组织中的表达显着高于正常前列腺组织,提示RAGE可能在前列腺癌发病机制中起重要作用。RAGE在前列腺癌中高表达,其对前列腺癌的发生和发展有何作用?我们做了MTT实验检测其对前列腺癌细胞增殖的影响。检测结果显示RAGE与其配体AGE-HSA相互作用能够促进前列腺癌细胞的增殖,结果与文献报道的一致,显示RAGE确实在前列腺癌的发生和发展中起重要作用。在以往的文献报道中,RAGE主要表达于细胞膜上,而Rb主要分布于细胞核内,在前列腺癌中两者是否有空间上的重叠?我们对此进行了研究。在前面的免疫组化实验中我们发现细胞核是RAGE主要的显色部位,在细胞质中也有显色,即RAGE蛋白是在细胞核与细胞质上表达的,而不是特异性的表达在细胞膜,为进一步证实我们的结果,排除抗体特异性带来的影响,我们用商业化的抗体重复了免疫组化实验,得到类似的结果。为更直观的检测RAGE在前列腺癌中的分布,我们用免疫荧光法观测内源性RAGE在前列腺癌细胞PC-3中的分布,结果显示RAGE在PC-3细胞中是细胞浆和细胞核细胞都有分布,而在SW480细胞中RAGE在细胞膜上富集。免疫组化实验和免疫荧光实验结果表明RAGE广泛分布在前列腺癌细胞的细胞核和细胞浆中,并且这种分布具有一定的特异性,因此RAGE的分布与Rb的分布存在空间上的重叠,两者相互作用存在空间上的可能性。随后我们用Rb和RAGE的抗体做了免疫荧光实验,观测内源性的Rb和RAGE在PC-3细胞中的分布情况,观测两者是否有空间分布上的重叠。实验结果显示Rb主要分布于细胞核内,RAGE全细胞分布,在细胞核两者存在共定位现象,此现象表明Rb和RAGE在细胞核内能形成复合体,两者可能存在相互作用。蛋白质是生理功能的执行者,是生命现象的直接体现者,蛋白质与蛋白质相互作用是构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分,蛋白-蛋白相互作用网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法,是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。其主要优点为：相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态；蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响；可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。为进一步验证Rb和RAGE是否存在相互作用,我们决定做体内免疫共沉淀实验。首先我们从美国哈佛大学的Nick Dyson教授获得了携带Rb基因cDNA序列的pFAD102质粒。为便于后续实验的检测,我们对pFAD102质粒进行了改造,用PCR的方法在Rb编码序列的5’端加上了FLAG表位标签,使其变为CMV-FLAG-RB质粒。经过酶切鉴定和序列测定鉴定,证明CMV-FLAG-RB质粒的序列是完全正确的。接着我们将CMV-FLAG-RB质粒和pcDNA3-HA-RAGE质粒按照1：1的比例共转染HEK293细胞,分别在转染后24h,36h,48h用western blot检测Rb和RAGE的表达量,结果显示CMV-FLAG-RB和pcDNA3-HA-RAGE均能在HEK293细胞中表达,Rb和RAGE在转染36小时后共同表达效率最高；RAGE的表达效率比Rb高,故以后的实验均将CMV-FLAG-RB和pcDNA3-HA-RAGE按照3：2的比例共转染36小时后进行。综上所述,我们的研究证明了RAGE在前列腺癌细胞中存在异常表达,相对正常细胞不仅表达量增高,其细胞亚定位也发生了改变,并且在AGE的刺激下,RAGE能够促进前列腺癌细胞的增殖。同时异常定位的RAGE与Rb存在共定位现象。为进一步说明RAGE与Rb是否有相互作用,我们又构建了Rb的真核表达载体,但由于时间所限,目前尚未进行体内免疫共沉淀实验,需要进一步的研究以得到确切的结果。
二、用T7噬菌体展示系统筛选与晚期糖基化终产物受体胞内段相结合的蛋白（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用T7噬菌体展示系统筛选与晚期糖基化终产物受体胞内段相结合的蛋白（论文提纲范文）
（1）造血干细胞S100A8特异性敲除鼠表型分析及S100A8对红系前体细胞发育的影响探讨（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 CD45~+EPCs红系分化障碍,且表达S100A8及RAGE受体 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果及分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 成功构建造血干细胞S100A8特异性敲除鼠 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果及分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 自然和贫血状态下造血干细胞S100A8特异性敲除鼠未对造血能力产生影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 结果及分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 荷瘤状态下造血干细胞S100A8特异性敲除未对造血能力产生影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.3 结果及分析 |
| 5.4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 S100A8在炎症和肿瘤中研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表及撰写的文章 |
| 致谢 |
（2）TIM-3单域抗体的制备及其功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 免疫检查点抑制剂概述 |
| 1.2.2 TIM-3 研究进展 |
| 1.2.3 TIM-3/Galectin-9 通路与肿瘤免疫逃逸 |
| 1.2.4 抗体片段和单域抗体 |
| 1.2.5 噬菌体展示技术 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验仪器设备 |
| 2.3 实验试剂及配置方法 |
| 2.4 TIM-3 胞外域表达质粒构建 |
| 2.4.1 TIM-3 胞外域基因片段的扩增 |
| 2.4.2 表达载体的双酶切 |
| 2.4.3 TIM-3 胞外域PCR产物的酶切 |
| 2.4.4 TIM-3 胞外域基因片段与pc DNA3.1-simple载体连接 |
| 2.4.5 表达质粒的转化 |
| 2.4.6 转化子的菌液PCR验证 |
| 2.4.7 质粒的大量提取 |
| 2.5 TIM-3 胞外域的真核表达与纯化 |
| 2.5.1 HEK293 细胞的传代与转染 |
| 2.5.2 重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.5.3 重组蛋白的表征 |
| 2.6 TIM-3 重组蛋白免疫家兔 |
| 2.7 TIM-3 多抗血清的效价测定 |
| 2.8 全长TIM-3 超表达细胞系的构建 |
| 2.8.1 全长TIM-3 慢病毒型表达质粒的构建 |
| 2.8.2 慢病毒的包装 |
| 2.8.3 慢病毒感染A431 细胞 |
| 2.8.4 Western-Blot检测TIM-3 超表达细胞系 |
| 2.8.5 Flow Cytometry检测TIM-3 超表达细胞系 |
| 2.9 重组Galectin-9 表达质粒的构建 |
| 2.9.1 细胞总RNA的提取 |
| 2.9.2 反转录 |
| 2.9.3 Galectin-9 编码区的PCR扩增与载体构建 |
| 2.10 重组Galectin-9 的真核表达与纯化 |
| 2.11 噬菌体展示的TIM-3 单域抗体库的构建 |
| 2.11.1 家兔总RNA的提取 |
| 2.11.2 反转录 |
| 2.11.3 抗体VH可变区基因的扩增 |
| 2.11.4 抗体VH可变区基因与噬菌体载体的连接 |
| 2.11.5 连接产物的纯化 |
| 2.11.6 TG1 感受态细胞的制备 |
| 2.11.7 连接产物电转化 |
| 2.11.8 噬菌体滴度的测定 |
| 2.12 TIM-3 抗体文库的筛选 |
| 2.12.1 抗体文库的筛选 |
| 2.12.2 单克隆噬菌体ELISA |
| 2.13 TIM-3 单域抗体的表达纯化 |
| 2.13.1 单域抗体TIM3-R1、R6、R29 的原核表达与纯化 |
| 2.13.2 单域抗体TIM-3-R23、R53 的真核表达与纯化 |
| 2.14 抗体特异性、亲和力、中和活性、细胞结合活性的测定 |
| 2.14.1 TIM-3 单域抗体的生物素标记 |
| 2.14.2 TIM-3 单抗亲和力的ELISA测定 |
| 2.14.3 竞争结合ELISA测定TIM-3 单抗的中和活性 |
| 2.14.4 人外周血单个核细胞(PBMC)的分离 |
| 2.14.5 CAR-T细胞的构建 |
| 2.14.6 Flow Cytometry检测TIM-3 单抗与CAR-T细胞的结合活性 |
| 2.15 CAR-T细胞联合TIM-3 单抗对肿瘤细胞的杀伤试验 |
| 2.16 CAR-T细胞联合TIM-3 单抗在荷瘤小鼠体内抗肿瘤活性测试 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 TIM-3 胞外域表达质粒的构建 |
| 3.1.1 TIM-3 胞外域基因的扩增 |
| 3.1.2 TIM-3 表达质粒转化子的菌液PCR验证 |
| 3.2 SDS-PAGE分析TIM-3 胞外域重组蛋白 |
| 3.3 TIM-3 免疫家兔与多抗血清的获得 |
| 3.4 TIM-3 超表达细胞系的构建 |
| 3.4.1 Western Blot鉴定超表达细胞系 |
| 3.4.2 Flow Cytometry鉴定超表达细胞系 |
| 3.5 Galectin-9 重组质粒的构建 |
| 3.5.1 Galectin-9 基因片段的扩增 |
| 3.5.2 Galectin-9 表达质粒转化子的菌液PCR鉴定 |
| 3.6 SDS-PAGE验证Galectin-9 重组蛋白 |
| 3.7 ELISA测定TIM-3与Galectin-9 的亲和力 |
| 3.8 单域抗体库的构建 |
| 3.9 单域抗体库的筛选 |
| 3.9.1 单克隆噬菌体ELISA鉴定 |
| 3.10 TIM-3 单域抗体的测序分析 |
| 3.11 TIM-3 单域抗体的表达纯化 |
| 3.11.1 TIM-3 抗体的细菌表达 |
| 3.11.2 TIM-3 抗体的哺乳动物细胞表达 |
| 3.12 ELISA测定TIM-3单域抗体的亲和力 |
| 3.13 Flow Cytometry鉴定TIM-3单抗的细胞结合活性 |
| 3.14 ELISA分析TIM-3 单抗对TIM-3/Galectin-9 互作的阻断活性 |
| 3.15 CAR-T细胞联合TIM-3 单抗对肿瘤细胞的杀伤活性 |
| 3.16 CAR-T细胞联合TIM-3 单抗的体内抗肿瘤活性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 TIM-3 单抗的亲和力与细胞结合活性 |
| 4.2 TIM-3 单抗对TIM-3/Galectin-9 通路的阻断作用与抗肿瘤活性 |
| 4.3 未来研究方向与应用前景 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）糖基化反应对花生过敏原Ara h 1致敏性的影响及机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 花生过敏概述 |
| 1.1 花生过敏原 |
| 1.2 花生过敏机制 |
| 1.3 花生过敏原致敏性评估技术 |
| 2 糖基化对食物过敏原致敏性的影响 |
| 2.1 美拉德反应及其引发的蛋白终末糖基化反应 |
| 2.2 糖基化反应对食物蛋白质结构和生物利用度的影响 |
| 2.3 糖基化反应修饰食物过敏原对抗原呈递细胞的影响 |
| 2.4 糖基化反应修饰食物过敏原对T细胞和B细胞的影响 |
| 2.5 糖基化反应对食物过敏原与特异性Ig E识别的影响 |
| 3 本课题的研究目的及意义 |
| 第二章 花生Ara h 1 蛋白的原核表达及糖基化修饰 |
| 1 实验试剂及仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 原核表达载体的构建 |
| 3.2 重组Ara h 1 蛋白的原核表达 |
| 3.3 重组Ara h 1 蛋白的纯化及鉴定 |
| 3.4 重组Ara h 1 蛋白的致敏性实验 |
| 3.5 干热处理后蛋白糖基化相关指标的检测 |
| 3.6 干热处理对蛋白结构的影响 |
| 3.7 AGE-Ara h 1 蛋白的终末糖基化鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 糖基化重组Ara h 1 蛋白的致敏机理研究 |
| 1 实验仪器及试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 糖基化修饰R-Ara h 1 蛋白对BALB/c小鼠致敏性的影响 |
| 3.1.1 病理指标的观察 |
| 3.1.2 血清中细胞因子含量的检测 |
| 3.1.3 小肠和肺组织中TSLP基因表达量的检测 |
| 3.1.4 血清中特异性抗体含量的检测 |
| 3.1.5 血清中组胺含量的检测 |
| 3.1.6 小鼠血清对RBL细胞脱颗粒能力的分析 |
| 3.2 糖基化对重组Ara h 1 蛋白抗消化能力的影响 |
| 3.3 糖基化的重组Ara h 1 蛋白对树突细胞的影响 |
| 3.4 糖基化对重组Ara h 1 蛋白与Ig E结合能力的影响 |
| 3.5 糖基化修饰重组Ara h 1 蛋白对RBL-2H3 细胞脱颗粒能力的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 作者在攻读硕士学位期间公开发表的论文 |
| 作者在攻读硕士学位期间参与的项目 |
| 致谢 |
（4）24-脱氢胆固醇还原酶（DHCR24）相互作用蛋白的初步筛选研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 0.1 DHCR24蛋白的发现 |
| 0.2 DHCR24及其保护作用 |
| 0.3 DHCR24与P53和MDM2之间的相互作用 |
| 0.4 DHCR24拓扑结构,调整机制以及甲基化方面的研究 |
| 0.5 蛋白互作筛选技术 |
| 0.6 研究的目的意义 |
| 第1章 重组质粒PT7CFE1-His-DHCR24的构建 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.2.1 生化试剂耗材 |
| 1.2.2 主要仪器设备 |
| 1.2.3 试剂的配制 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 pcDNA3.1a-DHCR24和pT7CFE1-CHis质粒的转化、扩增 |
| 1.3.1.1 质粒转化 |
| 1.3.1.2 质粒小量提取 |
| 1.3.1.3 质粒酶切验证 |
| 1.3.1.4 质粒中提扩增 |
| 1.3.2 片段回收 |
| 1.3.3 酶连重组 |
| 1.3.4 重组质粒的酶切验证和序列测定 |
| 1.4 实验结果与讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第2章 1-Step Human Coupled IVT Kit实现DHCR24体外表达及功能验证 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 生化试剂及耗材 |
| 2.2.2 试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 1-Step Human Coupled IVT Kit-DNA表达DHCR24 |
| 2.3.2 Western Blot检测DHCR24蛋白的表达 |
| 2.3.3 免疫共沉淀验证表达DHCR24功能 |
| 2.3.3.1 N2A细胞复苏传代、冻存 |
| 2.3.3.2 DHCR24与MDM2的免疫共沉淀 |
| 2.3.2.2 Western Blot检测DHCR24与MDM2相互作用 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 1-Step Human Coupled IVT Kit-DNA表达DHCR24的验证 |
| 2.4.2 Western Blot检测DHCR24和MDM2蛋白的相互作用 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 免疫共沉淀联合质谱分析技术筛选DHCR24互作蛋白 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 生化试剂及耗材 |
| 3.2.2 试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 Ad293细胞复苏、传代及总蛋白的提取 |
| 3.3.1.1 Ad293细胞复苏 |
| 3.3.1.2 Ad293细胞传代 |
| 3.3.1.3 Ad293细胞冻存 |
| 3.3.1.4 Ad293细胞总蛋白的提取 |
| 3.3.2 1-Step Human High-Yield Mini IVT Kit表达DHCR24 |
| 3.3.2.1 高效表达DHCR24蛋白 |
| 3.3.2.2 BCA法测定表达DHCR24蛋白的浓度 |
| 3.3.2.3 免疫共沉淀法沉淀DHCR24相互作用蛋白 |
| 3.3.3 蛋白质谱法检测DHCR24相互作用蛋白 |
| 3.3.3.1 免疫共沉淀样本的考马斯亮蓝染色 |
| 3.3.3.2 免疫共沉淀胶点蛋白的蛋白质谱 |
| 3.3.3.3 免疫共沉淀样本全蛋白的蛋白质谱 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 免疫共沉淀样本考马斯染色分析 |
| 3.4.2 免疫共沉淀特异条带质谱分析 |
| 3.4.3 免疫共沉淀全蛋白质谱鉴定差异分析 |
| 3.5 结论 |
| 第4章 噬菌体展示技术筛选DHCR24相互作用蛋白 |
| 4.1 引言 |
| 4.1.1 噬菌体展示技术 |
| 4.1.2 蓝白斑筛选 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 大肠杆菌BLT5403的扩增和保存 |
| 4.3.1.1 大肠杆菌BLT5403的复苏 |
| 4.3.1.3 大肠杆菌BLT5403的保存 |
| 4.3.2 T7噬菌体的扩增和保存 |
| 4.3.3 噬菌体的滴度测定 |
| 4.3.3.1 T7原始噬菌体滴度测定 |
| 4.3.3.2 扩增后的T7噬菌体滴度测定 |
| 4.3.4 噬菌体展示技术可行性实验 |
| 4.3.5 阳性对照实验 |
| 4.3.6 DHCR24蛋白的包被和生物淘洗 |
| 4.3.6.1 DHCR24蛋白的包被 |
| 4.3.6.2 生物淘洗 |
| 4.3.7 噬菌体筛选的PCR |
| 4.3.8 噬菌体筛选片段的TA克隆 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 人脑cDNA文库T7噬菌体的初始浓度测定结果 |
| 4.4.2 人脑cDNA文库T7噬菌体的扩增后的浓度测定结果 |
| 4.4.3 噬菌体展示技术可行性实验结果 |
| 4.4.4 噬菌体展示阳性对照实验结果 |
| 4.4.5 生物淘洗过程中的噬菌体滴度测定结果 |
| 4.4.6 噬菌体筛选的PCR |
| 4.5 结论 |
| 第5章 结果与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表学术论文及参加科研情况 |
（5）噬菌体展示技术筛选人肠道病毒71型3A蛋白相互作用蛋白（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 3A原核表达载体的构建 |
| 1.3.2 3A融合蛋白表达及纯化 |
| 1.3.3 免疫印迹检测 |
| 1.3.4 3A相互作用蛋白的筛选 |
| 1.3.4. 1 噬菌体滴度测定 |
| 1.3.4. 2 筛选相互作用蛋白 |
| 1.3.5 噬菌斑的扩增 |
| 1.3.6 序列比对及同源性分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 3A融合表达及纯化 |
| 2.2 免疫印迹法检测纯化的融合蛋白 |
| 2.3 筛选人肝cDNA文库中3A相互作用蛋白 |
| 2.4 目的基因PCR扩增 |
| 2.5 序列比对及同源性分析 |
| 3 讨论 |
（6）晚期糖基化终产物受体通过AKT通路作用视网膜母细胞瘤蛋白促进前列腺癌的增殖及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料 |
| 1 主要仪器 |
| 2 主要实验试剂及耗材 |
| 3 试剂配制 |
| 4 质粒、菌株和细胞株 |
| 方法 |
| 1 细胞培养 |
| 2 BCA法蛋白定量 |
| 3 核质分离检测RAGE亚细胞定位 |
| 4 AGE-BSA刺激下前列腺癌细胞RB蛋白及磷酸化位点SER807/811表达情况表达情况 |
| 5 AGE-BSA刺激下前列腺癌细胞中总AKT蛋白和AKT磷酸化位点色氨酸473、苏氨酸308位表达情况 |
| 6 晚期糖基化终末产物受体胞外段不同功能段真核表达载体的构建及其在前列腺癌细胞中的表达与定位 |
| 7 SIRNA干扰PC-3细胞中RB蛋白的表达 |
| 结果 |
| 1 RAGE在前列腺癌细胞中的亚细胞定位 |
| 2 AGE-BSA刺激条件下前列腺癌细胞PC-3细胞中RB的表达 |
| 3 AGE-BSA刺激下前列腺癌细胞中RB蛋白磷酸化位点SER807/811表达 |
| 4 AGE-BSA刺激下前列腺癌细胞中总AKT蛋白和AKT磷酸化位点色氨酸473、苏氨酸308位表达 |
| 5 晚期糖基化终产物受体胞外段缺失体DELTA-V/DELTA-VC1真核表达载体的构建及其在前列腺癌细胞中的表达与定位 |
| 6 SIRNA干扰PC-3细胞中RB蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 1 RAGE与前列腺癌 |
| 2 RB蛋白在前列腺癌中的改变 |
| 3 AKT蛋白在前列腺癌中的改变 |
| 4 AGES-RAGE通过AKT通路与RB蛋白在前列腺癌发挥作用 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
（7）肺癌早诊蛋白质谱的筛查鉴定及SWI/SNF染色质重组复合物失调研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言（一 ） |
| 研为现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 前言（二） |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、非小细胞肺癌T7噬菌体展示文库的构建 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验标本 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂和耗材 |
| 1.1.4 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 非小细胞肺癌组织总RNA的提取及检测 |
| 1.2.2 非小细胞肺癌组织mRNA的提取及检测 |
| 1.2.3 原始噬菌体文库的滴度测定和质量评价 |
| 1.2.4 扩增噬菌体文库 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 总RNA的提取与质量检测 |
| 1.3.2 mRNA的提取与质量检测 |
| 1.3.3 cDNA展示文库质量评价 |
| 1.3.4 T7噬菌体文库优势 |
| 1.4 小结 |
| 二、非小细胞肺癌肿瘤相关的筛选鉴定 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验标本 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂和耗材 |
| 2.1.4 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 血清IgG滴度检测 |
| 2.2.2 噬菌体展示文库淘选后富集情况检测 |
| 2.2.3 血清免疫学筛选阳性克隆 |
| 2.2.4 测序鉴定免疫源性噬菌体展示的肿瘤相关抗原 |
| 2.2.5 免疫源性噬菌体展示的肿瘤相关抗原在基因芯片中表达水平 |
| 2.2.6 ELISA法检测非小细胞肺癌患者血清中肿瘤相关抗体 |
| 2.2.7 评价单一和联合标志物诊断价值 |
| 2.2.8 联合标志物与非小细胞肺癌分期的关系 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 肿瘤抗原与肿瘤免疫监视 |
| 2.3.2 SEREX法 |
| 2.3.3 生物淘洗富集和筛选 |
| 2.3.4 肿瘤自身抗体在肺癌早诊和联合诊断中的作用 |
| 2.4 小结 |
| 三、肺癌中染色质重组复合物的异常调节 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验标本 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂和耗材 |
| 3.1.4 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 提取DNA质量检测 |
| 3.2.2 NextGen测序 |
| 3.2.3 Sanger测序验证 |
| 3.2.4 基因芯片检测SWI/SNF染色质重组复合物基因表达水平 |
| 3.2.5 检测SWI/SNF染色质重组复合物蛋白水平 |
| 3.2.6 免疫组化芯片 |
| 3.2.7 肺癌细胞株等位基因缺失测定 |
| 3.2.8 统计学分析验证 |
| 3.2.9 甲基化检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 NextGen测序 |
| 3.3.2 SNP芯片 |
| 3.3.3 组织芯片 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 肿瘤自身抗体在肺癌早期诊断中的作用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（8）晚期糖基化终产物受体与视网膜母细胞瘤蛋白的相互作用对前列腺癌增殖的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 附件 |
（9）Her2全人源抗体的制备及生物学功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 详细摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 全人源大容量噬菌体抗体库的构建 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第二部分 噬菌体抗体库的筛选和鉴定 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第三部分 噬菌体单克隆抗体的构建表达和鉴定 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第四部分 抗HER2抗体的体外功能学实验 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 综述一 以HER2为靶点的肿瘤靶向治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 噬菌体抗体库的构建和应用前景 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 一、在读期间发表论文 |
| 二、参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（10）晚期糖基化终产物受体在前列腺癌中的异常表达及其与视网膜母细胞瘤蛋白的相互作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 RAGE在前列腺癌细胞中的异常表达与分布 |
| 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 试剂配制 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 荧光定量PCR |
| 1.2.2 Western blot |
| 1.2.3 免疫组织化学染色法 |
| 1.2.4 免疫荧光法 |
| 1.2.5 MTT法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 RAGE在前列腺癌组织和正常前列腺组织中的表达 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 免疫组织化学法检测RAGE在前列腺组织中的表达 |
| 1.3 前列腺癌和正常前列腺组织中RAGE mRNA的定量 |
| 1.4 前列腺组织中RAGE的Western blot检测 |
| 2 RAGE与前列腺癌细胞增殖的关系 |
| 3 RAGE在前列腺癌细胞中的分布 |
| 3.1 免疫组化测RAGE在前列腺癌细胞中的分布 |
| 3.2 免疫荧光观测RAGE在前列腺癌细胞中的分布 |
| 4 RAGE在不同肿瘤细胞中的分布 |
| 第二部分 Rb基因的克隆与表达及其与RAGE在前列腺癌细胞中的相互作用 |
| 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 试剂配制 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 免疫荧光法观测RAGE与Rb共定位 |
| 1.2.2 CMV-FLAG-RB重组质粒的构建 |
| 1.2.3 CMV-FLAG-RB重组质粒在HEK293中表达效果的检测 |
| 结果 |
| 1 免疫荧光法观测内源性RAGE与内源性Rb在细胞内的共定位情况。 |
| 2 CMV-FLAG-RB重组质粒的构建与表达 |
| 2.1 Rb编码序列PCR扩增结果 |
| 2.2 CMV-FLAG-RB重组质粒鉴定 |
| 2.3 CMV-FLAG-RB重组质粒在真核细胞中的表达 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 一、取得的结果 |
| 二、存在的问题 |
| REFERENCES |
| 附录 |
| 成果 |
| 致谢 |
| 统计学证明 |
四、用T7噬菌体展示系统筛选与晚期糖基化终产物受体胞内段相结合的蛋白（论文参考文献）
- [1]造血干细胞S100A8特异性敲除鼠表型分析及S100A8对红系前体细胞发育的影响探讨[D]. 曾冬. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)
- [2]TIM-3单域抗体的制备及其功能研究[D]. 杨柳. 华中农业大学, 2019(02)
- [3]糖基化反应对花生过敏原Ara h 1致敏性的影响及机理研究[D]. 史云凤. 上海大学, 2019(02)
- [4]24-脱氢胆固醇还原酶（DHCR24）相互作用蛋白的初步筛选研究[D]. 孙得良. 辽宁大学, 2016(02)
- [5]噬菌体展示技术筛选人肠道病毒71型3A蛋白相互作用蛋白[J]. 唐瑞,杨勇波. 国际检验医学杂志, 2014(16)
- [6]晚期糖基化终产物受体通过AKT通路作用视网膜母细胞瘤蛋白促进前列腺癌的增殖及机制研究[D]. 洪英洽. 南方医科大学, 2013(03)
- [7]肺癌早诊蛋白质谱的筛查鉴定及SWI/SNF染色质重组复合物失调研究[D]. 姚毅冰. 天津医科大学, 2012(08)
- [8]晚期糖基化终产物受体与视网膜母细胞瘤蛋白的相互作用对前列腺癌增殖的影响及机制研究[D]. 李炬聪. 南方医科大学, 2012(04)
- [9]Her2全人源抗体的制备及生物学功能研究[D]. 方晨. 第二军医大学, 2011(09)
- [10]晚期糖基化终产物受体在前列腺癌中的异常表达及其与视网膜母细胞瘤蛋白的相互作用[D]. 陆斌. 南方医科大学, 2010(04)