一、结核杆菌热休克蛋白-65重组质粒的构建及其在真核细胞中的初步表达（论文文献综述）
张真[1]（2020）在《结核分枝杆菌新型疫苗的制备及其免疫效果研究》文中研究表明第一部分:结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6融合基因DNA疫苗株的构建及免疫原性研究目的构建结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗,并对其在体外真核细胞及C57BL/6小鼠中表达,初步探究这两种DNA疫苗的免疫原性。方法从Gen Bank中获取M.tuberculosis H37Rv的Ag85B、ESAT6和Hsp65基因序列送生工合成。然后经PCR、酶切、连接与真核表达载体PVAX1重组,测序鉴定正确后应用TIANGEN试剂盒大量纯化无内毒素的质粒DNA。体外转染验证其表达后,免疫C57BL/6小鼠,检测特异性细胞免疫应答,流式检测升高细胞因子所属细胞亚型。结果Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗在体内外均能表达。体外Western Blot检测显示,DNA疫苗体外转染293T细胞24h可以检测到蛋白Hsp65、Ag85B、ESAT6的表达,48h时细胞内蛋白表达量达最高。C57BL/6小鼠中Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗激起了很好的免疫反应,可诱导机体产生分泌高水平TNF-α的Th型免疫应答。结论Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6DNA疫苗都具有较强的免疫原性,呈Th型细胞介导的免疫应答;Hsp65-Ag85B DNA疫苗的保护效力比Hsp65-ESAT6 DNA疫苗强,有待进一步研究其应用价值。第二部分:卡介苗ure C基因缺失株的构建及筛选目的在MTB中ure C产生的氮被认为是碱化MTB生存微环境的重要来源,不仅可以预防吞噬体的酸化,还可阻止吞噬体和溶酶体的融合,进一步逃脱免疫监视和免疫反应。运用Cre/Lox P同源重组方法对卡介苗进行遗传操作,缺失卡介苗中氮源基因ure C,打破MTB在体内原有适宜生存的微环境,促进吞噬-溶酶体成熟,筛选并获得卡介苗ure C基因缺失株,为后续在此缺失株添加有效的MTB免疫抗原提供基础。方法采用Cre/Lox P同源重组的方法,将含有重组酶的p SL002质粒电转至卡介苗中,涂板,长出单菌落后以此菌落做感受态。利用speⅠ和NsiⅠ双酶切本实验室前期构建的含有ure C基因左右同源臂及gfp荧光蛋白的重组质粒p SL001,获得目的片段,并将其电转至上述含有p SL002质粒的卡介苗,涂板后挑取单克隆,通过菌液PCR进行鉴定、筛选出卡介苗中双交换目的片段并缺失ure C基因的菌株,从而获得卡介苗ure C基因缺失株。结果电转至含有p SL002质粒卡介苗的目的片段,因为存在gfp蛋白,在蓝光手电筒下发绿色荧光,包括单交换与双交换两种,对发绿色荧光单菌落进行菌液PCR,琼脂糖凝胶鉴定,单交换菌落在1734bp处出现条带,双交换菌落因片段过大在3498bp处隐约有条带或不出现条带。挑取双交换菌落涂板传代,成功筛选出了卡介苗ure C基因缺失株,形态正确,并能够稳定传代。结论利用Cre/Lox P同源重组方法在卡介苗中进行遗传操作,能够对卡介苗的基因进行无缝敲除,并且获得的突变株能够稳定传代。研究表明,在此过程中采用Cre/Lox P同源重组系统可大大提高了MTB的重组效率并缩短了重组时间,为重组卡介苗的研究提供了便利。
吴娟,马辉,范小勇,曲勍,罗玉萍,Douglas B.Lowrie[2]（2012）在《内含子A提高分枝杆菌热休克蛋白65 DNA疫苗的免疫原性》文中指出目的探讨以内含子A增强外源抗原在真核细胞中的表达效率及其对DNA疫苗在小鼠中免疫原性的影响。方法以分枝杆菌热休克蛋白65（Hsp65）为模式抗原,将其分别克隆入含有内含子A和不含内含子A的真核表达载体pCMV4.0和pVAX1,将表达Hsp65的不同重组质粒瞬时转染人胚肾上皮细胞系293T并免疫接种BALB/c小鼠,应用ELISA分析其所诱导产生的抗原特异性抗体水平及亚类,并以酶联免疫斑点试验（ELISPOT）和胞内细胞因子染色技术（ICS）分析其诱导产生的细胞免疫应答反应。结果含有内含子A的重组表达质粒pCMV4.0hsp65较之不含内含子A的pVAX1hsp65在293T细胞中的抗原表达量更高,免疫小鼠6周后诱导产生的抗-Hsp65特异性总IgG抗体水平（3.76±0.23对3.15±0.22,P<0.01）和IgG2a/IgG1比值（4.08±0.04对2.23±0.12,P<0.01）也更高,差异有统计学意义;分泌γ-干扰素（IFN-γ）的CD4+T淋巴细胞频率[（2.0±0.058）%对（1.5±0.087）%,t=4.804,P<0.01]和CD8+T淋巴细胞频率[（0.6±0.058）%对（1.0±0.115）%,t=3.098,P<0.05]增加,差异有统计学意义,提示其诱导产生了增强的Th1型免疫应答。结论内含子A可增强分枝杆菌Hsp65在真核细胞中的表达效率并可提高DNA疫苗在小鼠中的免疫原性。
吴娟[3]（2011）在《新型免疫刺激分子增强DNA疫苗免疫原性的研究》文中研究表明Hsp65作为DNA疫苗的模式抗原是机体对抗结核分枝杆菌入侵的重要免疫保护性及治疗抗原。然而,增强DNA疫苗免疫效果则是令人期待的。因此我们构建麻风分枝杆菌热休克蛋白65 （Heat shock protein 65, Hsp65）的原核表达载体,诱导表达、纯化该重组蛋白并制备Anti-Hsp65小鼠多克隆抗体；并探讨在麻风分枝杆菌热休克蛋白Hsp65终止密码与真核表达载体polyA之间插入CpG基序以提高DNA疫苗在小鼠中诱导的细胞免疫和体液免疫；同时探讨以内含子A增强Hsp65在真核细胞中的表达效率及提高DNA疫苗在小鼠中诱导的免疫原性。通过ELISA、ELISPOT和胞内细胞因子染色技术等实验方法进行分析,结果小结如下：1、PCR扩增所获得hsp65基因序列与GenBank公布的完全一致,表达的融合蛋白相对分子质量约65kDa, ELISA测定表明Anti-Hsp65多克隆抗体效价约为1:12,800, Western-blotting分析表明该多克隆抗体具有良好的反应特异性；2、含有CpG02的重组质粒瞬时转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,其IFN-α, IL-12, IL-17A和IL-6的mRNA相对表达水平明显增加,但IL-4和CD86的mRNA相对表达水平没有统计学差异,免疫小鼠后诱导产生Anti-Hsp65特异性总IgG和IgG2a抗体水平也更高,分泌IFN-y的T淋巴细胞频率也增加；3、含有内含子A的重组表达质粒pCMV4.0hsp65较之不含内含子A的pVAX1hsp65在人胚肾上皮细胞系293T细胞中的抗原表达量更高,免疫小鼠后诱导产生的Anti-Hsp65特异性总IgG和IgG2a抗体水平也更高,分泌IFN-y的CD4+和CD8+T淋巴细胞频率增加。经过上述验证,我们成功表达与纯化了麻风分枝杆菌Hsp65的重组蛋白,并制备了效价及特异性良好的Anti-Hsp65小鼠多克隆抗体：在抗原转录区下游插入CpG免疫刺激基序能更好地提高DNA疫苗在小鼠中诱导的免疫原性；内含子A可增强Hsp65在真核细胞中的表达效率并可提高DNA疫苗在小鼠中诱导的免疫原性。
张岩[4]（2011）在《MAP Hsp65和GPV VP3真核表达载体的构建及免疫效果研究》文中指出小鹅瘟（Gosling Plague, GP）又称鹅细小病毒感染,是由鹅细小病毒（Goose Parvovirus, GPV）引起的雏鹅急性或亚急性败血性传染病。本病主要侵害4-20日龄的雏鹅和雏番鸭,以急性肠炎、肝、肾、心脏实质器官病变为主要特征,具有传播快、发病率和致死率高的特点。目前使用的小鹅瘟弱毒疫苗不甚理想,单基因疫苗虽可以在体外细胞得到高效表达,但是往往在动物体内诱导的免疫反应较弱,限制了基因疫苗的实际应用。加入免疫佐剂是增强基因疫苗免疫效果的策略之一。Hsp65作为分枝杆菌的优势抗原,不仅可诱导免疫机体的体液和细胞免疫应答,还具有载体效应和分子佐剂作用。本研究以探索禽分枝杆菌副结核亚种（Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosis, MAP） hsp65对GPV VP3基因疫苗的佐剂作用为目的,将MAP的hsp65基因和GPV的VP3基因先后克隆入真核表达载体pVAX1中,经PCR、酶切和序列分析鉴定,证明获得了重组质粒pVAX1-hsp65-VP3;采用脂质体法将该质粒转染入Vero细胞,经过RT-PCR和间接免疫荧光试验证实真核表达载体pVAX1-hsp65-VP3能够在Vero细胞获得瞬时表达；将pVAX1-hsp65-VP3和pVAX1-VP3分别、分次以100μg/只的剂量肌肉注射给试验雏鹅,通过淋巴细胞转化试验检测T细胞活性,间接ELISA法检测血清中GPV特异性抗体水平。结果表明,pVAX1-hsp65-VP3免疫组与pVAX1-VP3和弱毒疫苗免疫组相比,T淋巴细胞增殖指数差异显着（p<0.05）；间接ELISA检测结果表明,在第21d和28d,pVAX1-hsp65-VP3质粒免疫组雏鹅血清中GPV特异性抗体水平显着高于pVAX1-VP3质粒免疫组和弱毒疫苗免疫组（p<0.05）；安全性试验组的雏鹅眼观和剖检未见异常变化。以上试验结果说明MAP的Hsp65增强了pVAX1-VP3的免疫效果,为小鹅瘟基因疫苗和Hsp65的分子佐剂作用研究奠定了基础。
袁伟[5]（2011）在《结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因DNA疫苗的实验研究》文中进行了进一步梳理结核病（Tuberculosis, TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis. Mtb）引起的传染性疾病。据世界卫生组织报道,目前全球有近1/3的人感染了结核杆菌。随着多重耐药菌、极度耐药株的出现,艾滋病与结核共感染人群的增加使得活动性结核病人日益增多。目前,卡介苗是唯一获得批准的被广泛使用的结核病预防疫苗,对于儿童卡介苗具有良好的保护效果,但对于成人其保护效果不容乐观,对于抑制潜伏期结核的复发更是毫无作用。因此研制新的结核病疫苗迫在眉睫,未来的结核病疫苗不仅要对刚出生婴儿以及未感染结核菌的人群提供良好的预防作用,对于已经感染结核菌但尚未发病的感染人群也要具有增强细胞免疫、加速清除结核菌的保护作用。本研究用分子生物学技术构建了结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因,并对其在体外真核细胞中进行表达。应用此疫苗在小鼠体内进行了免疫原性评价,同时观察了此疫苗的预防保护效果和治疗效果。一、Ag85B-Esat6-HspX融合基因真核表达载体的构建及其表达用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中分别扩增Ag85B、Esat6、HspX基因,插入到pUC19-T载体,序列测定正确后,将融合基因再次克隆到真核表达载体pcDNA3.1（-）。重组质粒经酶切鉴定并测序正确后,应用MegaTran 1.0瞬时转染293T细胞,用抗Ag85B的多克隆抗体、抗Esat6的单克隆抗体和抗HspX的单克隆抗体分别进行Western-Blot检测,均能检测到分子量大小约65 kDa的目的蛋白。这种成功构建的能够在真核细胞表达融合蛋白的重组质粒为后期进行的免疫原性评价和保护力评价奠定了基础。二、Ag85B-Esat6-HspX融合基因DNA疫苗的免疫原性评价将上述融合基因DNA疫苗免疫小鼠对其免疫原性进行初步评价。BALB/c小鼠进行一侧股四头肌肌肉注射免疫,每次100μl/只,间隔2周免疫一次,共免疫3次,同时设BCG组、空质粒免疫组（pcDNA）和pHspX免疫组。在免疫的第2周,第4周及最后一次免疫后2周检测小鼠血清中的总IgG水平。末次免疫后2周,小鼠摘眼球取血,进行CD44, CD8+和γδT细胞比例测定；无菌取脾分离小鼠脾淋巴细胞,检测小鼠血清中针对HspX蛋白的特异性IgG2a和IgGl比值；体外用HspX抗原刺激小鼠脾淋巴细胞后,通过淋巴细胞增殖实验和ELISPOT实验检测小鼠脾淋巴细胞的增殖能力和脾淋巴细胞中能分泌抗原特异性IFN-γ的细胞数量；应用ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞IFN-γ、IL-2和IL-4分泌水平。在体液免疫应答中,融合基因DNA疫苗诱导小鼠产生的血清总IgG OD值均高于其他三组（P<0.05）,且抗体亚类以Thl型的IgG2a为主（P<0.05）。在细胞免疫应答中,融合基因DNA疫苗组小鼠的脾淋巴细胞特异性增殖明显,指数为2.33,显着高于BCG组的增殖指数1.26（P<0.05）。应用Ag85B.Esat6和HspX抗原体外刺激后,融合基因疫苗组脾淋巴细胞分泌特异性IFN-γ的细胞数量均明显高于其他三组（P<0.01）。融合基因疫苗可使CD4+T细胞和CD8+T细胞明显增殖,所占比例分别为27.58%和8.64%,但与BCG免疫小鼠相比,差异无显着性（P>0.05）。外周血γδT细胞比例,四个组均无差异（P>0.05）。融合基因疫苗组的IFN-γ和IL-2的水平分别为1005.72±67.12 pg/ml和84.63±8.76pg/ml,明显高于其他三组（P<0.05）,但四个组均未检出IL-4含量。三.Ag85B-Esat6-HspX融合基因DNA疫苗的效力学评价DNA疫苗对MTB感染小鼠的预防保护效果：小鼠末次免疫完成后2周,用5×105CFU结核分枝杆菌H37Rv通过尾静脉注射的方式感染,6周后无菌分离小鼠的脾和肺,计数脾肺组织的细菌荷菌量,以log10CFU表示。结果表明,空质粒对照组小鼠的脾肺荷菌量分别为5.48±0.11 log1o和5.40±0.09log10,融合基因疫苗组小鼠的脾肺荷菌量分别为4.97±0.05 log1o和4.65±0.22 log1o,二者比较有统计学差异（P<0.05）,提示融合基因疫苗对MTB感染小鼠有明显的保护作用,但其保护作用与BCG相比差异无显着性（P>0.05）,BCG免疫小鼠的脾肺荷菌量分别为4.88±0.13log10和4.46±0.17 log10。DNA疫苗对MTB感染小鼠的治疗效果：小鼠经5×105CFU结核分枝杆菌H37Rv尾静脉感染4周后,再给小鼠肌肉注射重组质粒DNA（1μg/μl）,每次100μl/只,间隔2周注射一次,共注射3次,同时设空质粒治疗组（pcDNA）和pHspX治疗组。本研究中的治疗效果实验并未设置BCG阳性对照组原因在于BCG对于结核菌感染后人群并无保护效果。末次注射后6周,无菌分离小鼠的脾肺,计数脾肺组织的细菌荷菌量,以log10CFU表示。结果表明,MTB感染小鼠经注射空质粒后,脾肺荷菌量分别为5.43±0.11 log10和5.46±0.08 log10;而注射融合基因质粒DNA组小鼠的脾肺荷菌量分别为4.88±0.18 log10和4.92±0.10 log110二者比较有统计学差异（P<0.05）,提示融合基因疫苗对MTB感染小鼠有一定的治疗作用。四、结论本研究首次将结核分枝杆菌休眠期抗原HspX与生长早期抗原Ag85B和ESAT-6联合使用,成功构建了能够在真核细胞表达融合蛋白的重组质粒pcDNA-Ag85B-Esat6-HspX。我们对这种新型DNA疫苗分别进行了免疫原性和效力学评价,发现此疫苗可在小鼠体内刺激产生较强的体液和细胞免疫应答,具有较强的免疫原性。通过先免疫后感染的方式,对此疫苗进行了预防保护效果评价,发现融合基因DNA疫苗可以显着减少小鼠体内脾肺荷菌量,但这种保护作用并不能超过BCG。同时,通过先感染后免疫的方式,对此疫苗进行了治疗效果的评价,发现此融合基因DNA疫苗也具有一定的治疗作用。所以,与传统的BCG相比,此新型DNA疫苗不仅强烈的诱导了Thl型细胞免疫反应,而且还具有一定治疗效果,这对于结核病的防治是十分有意义的。
王秋悦[6]（2009）在《柔嫩艾美耳球虫rhomboid基因重组卡介苗的构建及其免疫保护性研究》文中进行了进一步梳理鸡球虫病（Coccidiosis）是由艾美耳属（Eimeria）的各种球虫寄生在鸡的肠道引起的寄生性原虫病,所有日龄和品种的鸡都易感,严重影响了养殖业的发展。卡介苗（BCG）集佐剂与抗原于一身,是表达外源基因的理想活菌疫苗载体。为探讨重组卡介苗（rBCG）对鸡球虫感染的免疫保护作用,本研究首先构建了E.tenella rhomboid基因穿梭表达载体pMV261-Rho和整合表达载体pMV361-Rho,并在BCG内进行了rhomboid基因的诱导表达和免疫原性分析;然后将两种rBCG疫苗通过不同途径免疫雏鸡,观察其对动物免疫保护效果;在此基础上构建EGFP标记的rBCG,对Rhomboid蛋白在鸡体内各组织器官中的分布及稳定性和消长规律进行了研究;此外还将rhomboid基因与鸡IL-2基因（ChIL-2）联合构建rBCG,观察抗球虫效果。结果表明在鸡肝、脾、肺、肾、盲肠各组织器官均检测到rhomboid基因表达,雏鸡免疫14天后基因表达量达到最高,随后开始下降,至28天后消失;动物免疫保护性实验表明rBCG疫苗对E.tenella卵囊的攻击具有一定的免疫保护作用,诱导产生细胞免疫和体液免疫反应,且以滴鼻方式免疫效果最佳,抗球虫指数为174.6;将rhomboid基因与ChIL-2基因联合在卡介苗中表达,结果显示IL-2具有明显增强Rhomboid蛋白的免疫保护作用,其中pMV261-Rho-IL-2滴鼻免疫组保护效果最为明显,抗球虫指数ACI达到180以上,已达到临床使用的要求。本研究为球虫病的预防奠定了基础。
马彦彬,戴五星,陈智浩,高红[7]（2008）在《人结核杆菌热休克蛋白65和Ag85A基因真核双表达质粒的构建和体外表达》文中研究指明目的构建人结核杆菌热休克蛋白65（Hsp65）与Ag85A基因的共表达载体pIRES-Hsp65-Ag85A,并检测其在体外的表达。方法利用聚合酶链反应（PCR）法及基因重组技术,以人结核杆菌基因组DNA为模板,扩增获得Hsp65与Ag85A的全长基因,并将其构建到真核表达质粒pIRES中获得共表达质粒pIRES-Hsp65-Ag85A。将该质粒转染Hela细胞,通过RT-PCR的方法检测目的基因的表达。结果经过测序证实重组质粒构建成功,该质粒在体外转染Hela细胞后可表达Hsp65与Ag85A两者的mRNA。结论成功构建了共表达质粒pIRES-Hsp65-Ag85A,该质粒能在人子宫颈癌细胞中表达。
徐凤宇[8]（2008）在《副结核分枝杆菌hsp65基因的克隆、表达与免疫研究》文中研究指明副结核病（Paratuberculosis）是由副结核分枝杆菌即禽分枝杆菌副结核亚种（Mycobacterium avium subsp．Paratuberculosis，MAP）引起的一种以反刍动物为主要宿主的慢性增生性、顽固性肠炎和进行性消瘦为特征的传染病，也称Johne’s病。该病不仅使病畜的饲料报酬降低，产奶量和繁殖力下降，造成巨大的经济损失，而且还与人类的克隆氏（Crohn’s）病存在潜在联系，因此，愈来愈受到世界各国的广泛关注。目前，该病尚无经济有效的治疗药物，控制该病的主要措施是加强饲养管理和消除传染源，即以变态反应、ELISA、病原分离鉴定等方法进行检疫，对检出的阳性牛隔离与淘汰。此外，也可采用预防接种的方法来控制该病，即将MAP灭活或致弱后制成疫苗进行免疫，接种疫苗不仅使该病的临床型病例减少90％，而且减少了亚临床感染动物的数量和组织学或细菌学检测阳性的病例。但是，菌苗接种后会干扰该病和结核病的变态反应和血清学检测，许多国家已经禁止使用接种菌苗来控制副结核病。因此，研究开发副结核病的新型疫苗势在必行。热休克蛋白（HSPs）是生物体受到物理、化学、生物、精神等刺激时发生应激反应而合成的高度保守的蛋白质。根据分子量，将主要的热休克蛋白分为5个家族：大分子量家族、HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族和小分子量家族。Hsp60作为一种分子伴侣，能协助变性、不可溶的凝聚蛋白重新恢复天然构象，在许多病原体传染过程中是免疫优势抗原。hsp65基因又名groEL2基因，其编码的蛋白是HSP60家族成员，不仅可作为分枝杆菌的主要保护性抗原，还具有帮助树突状细胞递呈抗原等功能。Hsp10（GroES）作为辅分子伴侣，在GroLS指导蛋白质折叠过程中具有辅助其活性的作用，同时作为一种有效的T细胞抗原，能刺激机体产生特异性细胞免疫应答，使外周血单核细胞出现增殖反应并产生IFN-γ，是制备新型疫苗的候选抗原。为了研发预防副结核病的新型疫苗尤其是DNA疫苗及相关蛋白功能，本研究选择了MAP的主要保护性抗原Hsp65蛋白，以副结核分枝杆菌C-2株染色体DNA为模板，以hsp65基因的特异性引物进行PCR扩增，获得了1 626bp的hsp65基因，通过T-A克隆技术，将PCR产物克隆至pGEM-T Vector中，以质粒大小、酶切分析、PCR扩增及序列分析鉴定重组克隆，成功地构建出克隆质粒pGEM-T-hsp65，以DNASTAR软件分析了所克隆基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列，结果表明，所获得的hsp65基因与GenBank中MAPK-10株该基因核苷酸大小完全一致，两者核苷酸序列的同源性为99．1％，氨基酸序列的同源性为99．3％，表明该基因在副结核分枝杆菌中高度保守。进一步将pGEM-T-hsp65中的hsp65基因酶切、纯化后亚克隆至pET-32a（+）原核表达系统中，构建了高效原核表达质粒pET-32a-hsp65，在与之相匹配的E．coli BL21（DE3）表达菌株中，该质粒经IPTG诱导获得了76Ku的融合蛋白。经免疫印迹分析证实，该融合蛋白具有与副结核分枝杆菌多克隆抗体发生反应的特性。在上述研究的基础上，为研究开发MAP主要保护性基因hsp65的DNA疫苗，将克隆质粒pGEM-T-hsp65中的hsp65基因酶切、纯化后亚克隆至真核表达载体pVAX1中，成功构建了真核表达重组质粒pVAX1-hsp65，并以阳离子聚合物基因转染试剂将真核表达重组质粒转染至BHK-21细胞中，通过荧光抗体和RT-PCR技术证实hsp65基因可以在哺乳动物细胞中表达，同时将pGEM-T-hsp65中的hsp65基因酶切、纯化后亚克隆至pVAX1-hsp10中，成功构建了真核表达重组质粒pVAX1-hsp65-10。以pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10重组质粒免疫BALB／c小鼠，同时设pVAX1、生理盐水为对照组。特异性抗体检测结果显示，免疫小鼠体内分别产生了针对Hsp65的特异性抗体，且二价基因免疫组的抗体水平高于单价基因。淋巴细胞转化试验结果显示，pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10免疫组的淋巴细胞增殖活性高于生理盐水对照组，而pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10实验组之间差异不显着（P＞0．05）。CD3+、CD4+、CD8+T细胞检测结果显示，pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10免疫组CD8+T细胞水平高于对照组，尚未达到统计学的显着水平（P＞0．05），但也表明实验组产生了较高的以MHCⅠ类分子递呈的细胞免疫应答，pVAX1-hsp65免疫组的CD4+、CD3+T细胞数量明显高于其它组。重组质粒pVAX1-hsp65-10免疫组小鼠的IFN-γ水平明显高于对照组，pVAX1-hsp65免疫组的小鼠IFN-γ水平略高于对照组，均未达到统计学上的显着水平（P＞0．05），但结果显示，重组质粒pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10均使免疫小鼠产生了细胞免疫，而且二价基因的免疫效果优于单价基因。以pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10免疫豚鼠，同时设pVAX1和副结核分枝杆菌超声抗原对照组。禽结核杆菌PPD皮试结果显示，pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10免疫组与副结核分枝杆菌超声抗原免疫组差异极显着（P＜0．01），表明Hsp65和Hsp10不干扰变态反应检测。
宫强[9]（2007）在《牛结核病DNA疫苗的研究》文中研究表明牛结核病是主要由牛分枝杆菌引起的一种慢性消耗性疾病，在许多国家尤其是发展中国家仍广泛流行，该病不仅给畜牧业造成巨大的经济损失，而且严重威胁着人类的身心健康。因此，控制牛结核病对防治人类结核病意义重大。然而，至今仍没有一种疫苗可用于该病的预防。本研究利用PCR技术和重叠延伸剪接技术（splice by overlapping extension，SOE），以牛分枝杆菌ValleeⅢ菌株的基因组为模板，扩增ag85b、esat-6、hsp65、mpb64基因和ag85b-esat-6、hsp65-esat-6、mpb64-esat-6融合基因，连接到真核表达载体pCDNA3.1（+）中，构建重组质粒pCDNA3.1-Ag85B（简称pCA）、pCDNA3.1．ESAT-6（简称pCE6）、pCDNA3.1-HSP65（简称pCH）、pCDNA3.1-MPB64 （简称pCM）、pCDNA3.1-Ag85B-ESAT-6 （简称pCAE）、pCDNA3.1-HSP65-ESAT-6（简称pCHE）和PCDNA3.1-MPB64-ESAT-6（简称pCME）。转染SP2／0细胞，检测目的基因的表达。以各重组质粒和pCDNA3.1（+）及PBS免疫BALB／c小鼠，免疫3次，每次间隔2周，1免后每周以牛分枝杆菌纯化蛋白衍生物（purified protein derivmive，PPD）为包被抗原，间接ELISA方法检测血清抗体水平；以牛分枝杆菌PPD和刀豆蛋白A（Concanavalin A，ConA）为刺激原，MTT法检测脾淋巴细胞增殖情况。3免2周后以ELISA试剂盒检测脾细胞分泌IFN～γ的情况。结果表明，除pCH组外，其他各重组质粒免疫后小鼠血清抗体水平持续上升，与pCDNA3.1（+）对照组和PBS对照组相比差异显着（p＜0.05）。3免2周后，融合DNA疫苗免疫组的刺激值（SI值）与单价DNA疫苗免疫组相比差异显着（p＜0.05）。PPD刺激后融合基因DNA疫苗免疫组小鼠脾细胞分泌的IFN～γ高于单价DNA疫苗组（p＜0.05），而ConA刺激后各疫苗组分泌的IFN～γ,水平均高于PPD刺激时（p＜0.05），其中以pCAE和pCME组最高。以上结果表明在诱导细胞免疫应答方面融合DNA疫苗要优于单价DNA疫苗。同样，利用PCR和SOE技术，获得牛分枝杆菌mpb64-ag85b和mpb64-ag85b-esat-6融合基因，以pCDNA3.1（+）为载体构建了牛分枝杆菌多价组合和多基因融合DNA疫苗：二基因融合（pCDNA3.1-MPB64-Ag85B，简称pCMA）和三基因融合（pCDNA3.1-MPB64-Ag85B-ESAT-6，简称pCMAE）DNA疫苗；二价组合（pCA+pCM）和三价组合（pCA+pCM+pCE6）DNA疫苗，免疫BALB／c小鼠，以牛分枝杆菌BCG免疫组为阳性对照，以pCDNA3.1（+）及PBS免疫组为阴性对照，共免疫3次，每次间隔2周，BCG组仅初免时皮下免疫1次。1免后每周，以原核表达纯化的重组MPB64-Ag85B-ESAT-6蛋白（rMAE）和牛分枝杆菌PPD为包被抗原，以间接ELISA方法检测血清IgG水平及lgG亚类。每次免疫2周后以rMAE蛋白和PPD刺激，MTT法检测脾淋巴细胞增殖情况，试剂盒检测IFN～γ和IL-2的分泌情况。3免3周后以1×106CFU的BCG进行攻毒。攻毒3周后，以间接免疫荧光试验、肺脏荷菌数和病理组织学变化评价攻毒后的免疫保护效果。试验结果表明，融合DNA疫苗免疫后产生的血清抗体水平、淋巴细胞增值（SI值）水平、IFN～γ和IL-2水平明显高于多价DNA疫苗（p＜0.05），以rMAE蛋白为包被抗原和刺激原时BCG免疫组的抗体水平、SI值和分泌的IFN～γ、IL-2的量明显低于融合DNA疫苗组，而与多价DNA疫苗组相当，以牛分枝杆菌PPD为包被抗原和刺激原时BCG免疫组的体液和细胞免疫指标均明显优于各DNA疫苗组。从攻毒保护效果来看，融合DNA疫苗组的保护效果明显优于多价DNA疫苗，达到了BCG疫苗的免疫保护水平，表明本研究制备的融合DNA疫苗具有良好的用前景，从而为牛结核病新型疫苗的研究奠定了基础。
李岩,邓军霞,管大伟[10]（2007）在《结核杆菌pIHSP65真核表达载体的构建和表达》文中研究表明目的构建结核杆菌热休克蛋白65KD（HSP65）基因真核表达载体pIHSP65,并在Hela细胞中表达。方法从结核杆菌H37Rv株的基因组中扩增HSP65基因,克隆到双顺反子真核表达载体pIRES的多克隆位点A中,构建pIHSP65真核表达载体,采用阳离子多聚体将其转染到Hela细胞中,用免疫组化染色法检测HSP65基因的表达。结果所克隆的HSP65基因片段经测序完全正确。重组质粒转染Hela细胞后,用免疫组化染色法检测有HSP65蛋白的表达。结论成功构建了结核杆菌pIHSP65真核表达载体,并在Hela细胞中有效表达,为构建双抗原双顺反子真核表达质粒,以及在整体动物水平的实验研究奠定了基础。
二、结核杆菌热休克蛋白-65重组质粒的构建及其在真核细胞中的初步表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、结核杆菌热休克蛋白-65重组质粒的构建及其在真核细胞中的初步表达（论文提纲范文）
（1）结核分枝杆菌新型疫苗的制备及其免疫效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 第一部分 结核分枝杆菌 Ag85B-Hsp65、ESAT6-Hsp65 融合基因DNA 疫苗株的构建及免疫效果评价 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第二部分 卡介苗 ure C 基因缺失株的构建及筛选 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 结核病与结核疫苗 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（3）新型免疫刺激分子增强DNA疫苗免疫原性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩略语说明 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 CpG佐剂与DNA疫苗 |
| 1.2 CpG基序的作用机理及免疫学作用 |
| 1.3 CpG结构特征与其免疫刺激特性 |
| 1.3.1 核心结构 |
| 1.3.2 侧翼序列 |
| 1.3.3 骨架长度 |
| 1.3.4 回文结构 |
| 1.3.5 骨架结构 |
| 1.4 本研究的内容、目的和意义 |
| 第二章 麻风分枝杆菌热休克蛋白HSP65的表达、纯化及小鼠多克隆抗体的制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 实验试剂与仪器设备 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 E.coli感受态细胞的制备 |
| 2.1.5 hsp65基因的PCR扩增 |
| 2.1.6 重组表达质粒pET28ahsp65的构建 |
| 2.1.7 目的基因的诱导表达 |
| 2.1.8 重组蛋白的纯化 |
| 2.1.8.1 可溶性重组蛋白的纯化 |
| 2.1.8.2 包涵体的纯化及复性 |
| 2.1.9 Anti-Hsp65小鼠多克隆抗血清的制备 |
| 2.1.10 Anti-Hsp65小鼠多克隆抗体效价的检测 |
| 2.1.11 Western-blotting检测 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 hsp65基因PCR扩增产物的鉴定 |
| 2.2.2 原核重组表达质粒的构建与鉴定 |
| 2.2.3 重组蛋白Hsp65表达产物的鉴定 |
| 2.2.4 重组蛋白Hsp65纯化产物的鉴定 |
| 2.2.5 Anti-Hsp65小鼠多克隆抗体的效价 |
| 2.2.6 Western-blotting鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 新型CPG基序重组质粒增强小鼠免疫效应 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株与质粒 |
| 3.1.2 实验试剂与仪器设备 |
| 3.1.3 实验动物 |
| 3.1.4 小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞培养 |
| 3.1.4.1 RAW264.7细胞解冻复苏 |
| 3.1.4.2 RAW264.7细胞培养 |
| 3.1.5 真核表达载体pVAX1hsp65的构建 |
| 3.1.6 寡聚脱氧核苷酸的设计 |
| 3.1.7 真核表达载体pVAX1hsp65CpG01与pVAX1hsp65CpG02的构建 |
| 3.1.8 重组质粒的体外瞬时转染及表达产物鉴定 |
| 3.1.9 实时荧光定量PCR法检测细胞因子的表达 |
| 3.1.9.1 RAW264.7细胞总RNA提取 |
| 3.1.9.2 RT-PCR法制备cDNA |
| 3.1.9.3 实时荧光定量PCR |
| 3.1.10 免疫用质粒DNA的大量制备 |
| 3.1.11 实验动物分组和DNA免疫 |
| 3.1.12 间接ELISA测定血清抗体效价 |
| 3.1.13 抗体分型 |
| 3.1.14 小鼠脾脏分离及淋巴细胞制备 |
| 3.1.15 IFN-γ ELISPOT |
| 3.1.16 胞内细胞因子染色与流式细胞检测 |
| 3.1.17 ELISA检测脾培养上清细胞因子 |
| 3.1.18 数据作图与统计分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 重组质粒构建和鉴定 |
| 3.2.2 重组质粒瞬时转染人胚肾上皮细胞系293T细胞 |
| 3.2.3 实时荧光定量PCR法检测细胞因子的表达 |
| 3.2.4 不同重组质粒诱导的体液免疫应答分析 |
| 3.2.5 不同重组质粒诱导的细胞免疫应答分析 |
| 3.2.6 不同重组质粒诱导的脾淋巴细胞培养上清分泌的细胞因子 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 内含子A增强HSP65的表达效率及提高DNA疫苗在小鼠中诱导的免疫原性 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌株与质粒 |
| 4.1.2 实验试剂与仪器设备 |
| 4.1.3 实验动物 |
| 4.1.4 真核表达载体pCMV4.0hsp65与pVAX1hsp65的构建 |
| 4.1.5 重组质粒的体外瞬时转染及表达产物鉴定 |
| 4.1.6 免疫用质粒DNA的大量制备 |
| 4.1.7 实验动物分组和DNA免疫 |
| 4.1.8 ELISA检测血清抗体水平及抗体亚类 |
| 4.1.9 小鼠脾淋巴细胞制备及IFN-γ ELISPOT测定 |
| 4.1.10 胞内细胞因子染色与流式细胞检测 |
| 4.1.11 数据作图与统计分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 重组真核表达质粒的构建和酶切鉴定 |
| 4.2.2 重组表达质粒体外瞬时转染及表达产物鉴定 |
| 4.2.3 不同载体诱导的体液免疫应答分析 |
| 4.2.4 不同载体诱导的细胞免疫应答分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 实验室常规培养基及分子生物学试剂 |
| 附录2 基因序列 |
| 附录3 载体图谱 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（4）MAP Hsp65和GPV VP3真核表达载体的构建及免疫效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 小鹅瘟概述 |
| 1.2 热休克蛋白Hsp65 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 MAP Hsp65与GPV VP3融合基因真核表达载体构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 重组质粒pVAX1-hsp65-VP3的免疫效果研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因DNA疫苗的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（6）柔嫩艾美耳球虫rhomboid基因重组卡介苗的构建及其免疫保护性研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 寄生虫重组卡介苗的研究 |
| 1.1 重组卡介苗的特点 |
| 1.2 重组卡介苗的构建 |
| 1.3 重组卡介苗抗寄生虫感染 |
| 1.4 重组卡介苗的应用 |
| 第2章 鸡球虫病免疫预防及现状 |
| 2.1 球虫病的流行与危害 |
| 2.2 球虫疫苗研究现状 |
| 2.3 球虫病免疫机制的研究 |
| 2.4 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 重组质粒pMV261-Rho和pMV361-Rho的构建及在卡介苗中的表达 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 重组卡介苗pMV261-Rho和pMV361-Rho对鸡柔嫩艾美耳球虫的免疫保护性实验 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 EGFP标记重组质粒pMV361-Rho-EGFP的构建及在鸡体内分布研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 重组质粒pMV261-Rho-IL-2 和pMV361-Rho-IL-2 的构建及在卡介苗中的表达 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 重组卡介苗pMV261-Rho-IL-2 和pMV361-Rho-IL-2 对鸡柔嫩艾美耳球虫的免疫保护性实验 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 pMV261 和 pMV361 载体图谱 |
| 攻博期间发表的学术论文及其他成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
（7）人结核杆菌热休克蛋白65和Ag85A基因真核双表达质粒的构建和体外表达（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 一、材料 |
| 二、结核杆菌H37Rv的培养及菌液处理 |
| 三、引物设计 |
| 四、Hsp65和Ag85A基因的扩增 |
| 五、真核双表达质粒pIRES-Hsp65-Ag85A的构建 |
| 六、重组质粒pIRES-Hsp65-Ag85A的细胞转染和表达 |
| 结 果 |
| 一、Hsp65和Ag85A基因的PCR扩增 |
| 二、重组质粒pIRES-Hsp65的PCR和双酶切鉴定 |
| 三、重组质粒pIRES-Hsp65-Ag85A的PCR和双酶切鉴定 |
| 四、重组质粒pIRES-Hsp65-Ag85A在Hela细胞中的表达 |
| 讨 论 |
（8）副结核分枝杆菌hsp65基因的克隆、表达与免疫研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 前言 |
| 1.副结核病的危害 |
| 2.副结核分枝杆菌的生物学特性 |
| 3.副结核分枝杆菌的分子生物学特征 |
| 4.野生动物与副结核病 |
| 5.副结核病的基因分型技术与分子流行病学 |
| 6.副结核分枝杆菌与克隆病 |
| 7.副结核分枝杆菌相关蛋白研究进展 |
| 8.副结核病的发病机制 |
| 9.副结核病的诊断 |
| 10.防治 |
| 11.核酸疫苗 |
| 12.热休克蛋白 |
| 13.热休克蛋白60 |
| 14.本研究的目的和意义 |
| 第二部分 实验内容 |
| 实验一 副结核分枝杆菌hsp65基因的克隆及序列分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 副结核分枝杆菌染色体基因组DNA的提取 |
| 3.2 目的基因的PCR扩增产物 |
| 3.3 重组克隆的筛选及鉴定 |
| 3.4 目的基因的序列测定与分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 目的基因的选择 |
| 4.2 PCR扩增及其它反应条件的优化 |
| 4.3 基因克隆的载体 |
| 4.4 外源DNA转化入宿主菌的原理和影响因素 |
| 4.5 hsp65基因的核苷酸序列作为分枝杆菌进化指征的依据 |
| 4.6 目的基因的序列分析 |
| 5 小结 |
| 实验二 副结核分枝杆菌hsp65基因的原核表达 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 原核重组表达质粒的构建 |
| 3.2 阳性重组表达质粒的鉴定 |
| 3.3 SDS-PAGE分析 |
| 3.4 Western blot分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 融合表达和非融合表达 |
| 4.2 表达系统 |
| 4.3 目的蛋白的纯化与功能 |
| 5 小结 |
| 实验三 副结核分枝杆菌hsp65基因真核表达载体的构建及表达 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 真核表达质粒的构建 |
| 3.2 重组表达质粒的鉴定 |
| 3.3 质粒的含量和纯度 |
| 3.4 荧光抗体检测 |
| 3.5 RT-PCR鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 表达载体与转染方法的选择 |
| 4.2 Hsp65抗原性的初步分析 |
| 4.3 串联质粒的作用 |
| 5 小结 |
| 实验四 副结核分枝杆菌hsp65基因对实验动物的免疫研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组表达质粒的纯度 |
| 3.2 免疫小鼠淋巴细胞转化试验 |
| 3.3 免疫小鼠CD3~+T、CD4~+T、CD8~+T细胞数量 |
| 3.4 免疫小鼠血清中特异性抗体水平 |
| 3.5 免疫小鼠IFN-γ的检测 |
| 3.6 免疫豚鼠变态反应检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Hsp10蛋白 |
| 4.2 免疫时加入普鲁卡因的作用 |
| 4.3 免疫小鼠的细胞免疫应答 |
| 4.4 免疫小鼠血清中特异性抗体水平 |
| 4.5 免疫豚鼠的变态反应 |
| 4.6 对今后研究的设想 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）牛结核病DNA疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 牛结核病简介 |
| 1.1.1 病原 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 牛结核病的诊断 |
| 1.1.4 免疫预防 |
| 1.1.5 综合防制措施 |
| 1.1.6 展望 |
| 1.2 牛结核病疫苗研究现状 |
| 1.2.1 减毒疫苗 |
| 1.2.2 重组卡介苗(rBCG) |
| 1.2.3 亚单位疫苗 |
| 1.2.4 DNA疫苗 |
| 1.2.5 其它牛结核病疫苗 |
| 第二章 牛结核病单价及二价融合DNA疫苗的初步研究 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 载体、菌种和细胞 |
| 1.2 血清与二抗 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要溶液和培养基的配制 |
| 1.6 主要仪器 |
| 1.7 牛分枝杆菌的培养及其基因组DNA的提取 |
| 1.8 引物的设计 |
| 1.9 目的基因的扩增 |
| 1.10 PCR产物与pMD18-T载体的连接转化 |
| 1.11 重组质粒的鉴定 |
| 1.12 真核表达载体的构建 |
| 1.13 兔抗牛分枝杆菌PPD和HSP65血清的制备 |
| 1.14 重组质粒在SP2/0细胞中的瞬时表达 |
| 1.15 重组质粒的大量提取 |
| 1.16 动物分组及DNA免疫接种 |
| 1.17 免疫小鼠血清中特异性抗体的测定 |
| 1.18 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖试验 |
| 1.19 免疫小鼠IFN～γ水平的测定 |
| 1.20 数据处理 |
| 2.结果 |
| 2.1 目的基因的PCR扩增 |
| 2.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.3 目的片段的序列分析 |
| 2.4 重组质粒在SP2/0细胞中的表达 |
| 2.5 免疫小鼠血清特异性抗体的检测 |
| 2.6 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖试验 |
| 2.7 免疫小鼠脾淋巴细胞IFN～γ分泌情况 |
| 3.讨论 |
| 第三章 牛结核病融合及多价组合DNA疫苗的研究 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 载体、菌种和细胞 |
| 1.2 血清、二抗和实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要溶液和培养基的配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 1.6 目的基因引物的设计 |
| 1.7 目的基因的扩增 |
| 1.8 PCR产物与pMD18-T载体的连接及重组质粒的鉴定 |
| 1.9 原核表达载体的构建 |
| 1.10 重组质粒pET-MAE在大肠杆菌中的诱导表达及纯化 |
| 1.11 纯化蛋白的浓度测定 |
| 1.12 真核表达载体的构建 |
| 1.13 真核表达质粒的体外转染 |
| 1.14 动物分组及DNA免疫接种 |
| 1.15 间接ELISA检测小鼠血清抗体效价 |
| 1.16 脾淋巴细胞增殖试验 |
| 1.17 免疫小鼠脾细胞分泌的IFN～γ和IL-2水平的测定 |
| 1.18 牛分枝杆菌BCG的攻毒试验 |
| 1.19 攻毒小鼠肺脏荷菌量的测定 |
| 1.20 攻毒小鼠肺组织间接免疫荧光试验 |
| 1.21 攻毒后小鼠肺脏病理变化 |
| 1.22 数据处理 |
| 2.结果 |
| 2.1 目的基因的PCR扩增 |
| 2.2 重组质粒pMD-E6、pMD-MA-1和pMD-MA-2的酶切鉴定 |
| 2.3 重组质粒pET-MA和pET-MAE的酶切鉴定 |
| 2.4 rMAE蛋白的表达纯化及浓度的测定 |
| 2.5 重组质粒pCMA和pCMAE的鉴定 |
| 2.6 目的片段的序列分析 |
| 2.7 重组质粒pCMA和pCMAE的体外转染 |
| 2.8 小鼠血清特异性抗体的检测 |
| 2.9 小鼠脾淋巴细胞增殖水平的测定 |
| 2.10 免疫小鼠脾淋巴细胞IFN～γ分泌情况 |
| 2.11 免疫小鼠脾淋巴细胞IL-2分泌情况 |
| 2.12 攻毒小鼠肺组织荷菌数 |
| 2.13 小鼠肺脏间接免疫荧光试验 |
| 2.14 小鼠肺脏组织学病变(H.E染色) |
| 3.讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 a85b、esat-6、hsp65、mpb64基因和a85b-esat-6、hsp65-esat-6、mpb64-esat-6融合基因测序结果(seq)与牛分枝杆菌AF2122/97株相应基因的核苷酸同源性比较 |
| 附录2 mpb64-ag85b和mpb64-ag85b-esat-6融合基因测序结果(seq)与牛分枝杆菌AF2122D7株相应基因的核苷酸同源性比较 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）结核杆菌pIHSP65真核表达载体的构建和表达（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 HSP 65基因的扩增 |
| 1.2.2 pIHSP 65真核表达载体的构建与鉴定 |
| 1.2.3 细胞转染 |
| 1.2.4 HSP 65蛋白表达的免疫组化检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 HSP 65基因的扩增与回收 |
| 2.2 pIHSP 65真核表达载体的鉴定 |
| 2.3 HSP 65蛋白在Hela细胞中的表达 |
| 3 讨论 |
四、结核杆菌热休克蛋白-65重组质粒的构建及其在真核细胞中的初步表达（论文参考文献）
- [1]结核分枝杆菌新型疫苗的制备及其免疫效果研究[D]. 张真. 内蒙古医科大学, 2020(03)
- [2]内含子A提高分枝杆菌热休克蛋白65 DNA疫苗的免疫原性[J]. 吴娟,马辉,范小勇,曲勍,罗玉萍,Douglas B.Lowrie. 中华预防医学杂志, 2012(01)
- [3]新型免疫刺激分子增强DNA疫苗免疫原性的研究[D]. 吴娟. 南昌大学, 2011(04)
- [4]MAP Hsp65和GPV VP3真核表达载体的构建及免疫效果研究[D]. 张岩. 吉林农业大学, 2011(11)
- [5]结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因DNA疫苗的实验研究[D]. 袁伟. 北京协和医学院, 2011(11)
- [6]柔嫩艾美耳球虫rhomboid基因重组卡介苗的构建及其免疫保护性研究[D]. 王秋悦. 吉林大学, 2009(08)
- [7]人结核杆菌热休克蛋白65和Ag85A基因真核双表达质粒的构建和体外表达[J]. 马彦彬,戴五星,陈智浩,高红. 华中医学杂志, 2008(03)
- [8]副结核分枝杆菌hsp65基因的克隆、表达与免疫研究[D]. 徐凤宇. 吉林农业大学, 2008(11)
- [9]牛结核病DNA疫苗的研究[D]. 宫强. 中国农业科学院, 2007(01)
- [10]结核杆菌pIHSP65真核表达载体的构建和表达[J]. 李岩,邓军霞,管大伟. 新乡医学院学报, 2007(01)