一、DNA疫苗诱导健康小鼠细胞免疫及HBV转基因小鼠抗-HBs产生（论文文献综述）
薛萌[1]（2015）在《HepG2.2.15细胞来源的自噬小体疫苗（HBV+DRibbles）防治HBV感染及其免疫机制的实验研究》文中提出抗原的交叉递呈对于诱导肿瘤或病毒特异性免疫应答至关重要。我们前期研究证实：来源于肿瘤细胞的自噬小体（DRibbles）是肿瘤抗原的有效载体,能充分激活树突状细胞（DC）并显着提高其交叉递呈肿瘤抗原的能力,进而诱导具有治疗效果的抗肿瘤免疫应答。肿瘤细胞的DRibbles目前已进入临床应用研究。HBV主要感染肝细胞,由于肝细胞缺乏共刺激分子,直接提呈HBV抗原途径不能有效诱导CD8+T细胞的活化；因此,专职抗原递呈细胞的交叉提呈被普遍认为是诱导HBV特异性CD8+T细胞应答的重要途径。在慢性HBV感染过程中,机体存在HBV特异性免疫应答能力的受损状态,而感染机体针对HBV抗原缺乏有效的交叉递呈可能是引起HBV感染慢性化的原因之一。本研究拟提取转染HBV全长基因组的HepG2.2.15细胞的自噬小体（HBV+ DRibbles）,探讨HBV+ DRibbles疫苗对HBV感染的预防和治疗效果及其免疫机制。目的以HepG2.2.15细胞来源的自噬小体作为HBV疫苗,以高压尾静脉注射pAAV/HBV1.2质粒的C57BL/6小鼠作为HBV感染的动物模型,探讨HBV+ DRibbles疫苗对HBV感染的预防和治疗作用及其免疫机制。方法1.HBV+ DRibbles的制备和鉴定1.1不同药物（Rapamycin, Bortezomib, NH4CI）处理对数生长期HepG2.2.15细胞,差速离心法提取自噬小体（HBV+ DRibbles）;1.2 Western blot法检测不同药物处理组的HepG2.2.15细胞裂解液中HBsAg、LC3的水平以及HBV+ DRibbles中LC3的水平；1.3透射电子显微镜观察HBV+ DRibbles的形态；1.4 ELISA法检测HBV+ DRibbles中HBV抗原的相对含量。2.HBV+ DRibbles诱导DC细胞交叉递呈HBV抗原的实验研究重组HBsAg蛋白疫苗免疫野生型（Wild type,WT） C57BL/6小鼠,以表面抗体（anti-HBs）阳性小鼠的淋巴细胞作为HBsAg特异性细胞,体外用HBV+ DRibbles和HBsAg再刺激,ELISA法检测培养上清中IFN-y的含量；进一步分选出HBsAg特异性的CD4+和CD8+T细胞,体外分别用HBV+ DRibbles、HBsAg负载的DC细胞再刺激,ELISA法检测培养上清中IFN-y的含量。3. HBV+ DRibbles疫苗诱导HBV特异性细胞免疫应答的实验研究以不同剂量的HBV+ DRibbles疫苗淋巴结免疫WT C57BL/6小鼠,并设HBV-DRibbles疫苗对照组。于免疫第8天,体外HBV抗原及抗原肽再刺激小鼠淋巴细胞,ELISPOT法检测分泌IFN-γ细胞的数量。4.HBV感染小鼠模型的建立以文献中报道的方法将pAAV/HBV1.2质粒高压尾静脉注射WT C57BL/6小鼠,于质粒注射后不同时间点,ELISA法检测小鼠血清HBV抗原的相对含量,荧光定量PCR法检测血清HBVDNA的拷贝数,全自动生化仪酶法检测血清ALT、AST的水平,免疫组织化学技术检测肝细胞内HBcAg的表达,HE染色法观察肝组织的病理变化。5. HBV+ DRibbles疫苗预防HBV感染的实验研究以不同剂量的HBV+ DRibbles疫苗淋巴结免疫WT C57BL/6小鼠,第8天高压尾静脉注射pAAV/HBV1.2质粒。于免疫14天后ELISA法检测血清HBeAg水平,荧光定量PCR法检测血清HBV DNA拷贝数,免疫组织化学技术检测肝细胞内HBcAg的表达并计数HBcAg+肝细胞比例。6. HBV+ DRibbles疫苗预防HBV感染的机制研究6.1以30μg的HBV+ DRibbles疫苗淋巴结免疫WT C57BL/6小鼠,第8天高压尾静脉注射pAAV/HBV1.2质粒,同时设未免疫PBS对照组。在质粒注射同一天,疫苗免疫小鼠腹腔分别注射单克隆抗体,分组如下：注射PBS组、注射αCD4单克隆抗体组、注射αCD8单克隆抗体组、注射αCD4+αCD8单克隆抗体组。于免疫后第14天,ELISA法检测血清HBeAg水平,荧光定量PCR法检测血清HBV DNA拷贝数,免疫组织化学技术检测肝细胞内HBcAg的表达并计数HBcAg+肝细胞比例；6.2以HBV+DRibbles疫苗免疫WT C57BL/6小鼠的效应淋巴细胞与质粒注射小鼠的肝细胞共孵育,同时设正常小鼠的肝细胞作为对照。分别于培养不同时间点采用全自动生化仪酶法检测培养上清中ALT、AST的水平,ELISA法检测培养上清中IFN-γ的含量。7. HBV+ DRibbles疫苗治疗急性HBV感染的实验研究pAAV/HBV1.2质粒高压尾静脉注射WTC57BL/6小鼠,以小鼠感染HBV的初期模拟急性HBV感染阶段。7.1于质粒注射第3、5、7天,HBV+ DRibbles疫苗免疫HBV急性感染小鼠,并设PBS及重组HBsAg蛋白疫苗免疫对照组。于首次免疫第8天,HBV抗原及抗原肽体外再刺激淋巴细胞,ELISPOT法检测分泌IFN-γ细胞的数量；7.2相同分组与免疫,于免疫后不同时间点,ELISA法检测小鼠血清HBeAg、HBsAg、抗HBs抗体水平,荧光定量PCR法检测血清HBV DNA拷贝数,全自动生化仪酶法检测血清ALT、AST水平,免疫组织化学技术检测肝细胞内HBcAg的表达并计数HBcAg+肝细胞比例、HE染色观察肝组织的病理变化。8. HBV+ DRibbles疫苗治疗慢性HBV感染的实验研究pAAV/HBV1.2质粒高压尾静脉注射WT C57BL/6小鼠,以持续感染HBV达60天后的HBsAg耐受小鼠作为HBV慢性感染模型。8.1 HBsAg耐受小鼠的判定WT C57BL/6小鼠分为两组,一组按照前述方法建立模型,于质粒注射后第61、63、65天,重组HBsAg蛋白疫苗免疫HBsAg阳性小鼠；另一组小鼠按相同方案免疫。两组小鼠于免疫后第14天,ELISA法检测血清抗HBs抗体水平；8.2耐受小鼠以血清HBsAg水平分组,设HBV+ DRibbles疫苗免疫组、PBS及重组HBsAg蛋白疫苗免疫对照组。于质粒注射第61、63、65天免疫治疗。于首次免疫第8天,HBV抗原及抗原肽体外再刺激淋巴细胞,ELISPOT法检测分泌IFN-γ细胞的数量；8.3相同分组与免疫,于首次免疫第8天,收获淋巴细胞,分别尾静脉过继转移到新一批慢性HBV感染小鼠及对照组小鼠体内。于过继转移后的不同时间点,ELISA法检测小鼠血清HBsAg、anti-HBs抗体水平,荧光定量PCR法检测HBV DNA拷贝数,全自动生化仪酶法检测血清ALT、AST水平,免疫组织化学技术检测肝细胞内HBcAg的表达并计数HBcAg+肝细胞比例、HE染色观察肝组织的病理变化。结果1. HBV+ DRibbles的制备和鉴定1.1差速离心法提取不同药物处理组的HBV+ DRibbles,分装,-20℃保存；1.2各组细胞裂解液中均检测到分子量26KD的HBsAg的表达,3种药物联合处理组含量最高；加入Bortizomib组均出现分子量<26KD的HBsAg小片段,3种药物联合处理组的小片段更为明显。各组细胞裂解液中均检测到自噬特异性标记物LC3分子,以胞浆型LC3-Ⅰ为主,3种药物联合处理组中LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ含量最高；各组HBV+ DRibbles中均检测到自噬特异性标记物LC3分子,且以膜结合型LC3-Ⅱ为主,3种药物联合处理组LC3-Ⅱ含量最高；1.3 3种药物联合处理组的HepG2.2.15细胞自噬小体（HBV+DRibbles）,具有双层膜结构,直径100-1000nm；1.4与培养液对照组相比,3种药物联合处理组的HBV+ DRibbles中HBsAg和HBeAg含量明显升高。2. HBV+ DRibbles诱导DC细胞交叉递呈HBV抗原的实验研究HBV+ DRibbles作为富集HBV抗原的载体,体外再刺激HBsAg特异性淋巴细胞,与HBsAg蛋白刺激组相比,培养上清中能够产生更高水平的IFN-γ,差别具有统计学意义。进一步用HBV+ DRibbles、HBsAg负载的DC细胞再刺激HBsAg特异性CD4+、CD8+T细胞,与未负载抗原的对照组及负载HBsAg的DC细胞刺激组相比,负载HBV+ DRibbles的DC细胞刺激组均产生了更高水平的IFN-γ,差别具有统计学意义。3. HBV+DRibbles疫苗诱导HBV特异性细胞免疫应答的实验研究不同剂量的HBV+ DRibbles及HBV- DRibbles免疫WT C57BL/6小鼠,效应淋巴细胞经HBV抗原及抗原肽再刺激,与其他剂量组相比,30μg HBV+ DRibbles免疫诱导产生的分泌针对HBsAg及HBcAg特异性IFN-γ的细胞数量最高,差别具有统计学意义；与未免疫的PBS对照组相比,10μg与100μg HBV+ DRibbles免疫诱导产生的分泌针对HBsAg及HBcAg特异性IFN-γ的细胞数量均未见明显统计学差异；30νg HBV+ DRibbles免疫诱导产生的分泌针对HBsAg、HBcAg及相关肽特异性IFN-γ的细胞数量明显高于30μg HBV- DRibbles免疫组,差别具有统计学意义。4.HBV感染小鼠模型的建立以文献报道的方式,复建HBV感染的小鼠模型,于质粒注射后不同时间点,检测小鼠HBV感染状态。与未注射对照组及PBS注射对照组相比,质粒注射组小鼠血清ALT水平均未见明显统计学差异；而AST水平只在质粒注射后第3天显着高于未注射对照组,其余时间点未见明显差异。质粒注射第3天,所有小鼠血清均可检测到较高水平的HBsAg及HBeAg含量,随着观察时间的延长,含量逐渐降低；至第63天,部分小鼠血清中HBsAg及HBeAg已经低于检测下限。质粒注射第3天,所有小鼠血清均可检测到较高的HBV DNA水平（180.9±98.61×104 copies/ml）,至第63天,HBsAg阳性小鼠的血清仍可检测到HBV DNA （102×104,34.1×104 copies/ml）。质粒注射第3天,WT小鼠的肝组织结构正常,无病变；PBS注射组可见轻度的点状或小灶状坏死,局部可见少量中性粒细胞和单核-巨噬细胞的浸润；质粒注射组小鼠的肝细胞出现中度坏死,中央静脉区可见少量中性粒细胞浸润,至第7天,肝脏组织结构基本恢复正常,至第63天,亦未见明显病变。质粒注射第63天,HBsAg阳性小鼠的肝细胞中可检测到HBcAg表达,HBcAg既可分布于细胞浆,亦可分布于细胞核。5. HBV+ DRibbles疫苗预防HBV感染的实验研究不同剂量的HBV+ DRibbles及HBV- DRibbles免疫WT C57BL/6小鼠,于第8天注射质粒。质粒注射后不同时间点,与其他剂量组相比,30μgHBV+ DRibbles免疫组的小鼠血清HBeAg水平、HBV DNA拷贝数、肝细胞内HBcAg的表达及HBcAg+肝细胞比例均显着降低,具有统计学差异。与未免疫的PBS对照组相比,10μg、100μg HBV+ DRibbles疫苗及HBV- DRibbles疫苗免疫组的小鼠上述指标均未见明显变化。6. HBV+ DRibbles疫苗预防HBV感染的机制研究6.130μg HBV+ DRibbles免疫WT C57BL/6小鼠,设PBS对照组；第8天注射质粒,同时免疫组小鼠腹腔注射单克隆抗体以清除相应T细胞。结果可见：与PBS对照组相比,未清除T细胞的HBV+ DRibbles免疫组小鼠血清HBeAg水平、HBV DNA拷贝数及肝细胞HBcAg的表达及HBcAg+肝细胞比例均显着下降；只清除CD8+T细胞的免疫组小鼠上述指标与PBS对照组相比,未见明显统计学差异；同时清除CD4+和CD8+T细胞的免疫组小鼠上述指标相对于只清除CD8+T细胞的免疫组,差异无统计学意义；6.2 HBV+ DRibbles疫苗免疫小鼠的效应淋巴细胞与质粒注射小鼠的肝细胞共孵育,结果可见：与正常肝细胞共孵育组相比,免疫小鼠淋巴细胞与HBV感染的肝细胞共孵育组培养上清中ALT、AST水平均升高,ALT水平未见统计学差异,而AST水平具有明显统计学差异；同时培养上清中产生了更高水平的IFN-γ,差异具有统计学意义。7. HBV+ DRibbles疫苗治疗急性HBV感染的实验研究7.1以HBV+ DRibbles疫苗免疫急性HBV感染小鼠,效应淋巴细胞体外经HBV抗原及抗原肽再刺激。结果可见：与PBS对照组及重组HBsAg蛋白疫苗免疫对照组相比,HBV+ DRibbles疫苗免疫诱导分泌针对HBV抗原及抗原肽特异性IFN-γ的细胞数量明显增高,差别有统计学意义；而HBsAg免疫组未能诱导产生分泌IFN-γ的细胞；7.2 HBV+ DRibbles疫苗治疗急性HBV感染小鼠。结果可见：与PBS及重组HBsAg蛋白疫苗免疫的对照组相比,只有HBV+ DRibbles疫苗免疫能够明显降低小鼠血清HBeAg、HBsAg、HBVDNA水平、肝细胞内HBcAg的表达及HBcAg+肝细胞比例；而小鼠血清HBsAg的水平明显低于PBS对照组,高于HBsAg免疫组；部分小鼠血清产生抗HBs抗体,但平均水平明显低于HBsAg免疫对照组；且小鼠血清ALT、AST水平未见明显变化,肝组织结构基本正常,仅有少量炎细胞浸润。8. HBV+DRibbles疫苗治疗慢性HBV感染的实验研究8.1经重组HBsAg蛋白疫苗免疫后,WT小鼠血清产生了高水平的anti-HBs抗体,而pAAV/HBV1.2质粒注射后60天的模型小鼠血清中anti-HBs抗体阴性；8.2 HBV、DRibbles疫苗免疫HBsAg耐受小鼠,同时设PBS及HBsAg蛋白疫苗免疫对照组,体外HBV抗原及抗原肽再刺激各组小鼠效应淋巴细胞。结果可见：与PBS对照组相比,只有HBV+DRibbles疫苗免疫组小鼠的淋巴细胞在HBV抗原及抗原肽再刺激时,能够产生更高水平分泌IFN-γ的细胞数量,差异具有统计学意义；而重组HBsAg蛋白疫苗免疫组的小鼠淋巴细胞在HBV抗原及抗原肽再刺激后,分泌IFN-γ的细胞数量未见明显统计学差异；8.3 HBV、DRibbles疫苗治疗HBsAg耐受小鼠。结果可见：与PBS对照组及重组HBsAg蛋白疫苗免疫对照组相比,只有接受HBV+DRibbles免疫组淋巴细胞过继转移后,被过继转移小鼠血清中HBsAg水平、HBV DNA拷贝数、肝细胞内HBcAg的表达及HBcAg+肝细胞比例均明显降低,差异具有统计学意义,部分小鼠产生抗HBs抗体；被过继转移组小鼠血清ALT、AST水平无明显变化,肝组织结构基本正常,仅有少量小灶性坏死和炎细胞浸润。结论HBV+ DRibbles疫苗能够高效募集HBV抗原成份；作为HBV抗原的有效载体,能够有效活化DC细胞并交叉递呈HBV抗原；HBV+ DRibbles疫苗免疫能够诱导HBV特异性的细胞免疫应答,并有效预防HBV感染,其中,CD8+T细胞在抑制HBV病毒复制及清除HBV感染的肝细胞中发挥重要作用；HBV+ DRibbles疫苗免疫在HBV感染急性期能够诱导多种HBV抗原及抗原肽特异性的细胞免疫应答、抑制HBV的复制、清除HBV感染的肝细胞,对HBV急性感染具有明显的治疗效果；HBV+ DRibbles疫苗免疫在HBV感染慢性期能够打破免疫耐受、诱导HBV多特异性的细胞免疫应答,抑制HBV的复制、清除HBV感染的肝细胞,对HBV慢性感染具有明显的治疗作用；HBV+ DRibbles疫苗免疫对HBV急性和慢性感染的治疗未造成小鼠肝细胞明显的免疫病理损伤。提示HBV+ DRibbles疫苗在治疗HBV感染方面具有潜在的应用前景。
孟忠吉[2]（2014）在《乙型肝炎基因治疗的前景展望》文中进行了进一步梳理乙肝病毒（Hepatitis B Virus,HBV）感染呈全球分布,而我国乃至亚太地区是乙型肝炎高发地区,严重威胁人类健康。全球约20亿人曾感染过HBV,其中3.5亿人为慢性HBV感染者,每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞肝癌[1]。2006年全国乙型肝炎流行病学调查结果表明,我国159岁一般人群HBsA g携带率为7.18%,5岁以下儿童的HBsA g携带率为0.96%。据此推算,我国现有的慢性HBV感染者约9 300万
王颖慧[3]（2014）在《表达HBsAg基因的重组质粒与重组腺病毒的免疫学初步研究》文中研究表明乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）是病毒性肝炎的主要病原体之一,在我国广泛流行,可引起急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝细胞性肝癌等。现阶段的药物也只能通过减缓肝硬化进程、降低肝癌发生率来延长患者寿命,无法彻底治愈,严重危害着公众健康。因此,亟待发展一种能够彻底治愈HBV感染的方法,而治疗性疫苗是目前最具发展潜力的治疗手段之一。本研究选取重组质粒pVR-S与重组腺病毒rAdV-S进行免疫学初步研究,两者均表达我国人群中广泛分布的adr型乙肝病毒的S基因。首先,采用电击注射与肌肉注射两种方法给Balb/c小鼠免疫重组质粒pVR-S, ELISA检测HBsAb抗体水平,评价注射方法对免疫效果的影响；其次,分别间隔4周和3周免疫重组质粒pVR-S,根据体液免疫效果了解适宜的免疫间隔；再次,分别以重组质粒pVR-S单独免疫或者以重组腺病毒rAdV-S单独免疫,分析比较两者诱导的免疫效果：最后,联合免疫重组质粒pVR-S与重组腺病毒rAdV-S,采用ELISA和ELISpot分别检测体液免疫水平和细胞免疫水平,比较联合免疫与单独免疫对小鼠免疫应答的不同影响。实验结果发现,对重组质粒pVR-S而言,电击注射能够诱导较高强度的体液免疫应答,而单纯的肌肉注射诱导的体液免疫水平较低,且间隔4周免疫重组质粒pVR-S相对于间隔3周不仅能更快提升HBsAb抗体水平,还能减少所需的免疫次数。pVR-S引起体液免疫应答的速度较慢,至少在初次免疫后的第6周才会出现应答,而rAdV-S能够在短期内迅速诱导体液免疫应答,在初次免疫后第2周即可产生HBsAb抗体,最终单独免疫重组腺病毒rAdV-S诱导的体液免疫应答和细胞免疫应答水平也始终高于单独免疫重组质粒pVR-S。联合免疫pVR-S和rAdV-S能够比单独免疫pVR-S组产生更强的体液和细胞免疫效果,另外,仅免疫一次rAdV-S时,联合免疫组诱导的体液免疫和细胞免疫应答比单独免疫rAdV-S组强；而免疫两次rAdV-S时,联合免疫组诱导的细胞免疫应答也比单独免疫rAdV-S组强。综上,间隔4周电击注射重组质粒pVR-S能更好地诱导体液免疫应答。无论是体液免疫还是细胞免疫,重组腺病毒rAdV-S都能诱导产生比重组质粒pVR-S更好的免疫效果。更重要的是,联合免疫pVR-S与rAdV-S能够诱导比单独免疫组强度更高的细胞免疫应答,有助于提升机体的抗病毒能力。
揣侠[4]（2012）在《乙肝成体转基因小鼠模型在新型乙肝疫苗免疫方案优化与评价中的应用》文中研究说明乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV）)感染是严重危害人类健康的主要疾病之一。尽管预防性乙肝疫苗的广泛接种,极大的降低了HBV感染的发病率,但仍存在部分疫苗无/低应答人群及免疫逃逸现象,因而迫切需要研制新型有效的治疗性疫苗,打破机体的免疫耐受状态；并且由于HBV宿主范围狭窄,只感染人和少数灵长类动物,缺乏理想的小动物模型,限制了人们对HBV生物学特性、发病机制及新型疫苗与药物的研发和评价等方面的研究。基于HBV动物模型研究现状及疫苗发展的需求,本文在前期研究的基础上,将1.3拷贝的HBV基因组插入到自灭活HIV-1慢病毒载体系统转移载体骨架,构建重组的HBV转基因载体,并利用高压尾静脉注射的方法注入到小鼠体内,建立HBV成体转基因小鼠模型；同时制备含S+PreS1融合抗原的新型HBV颗粒样疫苗与重组病毒载体疫苗,优化不同佐剂组合方案或颗粒样疫苗与不同重组病毒载体疫苗联合应用,分析其在小鼠中诱导的抗原特异的免疫应答,初步优化HBV疫苗的免疫方案；进一步利用已建立的HBV成体转基因小鼠模型,基于前期优化的新型HBV疫苗的免疫方案,综合分析HBV疫苗所诱导的抗原特异性免疫应答特点,并评价疫苗免疫后在HBV感染小鼠体内的免疫保护和免疫清除作用。本研究取得的主要结果简述如下：一、乙肝成体转基因小鼠模型的建立及条件优化1、HBV基因组转导质粒的构建与结构优化利用慢病毒载体系统的转基因质粒pCS-CG骨架,筛选出正向插入1.3拷贝HBV基因组的pCS-HBV1.3K转基因载体质粒最适宜用作后续实验研究。2、两种HBV转基因载体质粒（pCS-HBV1.3与pAAV-HBV1.3）用于建立HBV成体转基因小鼠模型的比较分别将筛选出的pCS-HBV1.3K（以下简称pCS-HBV1.3）与前期构建的pAAV-HBV1.3质粒经高压水动力法尾静脉注射到C57BL/6小鼠体内,比较HBV标志物的表达,发现pCS-HBV1.3注射后,小鼠体内上述HBV标志物持续时间长,抗体出现晚,且肝组织中HBV DNA水平高,因而确定转基因载体质粒pCS-HBV1.3更适合于建立HBV持续感染动物模型。3、小鼠品系、性别、年龄及质粒注射量对建立HBV成体转基因小鼠模型的影响分别选择不同品系（C57BL/6和BALB/c）、不同剂量（5μg或10μg）、不同年龄（6周龄和18周龄）、不同性别的小鼠注射pCS-HBV1.3质粒,发现6周龄雌性C57BL/6小鼠更适合建立HBV持续感染模型。二、新型HBV颗粒样疫苗与不同佐剂或不同载体疫苗联合应用在小鼠中诱导的免疫应答特征分析1、HBV新型颗粒疫苗与重组病毒载体疫苗的制备与鉴定分别构建制备了含HBVS+PreS1、C+PreS1融合抗原的重组痘苗病毒载体疫苗,含HBV S+PreS1融合抗原的重组腺病毒载体疫苗,证实目的蛋白的表达；用电镜及免疫电镜的方法证实CHO表达的含S+PreS1融合抗原疫苗HBSS1的表达及颗粒结构。2、含HBV S+PreS1融合抗原的新型颗粒疫苗与重组痘苗病毒载体疫苗联合免疫在小鼠体内的免疫效果评价比较含HBV S+PreS1融合抗原的蛋白颗粒疫苗和重组痘苗病毒的不同联合免疫策略,发现HBV新型蛋白颗粒疫苗初免、重组痘苗病毒加强后可加速抗体阳转,产生高水平的S及PreS1的特异性抗体和细胞免疫反应,同时伴有高水平的CD4+和CD8+T细胞分泌的Th1型细胞因子IFN-γ和TNF-α产生,明显优于蛋白颗粒疫苗同源免疫方案及重组痘苗病毒初免、蛋白颗粒疫苗加强的联合免疫方案。3、HBV颗粒样疫苗结合不同佐剂初免与重组腺病毒载体疫苗联合免疫诱发的免疫应答特点分析HBV疫苗应用CpG和A1（OH）3佐剂可提高HBVS蛋白疫苗的抗体阳转率和抗体滴度,并且重组腺病毒加强以后,抗原特异性的细胞免疫亦有所增强；而对于含S+PreS1融合抗原新型HBV蛋白颗粒疫苗,CpG和PolyI：C联合铝佐剂可产生高水平的S及PreS1的特异性抗体以及抗原特异性的细胞免疫反应,HBSS1联合Poly I:C/Alum混合佐剂初免重组腺病毒加强后,同时伴有高水平的CD4+和CD8+T细胞分泌的Th1型细胞因子IFN-y和IL-2产生；未观测到CNB佐剂及其联合Alum佐剂后对HBSS1抗体反应和细胞免疫应答的增强作用。三、HBV成体转基因小鼠模型应用于HBV新型疫苗免疫保护与免疫清除效果评价1、HBV转基因小鼠模型在新型HBV疫苗免疫保护评价中的应用在前述HBV疫苗免疫方案优化的研究基础上,首先选用含S+PreS1融合抗原新型HBV蛋白颗粒疫苗（HBSS1）与含S蛋白HBV颗粒疫苗（HBS）结合不同佐剂、或蛋白颗粒疫苗与重组痘苗病毒载体疫苗（RVJSS1）,或蛋白颗粒疫苗与重组腺病毒载体疫苗（rAdSSl）联合免疫小鼠,系统比较了其抗原特异性体液与细胞免疫应答特点；末次免疫后2周采用pCS-HBV1.3质粒攻击对照小鼠与各疫苗免疫小鼠建立HBV持续感染状态。然后比较小鼠血清HBsAg、HBeAg、 HBV DNA及肝组织DNA表达水平变化。发现在上述疫苗免疫后诱导的抗S抗体均能清除血清HBsAg;而HBSS1联合RVJSS1或rAdSSl可同时清除血清HBsAg和HBV DNA,并可显着降低血清HBeAg的表达水平。进一步采用统计学方法分析疫苗诱发的免疫应答与免疫保护的相关性,发现免疫保护除与其诱导的高滴度的S、PreS1特异性的抗体应答相关外,还与其诱发的多种抗原特异性的细胞因子密切相关。2、HBV转基因小鼠模型在HBV新型疫苗免疫清除评价中的应用选取6周龄的C57BL/6小鼠,在免疫前5天尾静脉高压注射5μgpCS-HBV1.3,建立HBV慢性感染的小鼠模型,之后接受不同方案HBV疫苗的组合免疫,如前所述,采用多种方法系统分析不同HBV疫苗免疫方案所诱导的抗原特异性免疫应答及HBV慢性感染的小鼠血与肝组织中HBV标志物,并用统计学方法分析免疫应答与HBV清除效果的相关性。结果发现：HBSS1联合重组痘苗病毒或重组腺病毒载体疫苗,可清除血清HBsAg抗原血症,显着降低血清中HBeAg及HBV DNA水平；清除效果主要与其诱导的高滴度的S、PreS1特异性的抗体应答和Thl型细胞免疫应答密切相关。本研究结果为新型HBV疫苗的进一步研发与应用奠定了基础。
梁勇[5]（2012）在《胸腺素α原/白介素2融合质粒的免疫佐剂效果研究》文中研究说明白介素2（IL-2）是一种主要由激活的T淋巴细胞分泌的细胞因子,在临床上常作为佐剂用于辅助治疗各种疾病,但IL-2在体内半衰期很短,常使用大剂量以达到治疗效果,而大量的IL-2会引起毒副作用。胸腺素α原（proTα）可以调节IL-2诱导的淋巴因子激活杀伤细胞的细胞毒性,降低单独使用IL-2时的毒副作用。基于此原因,周飞燕等应用基因重组技术构建了胸腺素α原/白介素2融合质粒（ProTα/IL-2）,以期作为疫苗佐剂进行研究。本试验对ProTα/IL-2质粒作为分子佐剂的免疫增强效果进行了研究。通过联合使用HBV DNA疫苗与ProTα/IL-2质粒,通过体内电转染的方式分别免疫Balb/C小鼠和HBV转基因小鼠,在不同的时期取小鼠血,进行体液免疫指标检测。HBV转基因小鼠试验中,取小鼠腹腔巨噬细胞和脾细胞进行细胞免疫指标检测。结果显示,Balb/C小鼠试验中增强免疫后,单独使用pS2·S抗体转阳率16/20,抗体OD450为免疫后14天（0.106±0.037）、28天（0.177±0.094）、35天（0.270±0.120）、42天（0.426±0.207）、49天（0.459±0.229）和56天（0.441±0.204）,49天至56天抗体OD450开始呈下降趋势；联用ProTα/IL-2组抗体转阳率为20/20,抗体OD450为免疫后14天（0.213土0.140）、28天（0.456±0.148）、35天（0.616±0.122）、42天（0.697±0.089）、49天（0.806±0.113）和56天（0.862±0.129）,仍有一定上升趋势。抗-HBs阳转时间试验结果显示,小鼠免疫7天,pS2·S组和pS2·S+ProTα/IL-2组均有小鼠发生抗体转阳,pS2·S组OD450为（0.111,0.106,0.056,0.069）,pS2·S+ProTα/IL-2组（0.199,0.138,0.191,0.095）；小鼠免疫6天,pS2·S+ProTα/IL-2组有2只小鼠发生抗-HBs阳转,OD450为0.106和0.120,pS2·S组未见小鼠发生抗-HBs阳转。HBV Tg小鼠试验中,联用proTα/IL-2与单独使用pS2·S相比,增强免疫后42天小鼠血清中HBsAg OD450下降值单独免疫pS2·S组为（0.048±0.010）,联用ProTα/IL-2组为（0.134±0.016）,差异明显。腹腔巨噬细胞吞噬活性联用ProTα/IL-2A570值为（0.353±0.024）,单独使用pS2·S为（0.262±0.017）,p<0.01；单独使用pS2·S组淋巴细胞转化率为1.355,联用proTα/IL-2组淋巴细胞转化率为1.526,p<0.05；诱使淋巴细胞产生IL-2,单独使用pS2·S组为（134.110±15.416）ng/L,联用proTα/IL-2组为（338.583±38.710）ng/L,p<0.01；诱使淋巴细胞产生IL-4,单独使用pS2·S组为（71.06±21.06）ng/L,联用ProTα/IL-2组为（166.03±32.82）ng/L,p<0.01；Elispot结果显示联用ProTα/IL-2诱生特异性IFN-γ细胞数为（365.707±41.150）个,单独使用pS2·S组为（72.323±29.022）个,p<0.01。结果显示,ProTα/IL-2可以诱使小鼠更快的产生抗体,同时延长产生抗体的时间,提高产生的抗体滴度；能增强腹腔巨噬细胞的吞噬活性,提高淋巴细胞转化率；能诱使淋巴细胞更多的产生细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ。以上结果表明ProTα/IL-2能够显着提高pS2·S诱导的免疫效果。
祝玲玲,朱平安,谭德明[6]（2008）在《治疗性HBVDNA疫苗的研究进展》文中认为乙型肝炎病毒（HBV）的持续感染可引起肝脏疾患,甚至肝硬化和原发性肝细胞癌。近年来,HBVDNA疫苗在治疗慢性HBV携带者和慢性乙型肝炎方面越来越引起人们的重视。本文主要就治疗性HBVDNA疫苗的构成、治疗慢性乙型肝炎的依据及其研究进展进行综述。
杨富强[7]（2008）在《细胞因子融合蛋白质粒及在体电脉冲技术增强治疗性HBV DNA疫苗免疫效果的研究》文中研究说明乙型肝炎病毒（HBV）感染患者自身抗HBV特异性细胞免疫状态是决定HBV感染自然史和转归的重要因素之一,探寻有效的免疫调节治疗手段来激活或增强慢性乙型肝炎（CHB）患者机体抗HBV特异性细胞免疫应答,以达到打破免疫耐受或提高现有抗病毒药疗效的目的,是目前慢性HBV感染防治领域研究热点,将成为今后抗病毒治疗策略调整的趋势。由于抗原的表达、修饰及合成在宿主细胞内进行,并通过MHC-Ⅰ类抗原复合物方式递呈,DNA疫苗能更有效诱导机体特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性。因此,DNA疫苗具有传统疫苗所不具备的优势,在抗病毒性感染（如HBV、HIV）和肿瘤的基础及临床试验中都表现出良好的应用前景。然而,初步的临床试验结果表明,由HBV包膜中蛋白（PreS2+S）编码基因构建的DNA疫苗治疗慢性HBV携带者,HBV特异性IFN-γ分泌T淋巴细胞检出率及血清HBV DNA水平下降并不非常明显。影响该项基因治疗技术发展的最主要的困难是:（1）DNA疫苗质粒在宿主体内转染率比较低;（2）质粒的免疫原性不强。为了解决第一个问题,我们应用了在体电脉冲（EP）技术,成功地提高了HBVDNA疫苗在大体重动物比如非人灵长类动物中的转染率,并且能有效诱导体液免疫和细胞免疫应答。为解决第二个技术难题,我们设计构建了Th1型细胞因子（IL-2和IFN-γ）融合蛋白基因表达质粒（pFP）,用以增强DNA疫苗免疫接种局部抗原递呈细胞（APC）的抗原递呈功能,有助于促进Th1细胞分化并利于特异性体液免疫和细胞免疫应答的诱导。本项研究以BALB/c小鼠、新西兰家兔、非人类灵长类动物猴及HBV转基因（Tg）小鼠为动物模型和研究对象,评价和探讨pFP及EP分别增强和提高治疗性HBV DNA疫苗免疫原性及质粒宿主细胞内转染率的辅助效果和机理。第一章双质粒HBV DNA疫苗及在体电脉冲仪（EP）的研制和检定治疗性双质粒HBV DNA疫苗系采用基因重组技术构建的HBV包膜中蛋白（preS2+S）基因真核表达质粒（HBV DNA疫苗）联合佐剂质粒组成的双质粒治疗性DNA疫苗。在接种HBV DNA疫苗的同时,联合注射编码人白细胞介素融合蛋白（IL-2/IFN-γ）基因质粒作为佐剂,以辅助前者对机体免疫应答的诱导,使其激活的T细胞向Th1亚群分化,以期望更有效地诱导产生细胞免疫应答而打破因慢性HBV感染所导致的机体免疫耐受,达到清除病毒的治疗目的。本研究中,将编码HBV胞膜中蛋白的基因序列插入真核表达载体pcDNA3.1构建了重组pS2.S质粒。为增强其免疫原性,我们构建了IL-2/IFN-γ融合蛋白佐剂质粒pFP,它是由IL-2信号肽序列,IL-2全基因序列,24bp连接序列（编码AGSGGGGS）以及IFN-γ的全基因序列顺序连接在pCR的钝端构成。分子模拟根据pFP基因编码的IL-2和IFN-γ融合蛋白的一级结构进行。pFP所表达的蛋白的空间构象及与天然IL-2和IFN-γ构象的比较通过数字分子模型软件来（New Providence,PA）完成。用脂质体转染试剂转染COS-7细胞,以ELISA,增强化学发光法（ECL）-Western blotting检测转染细胞培养上清中目的基因表达,并分别以CTLL-2依赖细胞株/MTT比色法和微量细胞病变抑制法（WISH-VSV）检测pFP转染后不同时间点培养上清中IL-2及IFN-γ活性。双质粒转染COS-7细胞后24 h能检测到目的蛋白表达,48 h时蛋白表达达最高值,其中HBsAg、IL-2和IFN-γ的浓度分别为17.6,9.2,8.6μg/L,72,96 h时蛋白表达呈明显下降趋势。而转染空载体和未转染质粒细胞上清均未检测到HBsAg、IL-2和IFN-γ抗原活性。双质粒转染表达产物的ECL Westernblotting鉴定结果,对照组未转染细胞上清和转染空载体均未检测出任何阳性反应条带,而pS2.S及pFP分别在分子质量为30.6 kD及110kD处有特异性反应条带。根据pFP基因编码的IL-2/IFN-γ融合蛋白的一级结构模拟出其空间结构。表达IL-2/IFN-γ融合蛋白的空间结构能够和天然的IL-2、IFN-γ空间结构很好的对应起来,这表明8个氨基酸的连接物能够保证表达的IL-2和IFN-γ蛋白在空间折叠时互不影响,并能保证IL-2和IFN-γ的生物活性区域充分暴露在融合蛋白的表面。用IL-2和IFN-γ标准品作为对照,检测pFP转染细胞上清中的细胞因子活性实验结果表明,IL-2和IFN-γ具有生物学活性,转染后48 h时上清中IL-2和IFN-γ的活性分别为260和80.5 U/mL,为检测最高值,与相同样本来源的ELISA检测上清浓度的高峰值一致,这为质粒pFP在治疗性HBV DNA疫苗免疫过程中发挥佐剂作用的研究奠定了物质结构基础。在体电脉冲技术（EP）的电脉冲发生器和电极由上海交通大学药学院提供,可发射0-300V电压的方波信号,一个脉冲持续10μs-100 ms。两个针头用的是针灸治疗中所使用的针头,长1.2mm,直径0.3mm。两个针头距离1cm,分别代表阳极和阴极。以绿色荧光蛋白（GFP）及荧光素酶（LUC）编码基因作为报告基因,观察上述蛋白表达质粒（pGFP,pLUC）经EP导入小鼠胫前肌（TA）后目的蛋白的表达以及组织病理改变情况。结果显示,EP处理中央部位肌肉组织损伤较为严重,可观察到明显肌细胞溶解、坏死及炎症的发生,而边缘区损伤较轻微。早期质粒转染成功并表达目的基因产物的肌细胞以边缘区域为主,可观察到较强的绿色荧光信号。EP转染5天荧光信号为高峰并随时间的推移而逐步衰减,期间损伤严重的中央区域组织修复同时进行,至21天肌肉组织基本恢复正常并可观察到GFP阳性纤维的出现,系细胞核置于中央的再生肌纤维。pLUC转染小鼠TA实验结果,经EP介导的的8只BALB/c小鼠局部TA组织荧光素酶活性为16136.3±9588.7RLU,而同期未经EP介导的对照组酶活性仅为8.0±8.0RLU,组间相差4个数量级,差异具非常显着性（t=4.757,P=0.002）。第二章pFP增强DNA疫苗免疫原性的实验研究观察佐剂质粒（pFP）以不同剂量和给药方式联合DNA疫苗（pS2·S）应用诱导机体体液免疫（血清抗-HBs水平）的效果,摸索出最适的免疫接种方法（包括免疫剂量、双质粒配伍和给药途径）,以提高DNA疫苗的体内免疫效果并为下一步确定细胞免疫实验中动物接种方式提供参考。2.1 pFP联合HBV DNA疫苗免疫诱导体液免疫结果三个不同剂量的HBV DNA疫苗（pS2.S）单独免疫BALB/c小鼠后血清抗—HBs水平及阳性数观察结果,大（100μug/只）、中剂量组（50μg/只）初次免疫2周时分别为86.0±46.6mIU/ml,45.8±26.0mIU/ml并可诱导组内全部动物抗体水平呈阳性,而低剂量组（10μug/只）水平为16.2±9.3mIU/m,组内抗体阳性数仅为3只（每组5只）。4、8、14周时各组抗体水平均有升高,但高、中剂量组升高较低剂量组更为明显。然而,低剂量（10μug/只）的pS2.S与相同剂量的pFP联合免疫2、4周时血清抗体水平分别为115.9±19.4mIU/ml、130.1±29.5 mIU/ml,组内全部5只小鼠2周时抗体水平呈阳性;pFP剂量升高未能增强pS2.S的免疫效果,其剂量为50ug/只,100 ug/只时联合pS2.S接种免疫效果明显降低,连同对照组[pS2.S+pcDNA3.1,10+10（ug/只）]较低剂量组[pS2.S+pFP,10+10（ug/只）]2周或4周时水平差异具显着性（P＜0.05）。低剂量（1 ug/只,5 ug/只）的pFP虽未明显减低血清抗体水平,但检测值的均一性较差,且2,4周时未能诱导出组内全部动物抗体水平呈阳性。为考察pFP（ug/只）接种时间和部位对联合pS2.S（ug/只）免疫效果的影响,分别设置同时接种（Ⅰ组:pS2.S+pFP）、pFP于pS2.S免疫前3日接种（Ⅱ组:pFP+3d+pS2.S）、pFPpS2.S免疫后3日接种（Ⅲ组:pS2.S+3d+pFP）及pFP与pS2.S分左右腿胫前肌（TA）接种（Ⅳ组:pS2.S/TA+pFP/TA）四组,比较pS2.S免疫2周,4周时血清抗体水平及阳性数。结果显示Ⅰ组免疫效果最佳,表现为抗体水平较高、检测值个体差异较小,仅该组与Ⅳ组水平比较差异具显着性（P＜0.05）,且其组内全部小鼠抗体水平均呈阳性。据此pFP联合pS2.S免疫方式,观察二者高[10+10（μg/只）]、中[10+10（μg/只）]、低剂量[10+10（μg/只）]联合免疫效果显示,高、中剂量组2、4周时均能诱导组内全部动物抗体水平呈阳性,二组4周时抗体水平较低剂量组升高明显,差异具显着性（P＜0.05）。2.2 pFP联合pS2.S诱导细胞免疫应答结果pFP（50μg/只）联合pS2·S（50μg/只）免疫组小鼠脾细胞体外经HBsAg刺激培养上清IL-2/IFN-γ水平（263.5±52.0/38.4±11.9pg/ml）较同剂量的pS2·S;联合空载体pcDNA3.1免疫组（149.6±22.2/10.1±4.3pg/ml）高,差异具显着性（P＜0.01）;IL-4水平于各组质粒免疫影响不明显。pS2.S+pFP免疫组小鼠局部引流淋巴结（LN）中单核巨噬细胞（MPs）计数及其占LN细胞的百分比结果（18.0×105,8.2%）明显高于pS2·S+pcDNA3.1组（8.0×105,5.2%）及空载体免疫组（6.7×105,2.8%）;同时,pS2.S+pFP免疫组MPs能明显刺激HBsAg致敏的T细胞增殖,其T细胞增值指数（SI:5.60）较pS2·S+pcDNA3.1组（2.55）及pcDNA3.1组（1.80）高。HBV DNA疫苗诱导小鼠特异性CTL活性结果,HBV DNA疫苗免疫诱导小鼠CTL活性的强弱与效/靶（E/T）比例及其上清液中IFN-γ分泌水平有一定关系。E/T为90:1及30:1时,联合佐剂质粒免疫组（pS2·S+pFP）CTL活性（细胞溶解率:52.5%,43.3%）较pS2·S+pcDNA3.1组（45.4%,27.1%）高;E/T=10:1时,pS2·S+pFP组仍有CTL免疫活性（＞20%）,而pS2·S+pcDNA3.1组CTL活性＜20%,实验过程中空白载体pcDNA3.1对照组CTL活性于任一E/T比例条件下均＜20%。抗原特异性分泌IFN-γ或IL-4T细胞ELISPOT检测结果,pS2·S+pFP免疫健康BALB/c小鼠6周后,脾细胞在体外用HBsAg刺激后其诱生的IFN-γ细胞频数（27.88±11.93 SFCs/3×105脾细胞）,较同期对照组用空载体pcDNA3.1（1.43±1.51 SFCs/3×105脾细胞）高,差异据非常显着性（t=6.211,P＜0.001）。脾细胞在体外用HBsAg刺激后其诱生的IL-4细胞频数（5.00±2.00 SFCs/3×105脾细胞）较不用HBsAg组（2.00±1.10 SFCs/3×105脾细胞）高,但差异没有显着性（t=1.20,P＞0.05）。经流式细胞术（FACS）实验分析,pS2.S+pFP免疫组诱导小鼠胞内分泌IFN-γ的CD4+ T细胞百分比（0.28±0.17%）与pcDNA3.1对照组（0.20±0.03%）比较,无显着性差异（P＞0.05,t=0.130）;而其诱导小鼠胞内分泌IFN-γ的CD8+ T细胞表达IFN-γ百分比（0.69±0.08%）较对照组（0.24±0.12%）高,差异具显着性（P＜0.001,t=4.167）。2.3不同细胞因子表达质粒联合pS2.S免疫诱导HBsAg-特异性免疫应答结果为进一步说明和证实IL-2/IFN-γ融合蛋白表达质粒（pFP）设计的合理性及作为佐剂增强pS2.S免疫原性的有效性,通过基因克隆及重组技术分别设计和构建了鼠源性IL—2（pmIL-2）,IFN-γ（pm IFN-γ）及IL-2/IFN-γ融合蛋白表达质粒（pmFP）作为佐剂,并以其小剂量（5μg/只）联合pS2.S（5μg/只）接种BALB/c小鼠,并对各自诱导的免疫应答阳性数进行观察比较。结果显示,pmIL-2+pmIFN-γ[（2.5+2.5）μg/只]联合pS2.S免疫诱导HBsAg-特异性体液免疫和细胞免疫效果最佳,并与相同剂量的pS2·S+pFP组效果相当,主要表现为其组内诱导的特异性分泌IFN-γT细胞阳性反应动物数目与单独使用细胞因子质粒（pmIL-2或pm IFN-γ）及pmFP免疫组（未获得阳性应答）具本质性差别,提示IL-2及IFN-γ质粒作为免疫佐剂在增强HBV DNA疫苗免疫效果上具有协同效应。而鼠源性融合蛋白（pmFP）在本实验中未显示出佐剂效应,推测可能与其构建时所选用的连接肽基因（与人源性pFP相同）未能在融合蛋白分子结构上保持IL-2及IFN-γ各自活性有关。第三章在体电脉冲法提高HBV DNA疫苗免疫效果的实验研究本研究以新西兰家兔、恒河猴及食蟹猴为实验对象,观察评价EP通过提高裸DNA质粒在宿主体内细胞导入率,增强HBV DNA疫苗诱导大体重动物特异性免疫应答效果。另采用高水力学注射法（hydrodynamic injection或水力注射法）将质粒pS2.S转染至BALB/c小鼠肝细胞内作为模型,观察EP介导的pS2.S免疫对该模型小鼠肝细胞HBsAg表达的抑制效果。3.1 EP联合接种HBV DNA疫苗诱导兔和猴特异性免疫应答结果整个实验整个观察过程,未经EP介导的高剂量[（1000+1000）μg/只]双质粒HBV DNA疫苗（pS2.S+pFP）免疫组内各只动物（家兔或猴）血清抗-HBs均为阴性水平（＜10mIU/ml）。（1）经EP介导的双质粒HBV DNA疫苗免疫于新西兰家兔实验结果:2周时大剂量（50+50μg/只）及中剂量组（25+25μg/只）分别有3/5只,1/5只动物血清抗-HBs水平呈阳性（＞10 mIu/ml）至4周时阳性数虽无变化,但二组水平均明显升高。第1次免疫后13周（即第10周增强免疫后3周）时,EP介导的大、中、小剂量组动物均有血清抗-HBs阳性出现,分别为5、4与4只,其中大剂量组阳性数与同期对照组比较,差异具有显着性（P=0.008）。（2）EP介导的双质粒HBV DNA疫苗免疫恒河猴实验结果:初次免疫后8周（即第1次增强免疫后4周）时,大、中剂量组,分别有3及2只动物血清抗-HBs阳性,至免疫后13周（即第2次增强免疫后3周）时,大、中、小3个剂量组全部3只动物血清抗-HBs为阳性。（3）EP介导的双质粒HBV DNA疫苗免疫食蟹猴免疫实验结果:中剂量组（660μg/kg）接种后第6周即有1动物血清中测出较高滴度的抗-HBs;随着接种次数增加,血清抗-HBs阳性的动物数量也随之增加,至16周时低（200μg/kg）、中剂量组内全部动物血清抗体呈阳性,而高剂量组（2000μg/kg）阳性数为2/6只;各组血清-HBs水平高峰期大约在23～25周之间,随后小幅下降。16周时EP介导的HBV DNA疫苗免疫高、中、低剂量组各3只食蟹猴中分别有3、2、3只HBsAg特异性IFN-γT细胞计数阳性;29周时高、中、低剂量组全部动物应答呈阳性,其计数结果分别为30.0±13.5 SFCs/3×105 PBMCs,30.7±26.3 SFCs/3×105 PBMCs及17.7±6.4 SFCs/3×105 PBMCs;而相同时间佐剂组和PBS对照组3只食蟹猴均为阴性。3.2 EP介导的HBV DNA疫苗免疫对小鼠肝内HBsAg表达水平的影响小鼠经水力学法注射pS2.S后12小时（hr.）即可检测出HBsAg表达（78.5±11.7ng/ml）,24hr.肝内HBsAg表达为高峰期（108.5±21.5 ng/ml）,以后表达量随时间而降低。EP（pS2.S+EP）与未经EP介导（pS2.S/IM）的HBV DNA疫苗免疫后的小鼠肝组织HBsAg水平均有不同程度的降低,pS2.S/IM组12hr.（44.8±16.6 ng/m）,72hr.（15.1±3.7 ng/ml）HBsAg水平较同一时间未免疫对照组（78.5±11.7ng/ml,22.8±4.5 ng/ml）低,差异具非常显着（P＜0.01）及显着性（P＜0.05）;pS2.S+EP组于12hr.（8.3±0.6 ng/ml）,24hr.（9.9±4.1ng/ml）及72hr.水平（3.3±0.3ng/ml）较同期对照组（78.5±11.7ng/ml,108.5±21.5 ng/ml,22.8±4.5 ng/ml）低,差异具非常显着性（P＜0.01）,较同期pS2.S/IM组（44.8±16.6 ng/m,96.3±34.3 ng/ml,15.1±3.7 ng/ml）水平低,差异亦具非常显着性（P＜0.01）。免疫组化计数HBsAg染色阳性细胞结果,pS2.S+EP组于观察期间各个时间点阳性染色肝细胞数目均较对照组少,差异分别具显着（2、5、7天,P＜0.05）及非常显着性（12hr.、1天、3天,P＜0.01）。观察肝组织病理及血清转氨酶（ALT）水平变化结果发现,动物经水力注射转染pS2.S后肝组织病理无明显改变,尽管血清ALT呈现短暂性升高,但各时间点上pS2.S+EP与对照组比较无显着性差异。第四章pFP联合EP提高治疗性HBV DNA疫苗效果的评价本研究以健康BALB/c小鼠及HBV转基因（Tg）小鼠为研究对象,分别比较分析和系统研究pFP、EP单独和二者联合应用增强HBV DNA疫苗体液免疫及细胞免疫效果的辅助作用,探寻最佳的接种组合方式及给药剂量。在此基础上,进一步评价和探讨联合免疫增强HBV Tg小鼠细胞免疫及促进病毒应答的治疗效果及初步作用机理。4.1健康BALB/c小鼠免疫应答效果（1）血清抗-HBs抗体水平检测:EP介导的DNA疫苗免疫组间比较,A组（pS2.S+pFP+EP）血清抗-HBs水平为51.2±50.0 mIU/ml,血清阳性率为89%,B组（pS2.S+pcDNA3.1+EP）血清抗HBs抗体水平为14.8±7.6 mIU/ml,血清阳性率为64%。A组血清抗-HBs水平及血清阳性率均高于B组（P=0.033,P=0.026）。pFP及非pFP（pcDNA3.1）联合DNA疫苗免疫组间血清抗体阳性率比较,即A组与C组（pS2.S+pFP+pEP）及B组与D组（pS2.S+pcDNA3.1+pEP）比较,差异均具显着性（P=0.000）;同时,EP与pFP各自增强血清抗体应答阳性率比较（B组vs.C组）差异亦具显着性（P=0.001）。（2） HBsAg特异性T细胞免疫应答水平检测:在EP或非EP（pEP）介导pS2.S免疫反应比较中,B组（pS2.S+pcDNA3.1+EP）和D组（pS2.S+pcDNA3.1+pEP）以pcDNA3.1质粒代替了A组（pS2.S+pFP+EP）、C组（pS2.S+pFP+pEP）的pFP,结果B、D组的HBsAg特异性细胞免疫应答水平及阳性率（B组:84±70 SFCs/3×105脾细胞,28%;D组:17±29 SFCs/3×105脾细胞,11%）较相对应的A、C组（A组:207±103 SFCs/3×105脾细胞,78%;C组:156±126 SFCs/3×105脾细胞,50%）低,其中A、B二组阳性率差异经统计分析具有显着性（P=0.007）。而细胞计数（SFCs/3×105脾细胞）结果经异方差多组内两组间多重统计分析比较,仅A组与D组比较差异具有显着性（P=0.025）。研究结果表明,EP以提高HBV DNA疫苗体液免疫应答效果最为明显,其辅助作用较pFP强;而在本研究中仅pFP能显示出明显增强DNA疫苗诱导的细胞免疫效果的佐剂作用。因此,我们认为EP联合pFP在HBV DNA疫苗免疫（即A组:pS2.S+pFP+EP）能获得最佳的体液和细胞免疫应答效果。以上述组合方式接种不同剂量的HBV DNA疫苗,结果显示具有一定的剂量依赖性,为进一步的HBV Tg动物模型实验有效剂量的选择奠定了实验基础。4.2 HBV Tg小鼠模型实验结果（1） HBV DNA血清定量检测结果,pS2.S+pFP组免疫第8周（13317±2539拷贝/ml）、12周时（6462±3359拷贝/ml）分别较免疫前（36159±7769拷贝/ml）明显减低,差异具非常显着性（P＜0.01）;pS2.S+pcDNA3.1组4周（20618±9523拷贝/ml）及8周时（23818±5319拷贝/ml）均较其免疫前水平（36090±4421拷贝/ml）明显降低（P＜0.01）,但不能持续到12周时（27691±13071拷贝/ml）,并明显高于此时pS2.S+pFP组水平,差异具非常显着性（P＜0.01）。（2）病毒应答与细胞免疫应答的平行比较:各组Tg小鼠血清HBsAg水平无明显变化,但肝脏免疫组化结果显示,HBsAg表达水平存在差别。pS2.S+pFP和pS2.S+pcDNA3.1组分别有4只和2只HBV Tg小鼠肝组织切片HBsAg表达阳性的肝细胞低于观察视野总计数细胞的25%,pcDNA3.1对照组Tg鼠HBsAg表达阳性的肝细胞均在25%以上。pS2.S+pFP组3只（3/5）ALT升高（≥2×ULN）,pS2.S+pcDNA3.1组和pcDNA3.1组均只有1只检测到ALT活性升高。pS2.S+pFP组HBsAg特异性IFN-γ分泌细胞数（46.02±6.3SFCs/3×105个脾细胞）亦多于pS2.S+pcDNA3.1（19.4±10.3SFCs/3×105个脾细胞）或pcDNA3.1组（14.0±8.9SFCs/3×105个脾细胞）,其中pS2.S+pFP组较pcDNA3.1组差异具显着性（P＜0.05,t=2.571）,且三组动物个体观察结果发现HBsAg特异性SFCs的升高与血清ALT基本一致,并伴随着血清HBV DNA及肝组细胞HBsAg表达水平的降低。本研究结果表明,pFP能够显着增强EP介导的HBV DNA疫苗免疫H BVTg的治疗效果,表现为pFP联合免疫能持续性抑制HBV DNA的复制及表达。EP的引用大大降低了质粒的有效接种剂量。观察终点（12周）时,pFP联合HBV DNA疫苗免疫组Tg小鼠血清HBV DNA水平显着低于DNA疫苗单独免疫及对照组,个体血清HBV DNA及肝组织HBsAg表达水平降低的同时,伴随其血清ALT水平及HBsAg特异性IFN-γ分泌细胞数目的升高。值得注意的是,DNA疫苗免疫组肝脏细胞空泡样变较对照组明显,可能与DNA疫苗免疫所介导的HBV特异性或非特异性免疫应答造成的肝脏炎症损伤有关。由于小鼠动物模型基础上研究外周血单个核细胞（PBMC）免疫应答水平的局限,本文结果中病原学与免疫学应答相关性的研究仅限于观察结束的一个时间点上,但所要提示的与近年来文献报道结论基本一致,即HBV的清除与溶细胞或非溶细胞性免疫应答有关。综上所述,Th1型细胞因子IL-2/IFN-γ融合蛋白编码基因质粒（pFP）联合HBV DNA疫苗（pS2.S）接种能有效增强pS2.S的免疫效果,pFP与pS2S剂量按1:1配伍混合共注射免疫效果最佳;在体电脉冲（EP）技术通过提高质粒DNA体内细胞转染率,有效增强HBV DNA疫苗在各种动物（包括非人类灵长动物）诱导的免疫效果;pFP通过加强初始T细胞向Th1方向分化,能够增强HBVDNA疫苗免疫的治疗性作用,与EP联合HBV DNA疫苗治疗HBV Tg小鼠后,能在一定程度上抑制Tg小鼠HBV DNA复制和HBsAg表达。以上研究结果有益于目前DNA疫苗及裸质粒基因治疗技术瓶颈性难题的解决,并为寻找更有效的抗HBV感染免疫治疗策略提供新的技术途径和实验依据。
周承[8]（2008）在《CTLA-4胞外段与HBsAg融合DNA疫苗增强抗HBV免疫的研究》文中提出乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是世界性的公共卫生问题,HBV感染所致的慢性肝炎及其并发症严重危害了人类健康。目前临床上对慢性肝炎的治疗主要是采用α干扰素和核苷类药物进行抗病毒治疗,但它们清除HBV cccDNA的作用有限,因此急需新的治疗策略。HBV感染慢性化与机体抗HBV特异性免疫应答的缺陷或低下有关,有效打破慢性HBV感染的免疫耐受状态,诱导出多克隆、多特异性、应答强的免疫应答是慢性肝炎治疗的关键之一。DNA疫苗能同时诱导机体体液和细胞免疫反应,因此作为治疗性疫苗在慢性肝炎的动物和临床试验研究中显示出良好的应用前景,但其诱导的免疫应答在大动物种系和人类中仍较弱,这主要是由于被注射入体内的DNA只有很少部分被抗原递呈细胞（antigen-presenting cells,APC）摄取,因此如何增强DNA疫苗的免疫原性,是目前急需解决的课题。将DNA疫苗编码的抗原靶向引导至APC表面,可促进APC对抗原的摄取、加工和递呈,广泛增强抗原特异性CD4+Th应答、CD8+Tc应答及抗体反应,从而放大了免疫应答效应,是增强DNA疫苗免疫原性的有效策略之一。表达于激活T细胞表面的共刺激分子受体—细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4,CTLA-4）能特异性地结合APC表面的B7-1/B7—2分子,并且它与B7的亲和力比CD28与B7的亲和力高20～50倍左右。利用CTLA-4胞外段与B7分子结合的高亲和力,能够将与其融合表达的特异性抗原靶向至APC,促进APC对抗原的摄取、加工和递呈并激活APC这一特点,本课题构建CTLA-4胞外段与乙肝病毒表面抗原（Hepatitis B virussurface antigen,HBsAg）融合的真核表达重组质粒作为抗HBV免疫的DNA疫苗,通过免疫正常BALB/c小鼠和HBV转基因小鼠,研究该融合表达质粒增强特异性抗HBV免疫功能,打破HBV免疫耐受的可能性;同时,初步研究该融合表达质粒增强机体免疫应答的作用机制,探讨它作为一种新型乙肝基因疫苗对HBV持续感染的治疗作用和应用前景,为该疫苗用于慢性乙型肝炎的防治提供实验和理论依据。本研究分以下四部分。第一部分CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒的构建及鉴定目的:构建CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒,并在体外对其进行鉴定,以用于后续DNA免疫的动物实验研究。方法:通过RT-PCR和PCR法分别获得小鼠的CTLA-4胞外段和HBsAg基因,采用分子克隆基本技术将获得的目的基因分别插入至分泌型质粒pSecTagB中,获得重组质粒pCTLA和pS,再以pCTLA为骨架,采用分子克隆法将HBsAg基因插入pCTLA中的CTLA-4基因的3’端,从而得到融合表达质粒pCTLA-S。全自动序列分析仪验证序列正确后,用脂质体转染法,将上述重组质粒转染至真核细胞Cos-7,分别用RT-PCR和放免法检测目的基因mRNA和HBsAg的表达。结果:测序分析结果显示,重组质粒pCTLA、pS和pCTLA-S中插入了正确的基因序列。RT-PCR法检测pCTLA、pS和pCTLA-S转染的Cos-7细胞中均有特异性目的基因mRNA的表达,放免法检测表明pS和pCTLA-S转染Cos-7的胞内和胞外均有HBsAg的表达。结论:成功构建了CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒pCTLA-S及对照重组质粒pCTLA和pS,并能在真核细胞内有效表达。第二部分CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒免疫增强小鼠抗HBsAg免疫应答的研究目的:研究CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒免疫增强小鼠抗HBsAg免疫应答的特点,探讨该融合重组质粒免疫用于抗HBV感染的治疗的可行性。方法:将重组质粒pCTLA-S及对照重组质粒pCTLA、pS和pSecTagB经超纯质粒大量抽提后,常规肌肉免疫BALB/c小鼠后,采用ELISA法动态检测小鼠血清抗-HBs;在加强免疫4周后处死一半小鼠（4只）,无菌取单个脾细胞,用MTT法检测HBsAg特异性淋巴细胞增殖活性,LDH法检测HBsAg特异性的CTL反应,流式细胞术检测脾细胞中HBsAg特异性CD8+T细胞;ELISA法检测HBsAg特异性IgG亚类和培养脾细胞HBsAg特异性的IFN-γ和IL-4的分泌水平。结果:动态检测小鼠血清抗-HBs结果表明,pCTLA-S免疫后,抗体在初次免疫2周后开始上升,至免疫后8周达到高峰,此后缓慢下降,至免疫后16周仍有较高水平的抗体;pCTLA-S免疫组与未融合质粒pS免疫组相比,其抗体出现的时间明显提前,滴度亦显着升高,pCTLA-S免疫组最高可达7123mIU/ml,而pS最高仅为261mIU/ml,升高达数百倍（pCTLA-S vs pS,P＜0.0001）。pCTLA-S免疫明显增强了HBsAg特异性T细胞增殖（pCTLA-S vs pS,P＜0.01）和细胞毒T淋巴细胞杀伤功能（pCTLA-S vs pS的CTL活性分别为:E/T=80,38.1±5.4%vs 25.4±3.7%,P＜0.05）;融合表达质粒pCTLA-S免疫较非融合的pS免疫能够诱导出更多的HBsAg特异性的CD8+T细胞分泌IFN-γ,促进Tc1细胞增殖（pCTLA-S Vs pS:7.27±1.29%vs 2.76±0.6%,P＜0.01）;对免疫球蛋白IgG亚类进行分析和脾细胞培养上清细胞因子IFN-γ和IL-4水平检测表明,pCTLA-S与非融合质粒pS免疫组相比,能同时增强HBsAg特异性IgG1和IgG2a的产生,增强抗原特异性的IFN-γ和IL-4的分泌（pCTLA-S vs pS,IFN-γ:369.7±117.8pg/ml vs 101.7±31.9pg/ml,IL-4:94.2±15.6pg/ml vs 42.0±10.2pg/ml,均P＜0.01）。结论:pCTLA-S不仅显着增强小鼠抗HBsAg的特异性抗体免疫应答,而且显着增强HBsAg特异性T细胞增殖和细胞毒T淋巴细胞杀伤功能,有效诱导HBsAg特异性的CD8+T细胞分泌IFN-γ,促进Tc1细胞增殖,显着增强了HBsAg特异性的Th免疫应答,预示着该融合质粒免疫可能在抗HBV感染治疗中具有潜在的应用前景。第三部分CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒免疫在HBV转基因小鼠中的抗病毒效应及其诱导的抗HBsAg免疫应答的研究目的:观察融合重组表达质粒pCTLA-S免疫对HBV转基因小鼠（Tg小鼠）中HBV的免疫清除作用,并对其在HBV转基因鼠中的免疫应答进行研究,探讨pCTLA-S免疫对HBV持续感染的治疗作用和应用前景。方法:重组质粒pCTLA-S及对照重组质粒pS和pSecTagB经超纯质粒大量抽提后,常规肌肉免疫Tg小鼠后,分别采用放免法（RIA）和ELISA法动态检测血清HBsAg和抗-HBs水平,荧光定量PCR法检测血清HBV DNA滴度;在加强免疫4周后处死一半小鼠,无菌取单个脾细胞,用MTT法检测HBsAg特异性淋巴细胞增殖活性,LDH法检测HBsAg特异性的CTL反应,流式细胞术检测脾细胞中HBsAg特异性CD8+T细胞,ELISA法检测培养脾细胞HBsAg特异性的IFN-γ和IL-4的分泌水平;常规化学比色法检测血清ALT水平;病理切片常规HE染色及免疫组化分析肝脏组织学及HBsAg表达。结果:融合质粒pCTLA-S免疫组有效下调血清HBV DNA和HBsAg水平,且与pS组相比,其下调作用更迅速、更明显,尤其在免疫后8、12、16周,其下调作用自初次免疫后2周开始,以后逐渐增强,于免疫后8周下调效果十分明显（其中实验组中有1只测不到HBV DNA,即＜1×103 copies/ml）,以后维持在较低水平,直到实验结束,在实验的16周内没有任何反弹（16周时,HBVDNA滴度的对数pCTLA-S vs pS:3.58±0.09 vs 4.46±0.18,P＜0.05;HBsAg抑制率pCTLA-S vs pS为:33.2±4.6%vs 17.04±2.76%,p＜0.01）。研究该融合质粒免疫后Tg小鼠中的免疫应答特点表明,融合表达重组质粒pCTLA-S免疫能有效诱导Tg小鼠产生抗-HBs应答,与pS相比,其出现的时间提早,滴度也明显升高,于8周达到高峰（6～16周,pCTLA-S vs pS均p＜0.001）;pCTLA-S免疫能有效诱导Tg小鼠产生抗原特异性的CTL应答,当效靶细胞比在80:1时,其CTL应答与pS免疫组相比具有显着差异（26.1±4.6%vs 16.1±3.8%,p＜0.05）;与非融合质粒pS免疫相比,pCTLA-S免疫能显着增强淋巴细胞抗原增殖活性（SI:3.6±0.49 vs 2.3±0.51,p＜0.01）,同时促进脾细胞HBsAg特异性IFN-γ和IL-4的产生,其中pCTLA-S免疫组释放的IFN-γ是pS组的3倍,而IL-4为pS组的2倍多（均P＜0.05）;流式细胞术分析抗原特异性的CD8+T细胞表明,pCTLA-S免疫能够诱导出更多的HBsAg特异性的CD8+T细胞分泌IFN-γ,大约是pS免疫组的3倍（P＜0.01）;小鼠血清ALT的动态检测表明,重组质粒pCTLA-S和pS免疫后有仅个别小鼠ALT有轻度增高,但与空载体pSecTagB免疫组相比无统计学差异（P＞0.05）;肝脏免疫组化结果表明,空载体pSecTagB免疫后Tg鼠肝组织HBsAg表达强阳性,pCTLA-S免疫组有3例（3/8）HBsAg表达明显减弱,而pS组HBsAg表达有1例（1/8）HBsAg表达明显减弱。结论:在HBV-Tg小鼠中,融合重组表达质粒pCTLA-S免疫比非融合的pS免疫能诱导出更强的HBsAg特异性的抗体应答;增强HBsAg特异性的淋巴细胞增殖反应、细胞毒T淋巴细胞杀伤功能,有效诱导HBsAg特异性的CD8+T细胞分泌IFN-γ,促进Tc1细胞增殖,增强Th应答,对HBV-Tg小鼠血清HBsAg、HBV DNA水平有明显的抑制作用。第四部分CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒免疫增强抗HBV免疫应答机制的初步研究目的:构建一个含突变的CTLA-4胞外段与HBsAg融合的重组表达质粒pmCTLA-S,该突变是将CTLA-4胞外区的MYPPPY基序中的104位酪氨酸残基的密码子突变为丙氨酸密码子。通过免疫正常和转基因小鼠,观察pmCTLA-S的免疫应答特点和抗病毒作用,初步研究融合表达质粒pCTLA-S抗HBV免疫增强机理。方法:用PCR法扩增突变的CTLA-4胞外段,采用分子克隆基本技术将获得的突变的CTLA-4胞外段插入至切除CTLA-4胞外段的pCTLA-S质粒中,构建得到含突变的CTLA-4胞外段的融合质粒pmCTLA-S。全自动序列分析仪验证pmCTLA-S序列正确后,脂质体转染真核细胞Cos-7,放免法（RIA）检测转染细胞HBsAg的表达,用流式细胞术检测培养上清中融合表达蛋白mCTLA-S中突变的CTLA-4与B7结合力,将突变的pmCTLA-S质粒分别免疫BALB/c和HBV-Tg小鼠,采用ELISA、MTT和LDH等方法检测pmCTLA-S免疫对小鼠抗HBsAg特异性抗体应答和细胞免疫应答的影响;分别用荧光定量PCR和RIA检测pmCTLA-S免疫对小鼠血清HBV DNA滴度和HBsAg的表达水平的影响。结果:测序结果显示,重组质粒pmCTLA-S中插入的突变的CTLA-4胞外段基因序列完全正确;放免法检测表明pmCTLA-S的目的基因在Cos-7细胞有效表达。流式细胞术检测表明,pmCTLA-S表达的突变CTLA-4与B7结合力较未突变pCTLA-S明显下降,结合力约为未突变CTLA-4的1/4（平均荧光强度MIF:12.3vs 3.06）。研究pmCTLA-S诱导的免疫应答表明,pmCTLA-S免疫诱导的小鼠抗-HBs比未突变pCTLA-S显着降低（各周抗体滴度pmCTLA-S vs pCTLA-S,均p＜0.001）,且与pS所诱导的抗体滴度无显着性差异（各周抗体滴度pmCTLA-S vs pS,均p＞0.05）;pmCTLA-S免疫后小鼠的无论是细胞增殖活性还是CTL应答与pS免疫组相比并未见有意义的升高（均p＞0.05）,与pCTLA-S免疫组相比细胞增殖活性和CTL活性均明显下降（pmCTLA-S vs pCTLA-S,SI:2.54±0.75 vs 4.05±0.47,P＜0.01;CTL活性:E/T=40,17.5±3.2%vs 27.0±2.8%,p＜0.05）;进一步检测pmCTLA-S免疫对HBV Tg小鼠血清HBV DNA和HBsAg的影响,发现pmCTLA-S免疫对Tg小鼠血清HBV DNA和HBsAg表达均有一定的抑制作用,其抑制效应与pS基本一致（均P＞0.05）,但与pCTLA-S免疫相比抑制效应明显下降,尤其在免疫后8周两组差异最为显着（pmCTLA-S vs pCTLA-S:HBsAg抑制率为17.05±5.75%vs 30.5±4.38%,p＜0.01）。结论:CTLA-4与B7的有效结合是融合重组质粒pCTLA-S疫苗增强抗HBV免疫和控制HBV病毒复制与表达所必需的,在体外通过基因工程等方法提高CTLA-4胞外段与B7的亲和力有助于增强CTLA-4融合表达DNA疫苗的的免疫原性,是CTLA-4融合基因疫苗改良的有效途径之一。
华瑞[9]（2006）在《体内增强治疗性乙型肝炎核酸疫苗免疫应答的研究》文中指出据WHO资料统计,到2000年全球约有3.5亿HBV携带者。其中,大约有5%-10%的成人和80%-90%的儿童成为慢性乙型肝炎（CHB）。慢性乙型肝炎的长期病程结局是肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌（HCC）。基因疫苗具备可高效持久诱导保护性免疫、安全、稳定、价格低廉、易于接种等特点,弥补了减毒活疫苗/灭活疫苗和亚单位疫苗存在的这样或那样的不足,但其诱导免疫反应的效率相对较低,尤其是对于大的动物种系和人类,这削弱了它们的实际应用。提高基因疫苗的效果,在低剂量基因疫苗的情况下诱导强有力的免疫应答,成为疫苗设计者的目标。至今为止,要达到这样的目标,一般有以下三个方案:1、修饰载体以增强抗原的表达;2、增加疫苗DNA的转运;3、辅佐剂的使用;我们的目标主要定位在了基因的转运上。在本论文中,我们提出了用体内电转染的方法,增强HBV基因疫苗的效果。同时我们也考察了prime-boost策略用作增强免疫应答的有效性和安全性。我们选择了HBV preS2 +S和S基因片段作为DNA疫苗的靶基因,应用分子克隆技术构建了能够表达HBV中蛋白基因的真核表达质粒pVAX1MS;能够表达HBV小蛋白的真核表达质粒pVR1012/HBs以及重组MVA病毒载体疫苗。应用pVAX1MS对Balb/C小鼠用体内电转染方法进行免疫,观察DNA疫苗剂量、免疫注射途径、体内电转染所使用的电压等因素对免疫效果的影响;应用真核表达质粒pVR1012/HBs对HBV转基因鼠进行初免（priming）,然后用重组MVA病毒载体进行增强免疫（boost）,通过检测鼠血清中表面抗原、表面抗体的浓度,HBV DNA滴度,转氨酶的变化,肝脏病理切片来整体衡量疫苗的治疗作用以及疫苗对肝脏带来的损伤;通过细胞免疫CTL的检测研究该免疫策略发挥作用的机制。
赫兢[10]（2005）在《治疗性乙型肝炎病毒DNA疫苗的基础研究》文中研究指明慢性乙型肝炎（CHB）严重危害人类健康,目前尚无特效治疗手段。乙型肝炎慢性化的主要原因之一是被感染者缺乏有效的特异性细胞免疫应答,不能清除其体内的乙型肝炎病毒（HBV）。DNA疫苗将编码外源蛋白基因的质粒DNA直接导入机体组织,外源基因在体细胞中表达后,表达产物被递呈,与主要组织相容性复合物结合,可刺激机体产生相应的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和抗体,介导细胞和体液免疫应答。 乙肝DNA疫苗可诱导机体产生抗原特异性细胞及体液免疫,接种后可诱导多种实验动物产生特异性CTL及保护性抗体,清除HBV转基因鼠血清HBsAg及HBV DNA,接种于对重组亚单位疫苗无应答的健康志愿者可产生保护性抗体。由于可诱导特异性细胞免疫,乙肝DNA疫苗有可能抑制或清除CHB患者体内的HBV,但要作为临床治疗CHB的工具尚需解决许多难题,主要是确保安全性并增强免疫效果。既往的研究大多通过联合使用免疫佐剂、细胞因子及采用不同的接种方法增强疫苗的免疫原性。本研究在乙肝DNA疫苗中插入HBV自身复制调控元件—增强子（ENH）及前S2（PreS2）、前C（PreC）抗原基因片段,通过基因调控的方法增强乙肝DNA疫苗目的基因的表达以增强DNA疫苗的免疫原性,并采用FDA已批准用于临床试验的载体VR1012构建疫苗,所构建的疫苗确保安全性,可进入临床试验进行深入研究。 本研究采用常规PCR法从adr亚型HBV全基因DNA序列中分别扩增HBsAg,PreS2-HBsAg,HBsAg—ENH Ⅰ,PreS2-HBsAg-ENH Ⅰ,HBcAg和ENH Ⅱ-PreC-HBcAg基因片段,重组到载体VR1012中,构建6种HBV重组质粒（重组质粒是乙肝DNA疫苗的主体）,转染HepG2细胞及COS-7细胞,免疫BALB/C小鼠及HBV转基因鼠。采用细胞内酶免疫染色、ELISA、ELISPOT等方法检测其在HepG2细胞、COS-7细胞内的表达,BALB/C小鼠的体液、细胞免疫及HBV转基因鼠血清HBsAg、HBV DNA及肝组织病理改变。发现转染的HepG2细胞、COS-7细胞均表达相应的目的蛋白—
二、DNA疫苗诱导健康小鼠细胞免疫及HBV转基因小鼠抗-HBs产生（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、DNA疫苗诱导健康小鼠细胞免疫及HBV转基因小鼠抗-HBs产生（论文提纲范文）
（1）HepG2.2.15细胞来源的自噬小体疫苗（HBV+DRibbles）防治HBV感染及其免疫机制的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号、变量、缩略词等本论文专用术语注释表 |
| 前言 |
| 研究背景 |
| 研究目的及内容 |
| 研究的创新点及意义 |
| 参考文献 |
| 综述 慢性乙型肝炎治疗性疫苗的研究进展 |
| 一、蛋白类疫苗 |
| 二、肽类疫苗 |
| 三、DC疫苗 |
| 四、DNA疫苗 |
| 五、腺病毒疫苗 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 第一部分 HepG2.2.15细胞来源的自噬小体疫苗(HBV~+DRibbles)的制备与鉴定 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 HBV~+DRibbles疫苗诱导HBV特异性免疫应答及其预防HBV感染的实验研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 HBV~+DRibbles疫苗治疗HBV急性感染的实验研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 HBV~+DRibbles疫苗治疗HBV慢性感染的实验研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（2）乙型肝炎基因治疗的前景展望（论文提纲范文）
| 1 乙型肝炎治疗现状与困境 |
| 2 乙型肝炎的基因治疗 |
| 2.1 基因调控或基因修饰 |
| 2.1.1 反义核酸 |
| 2.1.2核酶 |
| 2.1.3 脱氧核酶 |
| 2.1.4 RNA干扰 (RNA interference, RNAi) |
| 2.1.5 miRNA |
| 2.1.6 DNA编辑技术 |
| 2.2 基因免疫治疗 |
| 2.2.1 DNA疫苗 |
| 2.2.2 抗病毒细胞因子转基因表达 |
| 2.2.3 特异性抗体转基因表达 |
| 2.2.4 淋巴细胞特异性T淋巴细胞受体 (T lympho-cyte receptor, TCR) 转基因表达 |
| 3 结语与展望 |
（3）表达HBsAg基因的重组质粒与重组腺病毒的免疫学初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 乙型肝炎病毒的基本特征 |
| 1.2 HBV的致病机制与治疗现状 |
| 1.3 治疗性疫苗的现状 |
| 1.4 HBV相关的治疗性疫苗 |
| 1.5 联合免疫DNA疫苗与病毒载体疫苗的可行性 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 重组质粒与重组腺病毒的大量制备 |
| 3.2 单独免疫重组质粒pVR-S的免疫效果 |
| 3.3 单独免疫重组腺病毒rAdV-S的免疫效果 |
| 3.4 单独免疫pVR-S与单独免疫rAdV-S的效果比较 |
| 3.5 联合免疫pVR-S与rAdV-S的免疫效果 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 HBV的S基因 |
| 4.2 重组质粒pVR-S和重组腺病毒rAdV-S的免疫应答机理 |
| 4.3 重组质粒pVR-S的免疫方法优化 |
| 4.4 重组质粒pVR-S与重组腺病毒rAdV-S的单独免疫效果比较 |
| 4.5 重组质粒pVR-S与重组腺病毒rAdV-S的联合免疫效果 |
| 4.6 建议与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）乙肝成体转基因小鼠模型在新型乙肝疫苗免疫方案优化与评价中的应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词 |
| 图表目录 |
| 前言 |
| 第一章 乙肝成体转基因小鼠模型的建立及条件优化 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 1 乙肝成体转基因小鼠模型质粒的建立及优化 |
| 2 两种HBV转基因载体pCS-HBV1.3-与pAAV-HBV1.3建立HBV小鼠模型的比较 |
| 3 乙型肝炎病毒成体转基因小鼠模型的制备条件优化 |
| 3.1 小鼠品系和注射质粒的量对建立HBV小鼠模型的影响 |
| 3.2 小鼠性别对建立HBV小鼠模型的影响 |
| 3.3 小鼠年龄对建立HBV小鼠模型的影响 |
| 讨论 |
| 本章小结 |
| 第二章 新型HBV颗粒样疫苗与不同佐剂或不同载体疫苗联合应用在小鼠体内诱发的免疫应答特征分析 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 第一部分 HBV新型颗粒疫苗与重组病毒载体疫苗的制备和鉴定 |
| 1 重组痘苗病毒的制备与鉴定 |
| 2 重组腺病毒载体疫苗的制备与鉴定 |
| 3 CHO表达的含S+PreS1融合抗原的颗粒疫苗HBSS1鉴定 |
| 4 小结 |
| 第二部分 含HBV S+PreS1融合抗原的颗粒疫苗与重组痘苗病毒载体疫苗联合免疫在小鼠体内的免疫效果评价 |
| 1 免疫分组和免疫程序 |
| 2 体液免疫应答检测 |
| 2.1 各免疫小鼠特异性抗体阳转率分析 |
| 2.2 各免疫组小鼠总IgG抗体滴度变化 |
| 2.3 各免疫组IgG抗体分型分析 |
| 3 细胞免疫应答检测 |
| 3.1 ELISpot检测不同联合免疫方案小鼠细胞免疫应答 |
| 3.2 ICS检测各联合免疫组小鼠细胞因子产生情况 |
| 4 小结 |
| 第三部分 结合不同佐剂的HBV颗粒疫苗初免重组腺病毒载体疫苗加强所诱发的免疫应答 |
| 1 免疫分组和免疫程序 |
| 2 CHO表达的HBV S蛋白颗粒疫苗联合重组腺病毒载体疫苗免疫特点 |
| 3 HBSS1结合alum、CpG和Poly I：C佐剂初免免疫应答特点分析 |
| 4 HBSS1结合alum、CNB佐剂初免免疫应答特点分析 |
| 5 小结 |
| 讨论 |
| 本章小结 |
| 第三章 HBV成体转基因小鼠模型应用于HBV新型疫苗免疫保护和免疫清除效果评价 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 第一部分 HBV转基因小鼠模型在新型HBV疫苗免疫保护评价中的应用 |
| 一 HBV蛋白颗粒疫苗联合不同佐剂同源免疫保护效果评价 |
| 二 HBV重组腺病毒载体疫苗联合蛋白颗粒疫苗免疫保护作用分析 |
| 三 HBV蛋白颗粒疫苗联合重组腺病毒载体疫苗免疫保护作用分析 |
| 第二部分 HBV转基因小鼠模型在新型HBV疫苗免疫保护评价中的应用 |
| 一 HBV蛋白颗粒疫苗联合不同佐剂同源免疫清除效果评价 |
| 二 HBV重组腺病毒载体疫苗联合蛋白颗粒疫苗免疫清除作用分析 |
| 三 HBV蛋白颗粒疫苗联合重组腺病毒载体疫苗免疫清除作用分析 |
| 讨论 |
| 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）胸腺素α原/白介素2融合质粒的免疫佐剂效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1 疫苗佐剂的研究概况 |
| 1.1 免疫佐剂的作用 |
| 1.2 免疫佐剂的分类 |
| 1.3 免疫佐剂存在的问题 |
| 2 电穿孔法 |
| 2.1 电穿孔的作用原理和特点 |
| 2.2 电穿孔在DNA疫苗中的应用 |
| 3 胸腺素α原/白介素2融合质粒 |
| 3.1 胸腺素α原的功能活性 |
| 3.2 白介素2的功能活性 |
| 3.3 胸腺素α原与白细胞介素-2的协同作用 |
| 3.4 融合基因 |
| 3.5 胸腺素α原/白细胞介素-2融合基因的研究进展 |
| 4 本课题的意义 |
| 第二章 实验仪器与材料 |
| 1 主要仪器 |
| 2 试验材料 |
| 2.1 小鼠、质粒 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 实验溶液 |
| 第三章 实验方法 |
| 1 质粒的制备 |
| 2 Balb/C小鼠免疫试验 |
| 2.1 动物免疫分组方法 |
| 2.2 免疫注射 |
| 2.3 小鼠取血 |
| 2.4 小鼠血清表面抗体、抗原检测 |
| 2.5 抗体阳转时间试验 |
| 3 HBV转基因小鼠的免疫试验 |
| 3.1 免疫分组方式 |
| 3.2 腹腔巨噬细胞吞噬活性试验 |
| 3.3 脾淋巴细胞转化率(SI)的测定 |
| 3.4 Elisa法检测淋巴细胞诱生IL-2含量 |
| 3.5 Elisa法检测淋巴细胞诱生IL-4含量 |
| 3.6 Elispot检测淋巴细胞诱生IFN-γ细胞量 |
| 3.7 数据分析与作图 |
| 第四章 结果与分析 |
| 1 与ProTα/IL-2联用免疫Balb/C小鼠后抗-HBs转阳率检测 |
| 2 与ProTα/IL-2 联用抗-HBs阳转时间试验 |
| 3 与ProTα/IL-2联用免疫HBV Tg小鼠后HBsAg检测 |
| 4 腹腔巨噬细胞吞噬活性与淋巴细胞转化率 |
| 5 淋巴细胞转化率 |
| 6 Elisa法检测淋巴细胞诱生的细胞因子IL-2 |
| 7 Elisa法检测淋巴细胞诱生的细胞因子IL-4 |
| 8 Elispot检测淋巴细胞诱生IFN-γ细胞数 |
| 第五章 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 致谢 |
（6）治疗性HBVDNA疫苗的研究进展（论文提纲范文）
| 1 治疗性HBV DNA疫苗的组成结构 |
| 1.1 治疗性HBV DNA疫苗的抗原 |
| 1.2 治疗性HBV DNA疫苗的载体 |
| 2 HBV DNA疫苗治疗慢性乙型肝炎的依据 |
| 3 治疗型HBV DNA疫苗研究进展 |
| 3.1 治疗型HBV DNA疫苗临床前研究进展 |
| 3.2 治疗型HBV DNA疫苗临床研究进展 |
| 4 问题与展望 |
（7）细胞因子融合蛋白质粒及在体电脉冲技术增强治疗性HBV DNA疫苗免疫效果的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 绪论 |
| 相关概论 |
| 研究背景及依据 |
| 存在问题及解决手段 |
| 本研究意义及展望 |
| 参考文献 |
| 第一章 双质粒HBV DNA疫苗及在体电脉冲仪(EP)的构建和检定研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 pFP增强DNA疫苗免疫原性的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 在体电脉冲法提高HBV DNA疫苗免疫效果的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 pFP联合EP提高治疗性HBV DNA疫苗效果的评价 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文讨论与总结 |
| 在校期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）CTLA-4胞外段与HBsAg融合DNA疫苗增强抗HBV免疫的研究（论文提纲范文）
| 英文注释 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒的构建及鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒免疫增强小鼠抗HBsAg免疫应答的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒免疫在HBV转基因小鼠中的抗病毒效应及其诱导的抗HBsAg免疫应答的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 CTLA-4胞外段与HBsAg融合表达重组质粒免疫增强抗HBV免疫应答机制的初步研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述(一) |
| 参考文献 |
| 综述(二) |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录: 工作小结 |
（9）体内增强治疗性乙型肝炎核酸疫苗免疫应答的研究（论文提纲范文）
| 缩写词 |
| 第一章 HBV治疗性疫苗的研究进展 |
| 第二章 Priming-Boost 免疫策略 |
| 第三章 电转染法增强HBV DNA疫苗免疫效果的研究 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 第四章 prime-boost 法增强HBV DNA疫苗免疫效果的研究 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文、科研课题 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
（10）治疗性乙型肝炎病毒DNA疫苗的基础研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 重组质粒的构建 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 真核细胞表达 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 动物试验 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 不同亚型乙型肝炎病毒重组质粒免疫效果的比较 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 小结 |
| 附录：英文词缩略表 |
| 撰写论文 |
| 致谢 |
四、DNA疫苗诱导健康小鼠细胞免疫及HBV转基因小鼠抗-HBs产生（论文参考文献）
- [1]HepG2.2.15细胞来源的自噬小体疫苗（HBV+DRibbles）防治HBV感染及其免疫机制的实验研究[D]. 薛萌. 东南大学, 2015(10)
- [2]乙型肝炎基因治疗的前景展望[J]. 孟忠吉. 湖北医药学院学报, 2014(05)
- [3]表达HBsAg基因的重组质粒与重组腺病毒的免疫学初步研究[D]. 王颖慧. 中国疾病预防控制中心, 2014(08)
- [4]乙肝成体转基因小鼠模型在新型乙肝疫苗免疫方案优化与评价中的应用[D]. 揣侠. 中国疾病预防控制中心, 2012(12)
- [5]胸腺素α原/白介素2融合质粒的免疫佐剂效果研究[D]. 梁勇. 广西师范大学, 2012(09)
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