一、GM-CSF基因修饰的肿瘤细胞疫苗对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用（论文文献综述）
尹起亮[1]（2021）在《IL-33修饰的黑色素瘤干细胞疫苗抗肿瘤及免疫机制研究》文中提出研究背景:随着对肿瘤免疫机制的深入研究,肿瘤免疫治疗成为继手术,化疗,放疗后的又一突破性治疗策略。黑色素瘤免疫治疗是近年来研究的热点,特别是针对细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（cytotoxic T-lymphocyte antigen-4,CTLA-4）和程序性死亡受体-1（programmed cell death protein-1,PD-1）的免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors,ICIs）,已取得了良好的临床疗效。疫苗作为免疫治疗领域的重要分支,在黑色素瘤中的研究甚少,gp100肽疫苗在体外可产生高水平的循环T细胞,并能识别和杀伤黑色素瘤细胞,但临床疗效仍不理想,因此,有效的肿瘤疫苗可作为黑色素瘤免疫治疗领域的重要补充。肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）的概念拓宽了我们对黑色素瘤的理解,根据CSCs理论,靶向黑色素瘤干细胞（melanoma stem cells,MSCs）治疗可抑制黑色素瘤的生长并降低肿瘤复发和转移的风险,因此,以MSCs为靶点的肿瘤疫苗将改善目前免疫治疗方案的疗效。然而,利用疫苗刺激机体产生抗肿瘤免疫反应仍然具有很大挑战,单纯的MSCs疫苗尚不足以诱导强烈的抗肿瘤免疫效应,目前在黑色素瘤中的MSCs疫苗研究大多是通过MSCs致敏DCs去诱导保护性抗肿瘤免疫作用,此外,免疫佐剂可增强MSCs疫苗抗肿瘤免疫应答,通过免疫佐剂IL-21基因修饰MSCs作为疫苗免疫小鼠可增强补体依赖的细胞毒活性和NK细胞毒活性。IL-33作为一种多效性免疫效应因子在激活抗肿瘤免疫中发挥重要作用,包括刺激DCs成熟,增强CD8+T细胞和NK细胞肿瘤杀伤作用,增强体内抗原特异性效应T细胞和记忆T细胞免疫反应等,能显着抑制小鼠肿瘤生长和肺转移,同样,IL-33可作为一种有效的免疫佐剂。而利用IL-33修饰的MSCs作为疫苗对黑色素瘤的影响目前尚无报道,其抗肿瘤免疫机制也有待进一步阐释。研究目的:本研究通过制备IL-33修饰的黑色素瘤干细胞疫苗,旨在研究其抑制黑色素瘤生长和转移的效果,并探索其抗肿瘤的免疫效应机制,为黑色素瘤干细胞疫苗在黑色素瘤免疫治疗中的应用奠定理论和实验基础。研究方法:1.黑色素瘤干细胞疫苗的制备（1）利用免疫磁珠技术分选细胞:利用免疫磁珠从B16F10细胞中分选出B16F10-CD44+CD133+细胞（即黑色素瘤干细胞）和B16F10-CD44-CD133-细胞。（2）分选后黑色素瘤干细胞的鉴定:通过流式细胞术测定分选前后细胞表面CD44,CD133和MHC I的表达;测定细胞克隆形成能力:将分选前后的B16F10和B16F10-CD44+CD133+细胞进行普通的二维（two dimension,2D）和三维（three dimension,3D）培养,观察细胞克隆形成能力;提取分选前后细胞的总RNA,进行RT-q PCR测定干性基因SOX-2,OCT-4和KLF-4的表达。（3）IL-33过表达基因腺病毒感染B16F10-CD44+CD133+:将状态良好的B16F10-CD44+CD133+接种到6孔盘,第2天加入适当体积的病毒（HBAD-EGFP过表达对照或HBAD-IL33-EGFP）,感染8 h。（4）肿瘤细胞灭活及灭活后鉴定:（1）利用丝裂霉素C（mitomycin C,MMC）50μg/ml作用肿瘤细胞4 h对其进行灭活,利用MTT法测定不同时间点细胞增殖率;（2）肿瘤细胞经MMC作用后收集细胞上清液,进行酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）测定IL-33的表达。2.黑色素瘤干细胞疫苗诱导抗肿瘤效果评价（1）建立预防性动物模型:荷瘤小鼠模型:将不同实验组灭活后的肿瘤细胞（包括等体积PBS）5×105个/次接种于C57BL/6小鼠腹股沟皮下,共免疫3次,每次间隔7天,末次免疫7天后,所有小鼠于背部皮下注射B16F10细胞5×105个,定期测量肿瘤大小;肺转移模型:免疫方式同上,末次免疫7天后,所有小鼠经尾静脉注射5×105个B16F10细胞,观察并记录肺转移情况,记录生存期。（2）肿瘤病理组织学检测:末次免疫后3周,取不同组小鼠肿瘤组织进行病理组织学检测,包括苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色,CD8,Ki-67和Caspase-3的免疫组织化学染色。3.黑色素瘤干细胞疫苗诱导抗肿瘤免疫机制的研究（1）疫苗对DCs成熟能力的影响:将小鼠骨髓来源的DCs与不同实验组灭活后的肿瘤细胞（包括等体积PBS）利用悬挂式细胞培养小室间接共培养,共培养4天后,观察DCs形态变化并利用流式细胞术测定细胞表面成熟标志物CD11c,CD80,CD86和MHC II的表达;然后收集DCs并与CFSE标记的脾淋巴细胞以1:10的比例直接共培养6天,通过流式细胞术测定CD8+T细胞CFSE的表达,利用ELISA测定各组细胞培养上清液中IFN-γ和TNF-α的分泌。（2）疫苗对脾脏CD8+T细胞的影响:在末次免疫后3周,取不同组小鼠脾脏淋巴细胞,进行流式细胞术,通过测定脾淋巴细胞表面CD3,CD8和CD69的表达检测疫苗对脾脏CD8+T细胞比例及活性的影响;通过测定PD-1,CTLA-4和Tim-3及中心记忆性表型CD44,CD62L和CD127的表达检测疫苗对CD8+T细胞免疫检查点及CD8+中心记忆性T细胞的影响;通过测定细胞内IFN-γ和Gzm B的表达检测疫苗对CD8+T细胞抗肿瘤效应分子表达的影响。（3）疫苗对小鼠脾淋巴细胞杀伤能力的影响:在末次免疫后3周,取不同组小鼠脾脏淋巴细胞作为效应细胞,体外培养的B16F10细胞作为靶细胞;同样,取疫苗组小鼠脾脏淋巴细胞作为效应细胞,B16F10和分选后的B16F10-CD44+CD133+及B16F10-CD44-CD133-细胞作为靶细胞,利用Calcein-AM释放实验测定脾淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。（4）黑色素瘤组织细胞中CD44,CD133及MHC I的表达:末次免疫后3周,利用流式细胞术测定不同组小鼠黑色素瘤组织细胞中CD44,CD133及MHC I的表达。（5）检测小鼠血清细胞因子水平:在末次免疫后3周,取不同组小鼠血清,利用ELISA检测不同组小鼠血清IFN-α,IL-2,TNF-α和IFN-γ的水平。研究结果:利用免疫磁珠技术成功分选出B16F10-CD44+CD133+细胞,其纯度可达到96.14%,并且B16F10-CD44+CD133+细胞的克隆形成能力较强,其干性相关基因SOX-2,OCT-4和KLF-4的表达明显增强,细胞表面MHC I的表达下降。通过IL-33过表达基因腺病毒成功感染B16F10-CD44+CD133+细胞后,利用MMC对其灭活,并测定细胞活性和IL-33的分泌,同时将灭活后的细胞接种到小鼠腹股沟皮下发现未成瘤,最后得到细胞增殖活性受到抑制但仍可分泌IL-33的B16F10-IL-33 CD44+CD133+细胞株,即黑色素瘤干细胞疫苗（以下简称“疫苗”）。在预防性小鼠模型中,疫苗可明显抑制小鼠黑色素瘤生长及肺转移,并诱导黑色素瘤细胞凋亡,荷瘤小鼠模型中疫苗组小鼠中位生存期和总生存期均明显延长（分别为40天和55天）,而在肺转移模型中疫苗组小鼠中位生存期和总生存期的延长时间更加显着（分别为55天和70天）。进一步研究疫苗抗肿瘤的免疫效应机制,我们发现:（1）疫苗可促进小鼠骨髓来源的DCs成熟,诱导DCs成熟标志物表达上调,并且疫苗作用后的DCs可激活CD8+T细胞,包括刺激CD8+T细胞增殖和促进CD8+T细胞分泌IFN-γ和TNF-α;（2）疫苗免疫小鼠3周后,发现疫苗可增加小鼠脾脏CD8+T细胞比例及活性,并降低免疫检查点的表达,此外,疫苗可诱导脾脏CD8+中心记忆性T细胞的形成并增加CD8+T细胞抗肿瘤效应分子的表达;（3）疫苗免疫小鼠3周后可明显增强小鼠脾脏淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,并且这种杀伤作用特异性强,可靶向杀伤B16F10-CD44+CD133+细胞;（4）疫苗组荷瘤小鼠肿瘤细胞CD44和CD133的表达降低,而MHC I表达增加,并且黑色素瘤组织中CD8+T细胞浸润增加;（5）疫苗可增加免疫后小鼠血清抗肿瘤细胞因子IL-2,IFN-α,TNF-α和IFN-γ的分泌。研究结论:1.从B16F10黑色素瘤细胞成功分选出高纯度、具有干细胞性质的B16F10-CD44+CD133+细胞,并制备出增殖活性受到抑制但仍可分泌IL-33的B16F10-IL-33 CD44+CD133+全细胞疫苗。2.疫苗能明显抑制小鼠黑色素瘤生长和肺转移,诱导肿瘤细胞凋亡,并延长小鼠中位生存期和总生存期。3.疫苗诱导抗肿瘤免疫作用是通过刺激DCs成熟而启动并促进CD8+T细胞增殖,同时抑制CD8+T细胞在体内分化耗竭,诱导记忆性T细胞形成。4.疫苗通过激活宿主体内细胞免疫,增加黑色素瘤组织中CD8+T细胞的浸润,启动细胞毒性T淋巴细胞免疫反应,进而特异性靶向杀伤黑色素瘤干细胞。
何金蓉[2]（2021）在《诱导型表达GSDMD-NT引起细胞焦亡的肿瘤细胞疫苗新策略》文中提出[背景]肿瘤的低免疫原性、高度异质性和肿瘤发生发展过程中免疫抑制性微环境及物理屏障的形成是肿瘤逃避机体免疫监视的主要手段。细胞焦亡是一种新型的免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death,ICD）形式,会释放大量炎性细胞因子和危险信号分子激活免疫系统,对机体抗感染免疫反应与抗肿瘤免疫应答具有重要的调节作用。GSDMD是具有成孔效应的蛋白,研究表明异位表达GSDMD的N末端活性结构域（GSDMD-NT）能造成裂解性、炎症性的细胞焦亡,此外,细胞焦亡效应分子GSDMB/GSDME能与毒性淋巴细胞相互作用,由颗粒酶切割活化诱导细胞焦亡,诱导少于15%的肿瘤细胞发生焦亡就足以激发强效的免疫应答消除整个肿瘤。不同肿瘤细胞ICD的诱导条件不同,不同肿瘤对不同诱导物的响应不同,且往往需要大剂量,同时潜在毒性副作用。基于细胞焦亡的独特发生机制,通过四环素诱导系统在肿瘤细胞中过表达GSDMD-NT可实现通用、高效的焦亡诱导,且GSDMD-NT只能从细胞内膜发挥打孔效应,不会损伤周围正常组织造成焦亡副作用;针对肿瘤高度异质性,细胞焦亡裂解可提供个性化,丰富的肿瘤相关抗原,同时释放大量的炎性细胞因子辅助打破肿瘤免疫抑制机制。因此,诱导肿瘤细胞免疫原性焦亡对于克服肿瘤免疫抑制与免疫逃逸机制,重塑免疫系统对肿瘤的监视与杀伤,获得显着临床治疗效果具有重要意义。[目的]本研究基于细胞焦亡明确的发生机制及在机体抗肿瘤免疫中的调控作用,旨在探讨安全、有效的肿瘤细胞焦亡诱导策略,揭示其免疫特点及效应机制,以及以其为基础的免疫干预策略优化,以期提高肿瘤细胞疫苗的临床治疗潜能。[方法]利用重组慢病毒载体介导的基因表达系统筛选诱导型稳定表达焦亡效应分子GSDMD-NT的肿瘤细胞系;体外CCK-8检测细胞增殖情况,显微镜观察细胞焦亡形态,流式细胞术双染AnnexinV和7-AAD分子检测细胞焦亡比列,免疫荧光检测GSDMD-NT的表达与定位;体外考察细胞焦亡免疫原性特点,Real time qPCR检测相应分子转录水平表达,Western blot检测相应分子蛋白水平表达,ELISA检测炎性细胞因子的释放;利用Transwell小室评估焦亡的肿瘤细胞对BMDCs迁移募集的影响,利用流式细胞术检测BMDCs的成熟情况;体内诱导表达GSDMD-NT引起肿瘤细胞焦亡对小鼠肿瘤进行免疫干预,流式细胞术检测小鼠脾脏与肿瘤的免疫效应细胞激活和免疫抑制性细胞浸润的情况。[结果]（1）成功构建四环素诱导表达GSDMD-NT的慢病毒质粒,质粒酶切鉴定和293FT瞬时转染蛋白表达检测验证质粒正常工作;（2）成功筛选得到三种诱导型稳定表达GSDMD-NT的小鼠肿瘤细胞系（TC-1,4T1,CT26）,四环素诱导后GSDMD-NT的转录水平和蛋白水平表达升高;（3）体外成功诱导肿瘤细胞焦亡,GSDMD-NT作用于细胞膜,显微镜观察到细胞肿胀变大膜破裂、细胞核固缩、DNA断裂的典型细胞焦亡形态,AnnexinV+7-AAD+双阳性细胞比率随诱导时间动态增加;（4）CCK-8细胞增殖检测验证GSDMD-NT基因修饰后未诱导表达不影响细胞增殖,当诱导表达后明显抑制细胞增殖;（5）肿瘤细胞焦亡发生过程中,ELISA检测IL-18,IL-1β,IL-33,IL-6炎性细胞因子释放增多,Western blot检测HMGB1表达水平升高,细胞焦亡上清中ATP、LDH、HMGB1释放增多,Real time qPCR检测Hsp70/90,CXCL9,H-2Kb的表达上调,PD-L1表达下调;（6）焦亡的肿瘤细胞能促进BMDCs的迁移与成熟,CD80,CD86,MHC Ⅰ,MHC Ⅱ类分子表达升高;（7）GSDMD-NT基因修饰的TC-1小鼠皮下移植瘤模型,体内诱导细胞焦亡可完全消除20～800mm3的肿瘤,并对再次接种的野生型TC-1肿瘤产生了长达至少30天的免疫保护作用;（8）不同剂量GSDMD-NT基因修饰的TC-1肿瘤细胞皮下注射后直接诱导焦亡,证明基因修饰的肿瘤生长可人为控制且不会成瘤,其免疫保护效果与细胞剂量成正相关;（9）（10）瘤内注射GSDMD-NT基因修饰的TC-1肿瘤细胞疫苗体内诱导焦亡可显着抑制已建立的TC-1肿瘤生长,流式检测脾脏和肿瘤中的抗肿瘤CTLs,NKs效应细胞数量增多,MDSCs抑制性细胞数量减少;（11）GSDMD-NT基因修饰的4T1乳腺癌原位肿瘤模型和CT26结直肠癌皮下移植瘤模型,在不同肿瘤大小时体内诱导细胞焦亡,在6～40mm3大小时能显着抑制肿瘤生长,在40～200mm3大小时其抑瘤效果并不显着,流式细胞术分析结果显示新型焦亡肿瘤细胞疫苗通过刺激活化系统性抗肿瘤CTLs效应细胞数量增多,减少MDSCs抑制性细胞数量显着抑制4T1乳腺原位肿瘤的生长。[结论]诱导型稳定表达焦亡核心效应分子GSDMD-NT是高效、通用的肿瘤细胞免疫原性死亡诱导方式,小鼠体内肿瘤细胞焦亡诱导提供了广谱、个体化的肿瘤抗原和充足的ICD性状表达,从而提供强的免疫刺激信号激发了强效的抗肿瘤免疫应答。其中,针对含有HPV-E6/E7抗原的高免疫原性TC-1肿瘤具有完全清除肿瘤的效应,而对于免疫抑制性强的4T1/CT26肿瘤其抑瘤效果就未达到同等效果。总之,本研究针对肿瘤的异质性挑战,提出了基于细胞免疫原性死亡诱导的肿瘤细胞疫苗新策略,为新型肿瘤免疫干预治疗及肿瘤疫苗的研究提供了有益的探讨及重要参考。
尹良伟[3]（2021）在《黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究》文中研究表明自20世纪70年代末,全球乳腺癌（Breast Cancer）发病率一直呈上升趋势,在我国乳腺癌已经成为女性发病首位的恶性肿瘤,而且呈现年轻化趋势;年轻女性乳腺癌的发病,往往侵袭性更高,病理分级及预后更差。手术、化疗、放疗和内分泌治疗是乳腺癌传统的四大治疗手段,生物治疗为进入本世纪以来乳腺癌的第五大治疗手段,免疫治疗从属于生物治疗的范畴。然而,乳腺癌免疫治疗的发展一直较为缓慢。因此,如何合理选择人群和合理的治疗模式,让更多的乳腺癌患者从免疫治疗中获益,是未来该领域的重点发展方向。树突状细胞（Dendritic Cells,DC）作为抗原提呈功能细胞的主要效应细胞之一,将固有免疫和适应性免疫紧密连接在一起,尤其是在特异性免疫反应中发挥独特的免疫学效应。根据不同阶段DC生物学特性的不同,有些学者设想利用改善DC功能的手段来增强其抗肿瘤效应。黏蛋白1（Mucins1,MUC1）是I型跨膜糖蛋白,正常情况下可表达于多种组织、器官的上皮细胞近管腔或腺腔面,亦可见于腺癌上皮细胞的表面,而且呈高表达态势。相关研究显示,MUC1表达程度越高,往往预示着肿瘤侵袭性越强,预后越差,而且更容易出现局部浸润、淋巴结转移和血行转移。结合近年来MUC1在肿瘤生物治疗中的新发现以及基因修饰技术的成熟和推广,我们以MUC1作为出发点,以基因修饰DC作为主要技术路线,分以下3部分系统探讨MUC1基因转染后的DC对乳腺癌的免疫作用,旨在探索乳腺癌新的肿瘤免疫治疗途径与方法。一、黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备目的:验证MUC1在人乳腺癌中高表达,并构建和包装MUC1重组慢病毒,感染DC,制备过表达MUC1的DC疫苗。材料和方法:（1）应用免疫组织化学技术检测90例乳腺癌组织和30例癌旁正常组织以及三种细胞（神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y与两种乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231）中MUC1蛋白的表达,q PCR检测26例新鲜乳腺癌组织和癌旁正常组织以及三种细胞MUC1 m RNA水平,验证MUC1在乳腺癌组织及细胞系中的表达;（2）应用GV657载体,经目的基因扩增、PCR产物与载体交换、测序、质粒提取及纯化、病毒包装,获取重组MUC1慢病毒;（3）通过密度梯度离心法,体外分离获得人外周血单个核细胞;采用无血清培养基,经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rh GM-CSF）、重组人白介素-4（rh IL-4）和肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor,TNF）-α诱导产生成熟DC;流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平;（4）MUC1慢病毒感染DC,分为MUC1基因感染DC组（MUC1-DC组）、空载体感染DC组（GFP-DC组）以及对照组（DC组）;（5）RT-PCR检测感染后DC的MUC1 m RNA水平;（6）Western blotting检测感染后DC的MUC1蛋白表达。结果:（1）90例乳腺癌组织中,MUC1表达明显高于癌旁正常组织,92.2%（83/90）乳腺癌组织中显示MUC1高表达,30例癌旁组织中5例为高表达（16.7%）,其余25例者（83.3%）为阴性或细胞质内弱表达。在26例乳腺癌组织中有92.3%（24/26）的MUC1 m RNA水平明显高于配对的癌旁对照组织（P<0.01）,仅2例乳腺癌中MUC1 m RNA表达水平与癌旁组织相当;与神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y比较,两种乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的MUC1 m RNA水平和蛋白表达均显着增高（均为P<0.01）;（2）MUC1重组质粒测序结果与目的基因一致,经包装获得病毒滴度为1×109TU/m L的重组MUC1慢病毒;（3）相差显微镜观察体外培养的外周血来源DC形态变化过程,培养至5～7d大部分细胞脱壁悬浮,体积明显增大且大小不等,形态不规则,表面可见很多粗细不一、参差不齐、形态各异的毛刺状突起,呈现典型的树突状细胞形态;培养7d的DC流式检测结果显示,CD1a、CD80、CD83及CD86分子表达率分别为（21.6±2.4）%、（22.7±1.6）%、（24.9±2.1）%及（95.4±4.3）%,表明获得成熟DC;（4）采用MUC1重组慢病毒感染DC后,于24 h时可见特异性GFP表达,24h、48 h、72 h的转染效率分别为（11.7±1.0）%、（12.9±0.9）%和（36.8±1.6）%;（5）与空载体组和对照组相比,MUC1-DC组RT-PCR检测到346 bp扩增带;（6）同时Western blotting检测MUC1-DC组可见明显的MUC1蛋白条带。结论:（1）验证了MUC1在人乳腺癌组织以及两种人乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231中呈高表达;（2）成功构建MUC1重组质粒,并包装获得携带MUC1基因重组慢病毒;（3）以MUC1重组慢病毒感染DC,成功获得过表达MUC1的DC,即MUC1-DC疫苗。二、MUC1-DC免疫功能的体外研究目的:探究前一部分实验获得的MUC1-DC疫苗在体外诱导CTL的免疫作用及对人乳腺癌细胞MCF7的杀伤活性。材料和方法:（1）诱导培养特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,免疫荧光技术检测不同转染时间后MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-α情况;（2）ELISA法检测比较MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL和DC-CTL IL-12、TNF-α含量;（3）以人乳腺癌细胞MCF7为靶细胞,以MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL、DC-CTL为效应细胞,采用LDH释放法检测CTL的杀伤活性,CTL特异性杀伤率（%）=（试验孔值-效应细胞对照值）/（最大杀伤对照值-最小杀伤对照值）×100%。结果:（1）经免疫荧光检测,转染的MCU1-DC培养2d后诱导CTL开始表达IL-12和TNF-α,但荧光强度较弱;与MCU1-DC培养3d相比,培养4d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的量均明显升高,荧光强度增强,差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.05）;MCU1-DC培养5d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α荧光强度最强;MCU1-DC培养6d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的荧光强度逐渐下降;（2）ELISA结果显示:GFP-DC诱导CTL分泌细胞因子IL-12、TNF-α能力较低,分别为（101.83±5.79）ng/m L、（119.26±11.52）ng/m L,与DC组比较差异无统计学意义（P>0.05）;而MUC1-DC诱导CTL分泌这两种因子的能力明显增强,分别为（202.52±17.10）ng/m L和（349.07±79.42）ng/m L,与DC组和GFP-DC组比较,差异均有明显统计学意义（均为P<0.01）;（3）LDH释放法检测结果显示,三组杀伤活性均随效靶比的升高而增强;相同效靶比时,与DC-CTL组或GFP-DC-CTL组比较,MUC1-DC-CTL组对靶细胞MCF7具有更明显的杀伤活性,差异具有明显统计学意义（均为P<0.01）。结论:（1）MUC1基因转染的DC诱导CTL即MUC1-DC-CTL在5 d时分泌IL-12和TNF-α的能力最强,用于本研究后续实验;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC诱导CTL具有更强的产生IL-12、TNF-ɑ细胞因子的免疫活性;（3）MUC1-DC-CTL对人乳腺癌MCF-7细胞比单纯DC-CTL具有更明显的杀伤活性,而且随着效靶比的升高,CTL的杀伤活性逐渐增强。三、光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用目的:通过活体监测MCF7荷瘤裸鼠的成瘤生长情况,评价MUC1基因转染的DC疫苗对乳腺癌免疫作用的效果及其可能的机制。材料和方法:（1）GFP慢病毒转染MCF7细胞（GFP-MCF7）;（2）BALB/c裸鼠皮下种植GFP-MCF7 1×107个/只,成瘤后随机分为3组,各组裸鼠首先尾静脉注射体外活化的CIK细胞1×108个/只,治疗组于皮下注射MUC1-DC（MUC1-DC组）或DC细胞（DC组）1×107个/只,体积0.2 ml/只,对照组（Ct组）注射等体积生理盐水,每天治疗1次,连续5d;（3）采用小动物活体光学成像系统在开始治疗前及开始治疗后第35d进行成像观察移植瘤荧光成像,分析荧光强度和荧光面积;（4）免疫组化法检测三组裸鼠移植瘤组织中Caspase3的表达情况;（5）TUNELl法检测三组裸鼠移植瘤组织中的细胞凋亡率。结果:（1）裸鼠于GFP-MCF7荷瘤后7d,成瘤率100%。开始治疗前和开始治疗后35d活体光学分子成像结果显示,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号强度无明显差异（F=0.4341,P>0.05）;开始治疗后第35d,MUC1-DC组的荧光信号强度明显低于Ct组（F=7.864,P<0.05）;DC与Ct、MUC1-DC与DC组间均无显着性差异（均为P>0.05）,但MUC1-DC比DC组荧光信号更低。从荧光信号面积上进行统计分析,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号分布面积无显着差异（F=1.084,P>0.05）;开始治疗后第35d,Ct组荧光信号呈多处散在分布,MUC1-DC组和DC组的荧光信号面积均明显低于Ct组（均为P<0.01）,但MUC1-DC组与DC组的荧光信号面积无显着性差异（P>0.05）;（2）Ct组Caspase3表达最少,DC组次之,MUC1-DC组呈高表达Caspase3,三组间比较,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;（3）TUNEL结果显示,三组细胞凋亡率分别为:Ct组（4.11±2.61%）、DC组（9.63±2.27）%、MUC1-DC组（25.30±8.24）%,三组间比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）GFP荧光标记的人乳腺癌细胞在裸鼠内可以持续表达荧光信号,可以通过光学分子成像系统检测光密度值观察肿瘤的部位及生长情况,是一种活体内实时动态观察肿瘤的生长和转移、评价抑瘤作用的有效方法;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC免疫治疗人乳腺癌荷瘤小鼠能够更有效地抑制肿瘤生长和扩散;（3）MUC1-DC发挥了更好的促进肿瘤细胞凋亡的作用。
涂丽裙[4]（2020）在《转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用》文中指出转化生长因子-β2（TGF-β2）对免疫应答有全方位的负调节作用,可调节几乎每一种适应性免疫应答和固有免疫应答的细胞,包括树突状细胞、T细胞、B细胞、粒细胞和固有免疫淋巴样细胞。使用免疫检查点抑制剂治疗肿瘤的成功案例提示我们:抑制免疫抑制性细胞因子TGF-β2可能是一种新的策略去研制新型疫苗佐剂。为了研制出以核酸为基础的TGF-β2的抑制剂,我们设计了三个靶向人鼠的TGF-β2 m RNA3’UTR保守区域的反义寡核苷酸,并将其命名为TIO1,TIO2,TIO3。在小鼠巨噬细胞,人单核细胞及人浆细胞样树突状细胞,TIO1,TIO2及TIO3均明显下调TGF-β2的表达。在小鼠中,TIO3和TIO1,均可显着增强微生物疫苗所诱导的抗体反应。其中TIO3为佐剂的流感疫苗可抵抗流感病毒的攻击并减轻流感病毒引起的急性肺损伤。在小鼠中,TIO3可明显下调淋巴结及脾脏细胞CD4+T细胞及CD19+B细胞上s TGF-β2的表达,上调CD19+B细胞及CD11c+DC表面CD40,CD80,CD86,CD69及MHC II分子的表达,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ,促进CD4+T细胞产生IL-4,抑制调节性T细胞（Tregs）的产生,促进CD4+T细胞和CD19+B细胞的增殖与活化,促进流感病毒感染的小鼠的肺脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞表面CD69的表达。总的来说,通过干扰TGF-β2的表达,TIO3或TIO1,可作为新型微生物疫苗佐剂增强疫苗诱导的抗体反应;此外,TIO3为佐剂的胶质瘤细胞裂解物疫苗可显着延长原位接种胶质瘤预防模型小鼠的生存期。TIO3可通过抑制人和小鼠的胶质瘤细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞表达TGF-β2,诱生胶质瘤特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞,激活NK细胞,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ,上调胶质瘤细胞表面MHCI分子的表达进而增强胶质瘤疫苗的抗肿瘤功效。单独应用TIO3可通过抑制胶质瘤细胞表达TGF-β2、促进胶质瘤细胞表达MHC I,IL-17A及IFN-α、抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞表达s TGF-β2、抑制Tregs的产生、促进CD4+T细胞及CD8+T细胞的增殖而明显延长原位接种胶质瘤预防模型小鼠的生存期。单独应用TIO3可通过抑制胃癌细胞表达TGF-β2,促进MHC I,IL-13,IL-15,IL-17及IFN-γ的表达而显着减少肿瘤体积、延长胃癌背部移植瘤小鼠的生存期。TGF-β2的反义寡核苷酸有潜能作为微生物疫苗和肿瘤疫苗的新型佐剂,或单独治疗胶质瘤和胃癌的候选药物。
徐泽[5]（2020）在《半细菌化类鼻疽杆菌载体制备LL/2肺癌疫苗及其抗肿瘤效应研究》文中研究说明目的:肺癌是全世界恶性肿瘤死亡相关的首要原因。免疫系统可识别肿瘤细胞,肿瘤疫苗可以增强机体的抗肿瘤免疫力,特别是激活抗肿瘤免疫特异性CD8+T淋巴细胞来消除肿瘤细胞。虽然在过去十年中肿瘤疫苗研发方面取得了很大进展,但临床实践效果仍不理想,有必要寻找更好的制备方法。细菌天生就有病原模式分子（PAMP）,而免疫细胞则有PAMP的模式识别受体（PRR）,因此免疫系统能对细菌产生有效的免疫反应。本研究利用细菌这种特性,将类鼻疽伯克霍尔德杆菌细胞壁孔隙化,并使部分内容溢出变成一种具有缝隙中空的药物载体（称为半细菌）,用小鼠Lewis肺癌细胞（LL/2）裂解物作为抗原,在小鼠肿瘤模型中探讨这种“半细菌”作为抗肿瘤疫苗载体的可行性,寻找一种制备肿瘤疫苗的新办法。方法:在本论文研究中通过放射减毒、适当加热和酶解的方法将类鼻疽伯克霍尔德杆菌（简称类鼻疽杆菌）细胞壁孔隙化,制备成一个可以通透细胞裂解物的载体（称之为“半细菌”,SB）,测定其特点、活性及表征;然后装载LL/2肿瘤裂解物（LTL）和疫苗佐剂CpG,通过共聚焦显微镜观察,证明了能有效将LL/2肿瘤裂解物和CpG装载进入半细菌,表明LL/2肿瘤裂解物半细菌疫苗（命名为SB-LC）制备成功;体外实验评估SB-LC对树突状细胞成熟、活化能力,分组与树突状细胞（DC）培养,流式细胞术测定树突状细胞（DC）成熟相关（CD40、CD80和CD86）表达情况及细胞因子（INF-γ、TNF-α）分泌情况是否提示有效刺激树突状细胞的成熟。使用同源C57BL/6小鼠构建LL/2肿瘤模型,右胁肋部注射肿瘤细胞（1×106）此作为预防组、治疗组方案模型,每3天观察小鼠LL/2肿瘤生长情况,观察SB-LC疫苗能否抑制肿瘤生长;制备脾脏效应细胞进行细胞毒T淋巴反应（CTL）证明特异性抗肿瘤免疫效应,流式细胞仪测定表达INF-γ的CD8+细胞量百分比;同样我们为了验证体液免疫产生效应,使用Western Blot检测小鼠血清相关抗体,酶联免疫吸附实验（ELISA）方法测定树突状细胞培养上清液细胞因子及血清特异性抗体含量;使用酶联免疫斑点试验（ELISPOT）方法测定脾脏分泌特异性抗体淋巴细胞含量。此外,分选小鼠肿瘤中的肿瘤浸润淋巴细胞,通过流式细胞分析不同组别表达INF-γ的CD8+T细胞数量比例,对CD4+进行设门测定表达CD25+、FOXP3+双阳调节性T细胞（Tregs）数量。了解LL/2肿瘤裂解物半细菌疫苗（SB-LC）是否能够改变肿瘤免疫抑制的微环境。结果:本课题成功制备了LL/2肿瘤裂解物半细菌疫苗（SB-LC）,体外实验表明能够诱导DC细胞成熟、活化,诱导成熟标志CD40、CD80、CD86的表达,并释放细胞因子。预防组、治疗组小鼠模型证明了可以有效地抑制肿瘤生长,SB-LC组CTL反应效应最为显着,经治疗后的荷瘤小鼠血清中可测得特异性IgG抗体产生。分离荷瘤小鼠模型的肿瘤浸润淋巴细胞,SB-LC疫苗处理的调节T细胞（Treg）减少,逆转免疫抑制肿瘤免疫微环境。结论:LL/2肿瘤裂解物半细菌疫苗（SB-LC）在体外可有效诱导树突状细胞成熟,在预防性和治疗性实验组可有效抑制肿瘤生长,可有效杀伤肿瘤细胞。
袁佳蕾[6]（2020）在《人参皂甙Rg3增强致敏DC诱导CTL影响小鼠肾癌细胞RAG的实验研究》文中研究指明人参皂甙Rg3是人参（Panax ginseng C.A.Meyer）的有效成分,近年来的研究证实Rg3具有诱导肿瘤细胞凋亡,选择性抑制肿瘤细胞黏附和浸润,抑制肿瘤新生血管形成等抗肿瘤作用。同时可调节机体免疫功能,增强机体非特异性免疫功能等作用,被认为是一种免疫增强剂。树突状细胞（dendritic cell,DC）是一种功能极强的抗原提呈细胞,在免疫应答中居于重要地位。在机体发生免疫反应时,DC可高效地促进机体生成细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte,CTL）和辅助性T细胞（helper T cells,Th细胞）,并产生免疫应答,DC不但是机体免疫反应的启动者,也是参与者。由DC激活的CTL介导的细胞免疫应答在对恶性肿瘤的发生、发展及预后发挥着极其重要的作用。肾癌是泌尿系统常见的肿瘤之一,与大多数肿瘤一样,治疗效果不尽人意,多数患者死于肿瘤转移。故对肾癌迁徙转移的研究一直是学者们探讨的热点之一。本研究用Rg3联合细胞因子诱导DC,用小鼠肾癌细胞株RAG致敏Rg3-DC诱导CTL,利用Rg3对DC的免疫增强作用及Rg3抗肿瘤的作用机制具有多抗靶点、多环节、多效应的特点,以体外培养的RAG细胞为研究对象,观察比较RAG致敏的Rg3-DC与常规DC对RAG细胞增值、迁徙、杀伤以及免疫学功能的影响,目前尚未见报道。同时进一步探讨Rg3诱导DC的抗肿瘤机制,为制备新型增效的DC奠定理论基础。目的:1探讨Rg3促进DC的免疫增强作用,比较Rg3-DC与常规DC对T细胞的影响;2以小鼠肾癌细胞株RAG为对象,研究Rg3增强RAG细胞致敏的DC诱导的CTL,对肿瘤抑制、侵袭、转移和免疫学功能的影响,探讨Rg3增强DC免疫功能的抗肿瘤机制。方法:1 Rg3激活DC功能的研究,用流式术（Flow Cytometry,FCM）FCM检测DC表面分子（CD11c PE、CD80、CD86、MHCⅡ）的表达,观察经不同浓度Rg3（2μg/ml、10μg/ml、20μg/ml）处理6d后Rg3对DC成熟度的影响;2 Rg3增强RAG细胞致敏的DC对不同浓度同种异体小鼠T细胞（DC:T:1:100、1:10、1:1）混合培养48h,用CCK8法检测T细胞增殖率,ELISA法检测免疫功能;3将诱导的CTL细胞与RAG细胞混合培养（CTL:RAG效靶比:10:1、20:1、40:1）,18h后用FCM检测细胞凋亡;Western blot检测凋亡基因（Bax,Bcl-2）;4 Transwell、划痕愈合实验证明Rg3-DC+T对RAG细胞迁徙及转移的影响。结果:1人参皂甙Rg3能够促进DC的成熟,FCM检测结果显示,在一定的时间范围内,与对照组相比,随着Rg3浓度的升高,被诱导的DC表达CD86、MHCⅡ、CD11c水平随之升高（P<0.05）,CD80在不同作用时间范围内随时间延长,表达增高（P<0.05）;而Rg3的浓度变化对CD80无明显影响。2随着Rg3浓度的增加及DC:T比值增大,被诱导的CTL细胞增殖量增加,统计学分析P<0.0001。CTL细胞表达IL-2、IFN-γ的水平随着Rg3浓度的升高而升高。统计学分析P<0.0001。3 FCM检测结果显示,Rg3-DC诱导的CTL细胞与RAG细胞混合培养时,效靶比值越高CTL诱导细胞凋亡的能力越强P<0.0001;Bax/Bcl-2增大P<0.05。4 Transwell小室细胞侵袭实验及划痕愈合实验证明Rg3-DC诱导的CTL细胞对体外培养的RAG细胞有显着影响。结论:（1）人参皂甙Rg3具有促进树突状细胞分化成熟及刺激淋巴细胞的增值的作用,且有一定的量效关系;（2）抗原致敏的Rg3-DC对CTL细胞的增值作用说明一定浓度的Rg3能够优化DC,使其捕捉抗原的能力及激活CTL的能力增强。（3）本研究中的CTL细胞对小鼠肾癌细胞株RAG的生长、侵袭和转移有抑制作用。
崔博沛[7]（2020）在《柯萨奇病毒溶瘤作用和抗原检测试剂研究》文中研究表明第一部分溶瘤柯萨奇病毒的筛选与评价肠道病毒（Enterovirus,EV）是一类单股正链RNA病毒,包括柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、埃可病毒等,能够导致手足口病（HFMD）、疱疹性咽峡炎、脊髓灰质炎等疾病。因EV的复制周期较短,能够迅速感染某些肿瘤细胞系产生细胞病变效应并使其死亡。目前已报道多种具有溶瘤作用的EV,如柯萨奇病毒A21等,但大多用于治疗恶性黑色素瘤等欧美地区高发的肿瘤,应用于肺癌、肝癌等亚太地区高发肿瘤类型的研究较少。本研究发现一株能应用于肺癌治疗的溶瘤病毒CV-B5/Faulkner（Gen Bank:AF114383）,并对溶瘤机制进行了探讨。研究结果显示,用CV-B3/Nancy,CV-B3/112,CV-B5/Faulkner,CV-B5/JS417,CV-A6/Gdula分别感染肺癌细胞系、正常肺组织细胞系、肝癌细胞系、正常肝细胞系和宫颈癌细胞系后,仅CV-B5/Faulkner和CV-B5/JS417具备选择性感染肺癌细胞而不感染正常肺组织细胞的双重特性。使用梯度稀释的CV-B5/Faulkner可在肺癌细胞（A549、H1299、NCI-H460）上表现出明显的剂量依赖效应;使用100 MOI的CV-B5/Faulkner感染正常肺组织细胞系（MRC-5、KMB-17、2BS）后的细胞活性与正常细胞对照相比无统计学差异（P>0.05）。免疫印迹实验和流式细胞术结果均表明,CV-B5的主要受体腺病毒-柯萨奇病毒受体（CAR）只表达于肺癌细胞表面,这在一定程度上保证了CV-B5的选择感染能力。应用人肺癌细胞A549、H1299、NCI-H460建立了BALB/c裸鼠的荷瘤动物模型。当肿瘤直径达到4-5mm时,通过连续五次瘤内给予(每次5×106TCID50)CV-B5/Faulkner,可以完全抑制乃至治愈H1299肿瘤（P<0.01）,显着抑制A549肿瘤（P<0.05）,但对NCI-H460肿瘤无明显效果（P>0.05）。应用不同针次治疗H1299肿瘤的结果表明,仅使用一针次或三针次病毒就可完全抑制直径4-5mm或8-9mm的H1299肿瘤,并且能延长小鼠30-90天的生存时间。为验证CV-B5的远端治疗靶向性构建了双侧生长A549或H1299细胞的裸鼠模型,发现单侧给予CV-B5可以明显抑制对侧肿瘤的生长,差异与对照组相比有统计学差异（P<0.05）。CV-B5治疗后小鼠脑、肺、肝、胰腺、脾、肾脏、心脏等主要脏器未发现明显的组织病理学改变,为CV-B5作为溶瘤病毒的安全性提供了数据。此外,本研究表明CV-B5/Faulkner溶瘤作用依赖于病毒诱导的凋亡途径的级联活化。单独应用0.1MOI CV-B5/Faulkner在细胞水平不能明显溶瘤NCI-H460细胞。将多种信号途径抑制剂分别与CV-B5联用,在细胞水平筛选出了蛋白激酶B（PKB）通路的抑制剂可以显着增强CV-B5的溶瘤作用（P<0.05）。研究发现CV-B5/Faulkner毒株可能通过CAR受体途径特异性感染并溶解肺癌细胞系,体内溶瘤实验显示良好的溶瘤效果,通过病毒诱导凋亡途径的级联活化发挥溶瘤作用,PKB通路抑制剂可增强CV-B5对不敏感肿瘤细胞的溶瘤作用,显示CV-B5/Faulkner具有进一步研发成为溶瘤疫苗的潜力。第二部分柯萨奇病毒A组16型通用抗原定量检测方法的建立与验证柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16,CV-A16）是EV A组成员之一,可引起轻症和重症HFMD。目前国内多家企业致力于CV-A16疫苗的研发。CV-A16抗原含量的定量测定是疫苗研发、质控和评价的关键环节。目前全球缺乏通用的CV-A16抗原定量检测方法,为疫苗研发和评价提出挑战。本研究采用酶联免疫吸附实验法建立CV-A16通用抗原定量检测方法。筛选到一株构象性单克隆抗体16E1,可以中和CV-A16 B1b和B2b亚型毒株（滴度≥9600）;广泛结合CVA16 B1a,B1b和B2b等亚型抗原（S/CO>30）;应用10μg/g 16E1可以100%保护乳鼠免于致死剂量CV-A16/BJCA08病毒攻击。本研究通过摸索相关参数,以CV-A16国家抗原标准品（CV-A16 NS）为参考物质,建立了以16E1为包被抗体,一株兔源多抗（中和效价为1:6144、结合效价为106）为二抗的检测体系,并采用平行线分析法统计结果。方法学验证结果显示,本检测试剂不与EV-A71等其他肠道病毒交叉反应,线性范围为12.5-200U/ml,不同浓度标准品的回收率为80-115%,重复性和中间精密度CV值均小于15%,以上参数均满足药典相关要求。适用性研究纳入了国内六个CV-A16灭活疫苗研发企业,毒株类型包含B1a、B1b、B2a、B2b等,由各企业独立完成原液、收获液、纯化液的抗原检测。结果表明,6个不同CV-A16疫苗原液的平行性和线性与CV-A16 NS相比均无显着性差异（P>0.05）,且不同样本拟合曲线的斜率波动较小（-0.85-1.25）,说明本方法可用于检测不同工艺、毒株的疫苗原液中的抗原含量。此外,同一厂家的收获液、纯化液和原液的平行性与线性与CV-A16 NS相比无显着性差异（P>0.05）,且三条曲线的斜率差异较小（-0.97-1.04）,说明本检测体系不易受到样本中其他成分的干扰,可用于检测不同工艺阶段产品中的有效抗原含量。本研究采用具有高效价和广谱中和能力的CV-A16构象单抗,通过单抗-多抗双抗体夹心法建立了CV-A16疫苗抗原检测试剂盒,经方法学验证,特异性、重复性、精密度良好,经6个实验室、3个工艺阶段制品适用性研究,证明该试剂盒对不同基因型、不同工艺制品均具有良好适用性,可作为CV-A16疫苗抗原通用试剂盒,可保证CV-A16灭活疫苗抗原活性、有效性评价的准确性、重复性及可比性,为促进我国CV-A16疫苗研发提供工具。
胡箫[8]（2020）在《溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒对小鼠结肠癌模型免疫状态及肿瘤微环境影响的研究》文中提出背景作为肿瘤生物治疗的前沿领域,近年来,溶瘤病毒疗法显示出了巨大的应用潜力,并为肿瘤的免疫治疗提供了新的方向。溶瘤病毒疗法可通过直接于瘤内注射溶瘤病毒来触发局部和全身的免疫反应,以达到溶解肿瘤细胞,然后释放肿瘤相关抗原,随后激活肿瘤特异性效应T细胞的目的。多种溶瘤病毒在临床前和临床试验中显示出了良好的安全性、靶向性以及令人兴奋的治疗效果。一种基于Ⅰ型单纯疱疹病毒的溶瘤病毒talimogene laherparepvec（T-VEC）已经完成了Ⅲ期临床试验,并已获得美国食品和药物管理局（FDA）的批准上市,用于治疗初次手术后复发的不可切除的黑色素瘤。了解溶瘤病毒治疗肿瘤所引起的机体免疫系统的改变及其对肿瘤微环境的影响,有利于为今后更好地应用溶瘤病毒进行免疫治疗提供有利依据。因此,本研究中我们应用一种基于Ⅱ型单纯疱疹病毒的溶瘤病毒oHSV2,探讨其在免疫完全和免疫缺陷荷瘤小鼠（小鼠结直肠癌CT26细胞系）模型中的直接溶瘤作用及其引起的抗肿瘤免疫应答。目的本研究的主要目的是明确oHSV2在荷瘤小鼠（小鼠结直肠癌CT26细胞系）模型中的直接溶瘤作用及其引起的抗肿瘤免疫应答。通过建立免疫完全和免疫缺陷小鼠双侧荷瘤模型,检测脾脏中淋巴细胞的表型和对肿瘤细胞的杀伤作用,以及分析双侧肿瘤微环境中的病理学特征和免疫基因的表达情况,为溶瘤病毒oHSV2激发机体特异性抗肿瘤免疫应答,改变肿瘤微环境的免疫状态提供依据。方法（1）应用CCK-8增殖实验检测oHSV2对小鼠结肠癌CT26细胞系的体外溶瘤活性。（2）通过皮下接种方式建立BALB/c小鼠单侧和双侧荷瘤（小鼠结直肠癌CT26细胞系）模型,探讨oHSV2的体内治疗作用及其引起的抗肿瘤免疫应答。（3）采用二次打击和免疫学杀伤实验,探讨oHSV2引起的特异性免疫应答。（4）通过皮下接种方式建立免疫缺陷小鼠双侧荷瘤（小鼠结直肠癌CT26细胞系）模型,探讨先天性免疫应答在oHSV2治疗肿瘤过程中发挥的作用。（5）应用流式细胞术检测各治疗组小鼠脾脏淋巴细胞的表型状态,同时分析双侧肿瘤病理学特征及免疫相关基因表达谱特征,探讨oHSV2治疗后机体整体免疫状态和局部肿瘤微环境的变化情况。结果（1）溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒oHSV2对小鼠结肠癌CT26细胞系具有显着的溶瘤作用,其效果呈时间和剂量依赖性。（2）在单侧和双侧小鼠结肠癌荷瘤模型上观察oHSV2的体内抗肿瘤作用。oHSV2治疗能有效抑制单侧和双侧肿瘤生长,延长小鼠存活时间,并且无明显副作用。（3）oHSV2治疗能够有效阻止相同肿瘤再次接种后成瘤。对于双侧荷瘤模型,单个病灶内的oHSV2治疗可同时有效抑制双侧肿瘤的生长。（4）NK细胞引起的非特异性免疫反应,即对靶细胞（被病毒感染的肿瘤细胞）的非特异性识别杀伤作用,在oHSV2治疗肿瘤的过程中同样起到了一定的抑制肿瘤生长的作用。（5）oHSV2的应用能够有效降低外周免疫中免疫抑制性细胞（如Tregs和MDSCs）的水平,有利于打破免疫耐受;同时提高了外周免疫中正向免疫细胞（如NK细胞、DCs、CD8+T细胞的）的水平,有利于加强非特异性和特异性抗肿瘤免疫反应;紧随特异性免疫应答后机体形成了免疫记忆,有利于有效防止肿瘤的转移和复发。（6）oHSV2治疗改变了肿瘤微环境的免疫状态。这种作用并非只局限于接受治疗的局部组织,而是同时会对其他部位的同种肿瘤微环境引起相似的改变。结论溶瘤病毒oHSV2发挥的第一重抗肿瘤作用即相对直接的使肿瘤细胞发生裂解而死亡,在第一重作用的基础上,肿瘤相关抗原（TAAs）伴随着肿瘤细胞的裂解而被释放,从而展现oHSV2治疗带来的第二重作用,即引起机体先天性免疫应答和特异性免疫应答。紧随特异性免疫应答后机体形成了免疫记忆,可有效防止肿瘤的转移和复发。溶瘤病毒oHSV2的应用可以重构小鼠脾脏和肿瘤微环境的免疫状态（包括未经病毒直接治疗的肿瘤）,提示oHSV2的局部治疗模式可以转变为一种全身性的治疗模式。因此,溶瘤病毒oHSV2具有很好的临床应用潜力。
刘怡佳[9]（2020）在《环境响应型自组装纳米药物及抗原-无机杂化微颗粒疫苗用于肿瘤免疫治疗的研究》文中研究指明恶性肿瘤目前仍然是造成人类死亡的主要原因之一,传统肿瘤治疗手段包括手术切除、化疗、放疗等,肿瘤免疫疗法的出现为肿瘤的治疗带来了一场革新。然而,目前的肿瘤免疫疗法仍存在诸多问题,需要对原有的肿瘤免疫疗法进行改进或与其它肿瘤治疗手段联合使用,进一步提高肿瘤免疫治疗的临床疗效和促进其广泛应用。因此,本课题提出构建环境响应型疫苗/药物微纳米递送载体用于肿瘤免疫治疗研究,增强疫苗/药物递送系统的抗肿瘤免疫效应,从而最大限度地利用机体自身的免疫防御能力抑制肿瘤生长。第一部分:设计构建pH响应型有机-无机杂化微颗粒肿瘤疫苗用于小鼠荷瘤模型的抗肿瘤免疫治疗研究:基于模型抗原卵清白蛋白（Ovalbumin,OVA）和硫酸铜（Ⅱ）的有机-无机杂化颗粒疫苗通过自然结晶的方式形成。体外研究结果表明,该蛋白-无机杂化微结构可提高肿瘤疫苗的室温稳定性,有利于疫苗的贮存和运输。该微颗粒疫苗冻干粉在室温下放置一个月后,同-20℃放置的微颗粒疫苗冻干粉相比,具有相同的促进树突状细胞（Dendritic cells,DCs）成熟和活化作用。此外,该特殊结构的疫苗颗粒具有pH响应性,可以实现抗原的胞浆递送,促进MHC-I抗原提呈。E.G7-OVA荷瘤小鼠抗肿瘤研究结果表明,该微颗粒疫苗可以有效抑制肿瘤生长,提高淋巴结内CD8+T淋巴细胞的分化以及脾脏内CD8+T淋巴细胞和抗原特异性T淋巴细胞的比例,并能显着提高荷瘤小鼠血清中细胞因子和抗体的分泌水平。第二部分:设计并构建了基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase,MMP）响应型聚乙二醇/DPPA多肽-阿霉素共负载自组装纳米药物（PEG/DPPA-MMP-DOX NPs）,用于化疗和PD-L1免疫检查点阻断的联合抗肿瘤研究,该纳米药物在肿瘤微环境MMP作用下,可从起始140 nm的大颗粒解组装释放小粒径DOX纳米粒（<30nm）,有效增强DOX纳米粒的肿瘤渗透性。在MMP作用下,释放的DOX纳米粒可以对肿瘤细胞进行杀伤并诱导其发生免疫原性死亡,引发抗肿瘤免疫应答;同时,经MMP响应性连接肽断裂而释放的PD-L1抗体拮抗剂DPPA多肽,可与肿瘤细胞表面的PD-L1受体结合,阻断PD-1/PD-L1免疫检查点抑制通路,进而实现化疗联合免疫检查点阻断的协同抗肿瘤作用。荷瘤小鼠体内抗肿瘤实验结果表明,该纳米药物可以有效抑制肿瘤生长并降低DOX对小鼠的毒副作用,增强CD8+T细胞在肿瘤组织内的比例,并降低调节性T细胞（Regulatory T cells,Tregs）的免疫抑制作用,促进细胞因子干扰素-γ（Interferon,IFN-γ）的产生。此外,该纳米药物介导的化疗联合免疫检查点阻断的抗肿瘤疗法可诱导长期记忆性抗肿瘤免疫反应,有效抑制肿瘤的复发和转移。综上所述,我们构建了两种环境响应型微纳米疫苗/药物递送系统,用于增强肿瘤免疫治疗疗效。一种是在原有肿瘤免疫疗法基础上改进,制备了 pH响应型有机-无机杂化微颗粒肿瘤疫苗,该体系可以提高疫苗的室温稳定性并实现抗原的胞浆递送,促进MHC-Ⅰ抗原提呈从而增强CD8+T淋巴细胞杀伤作用提高抗肿瘤疗效;另一种则是将肿瘤免疫疗法与化疗联合,制备了 MMP响应型PEG/DPPA-MMP-DOX NPs,该纳米药物实现了化疗杀伤与免疫检查点阻断的协同抗肿瘤作用,在增强纳米药物在肿瘤组织中的渗透能力的同时,进一步增强抗肿瘤疗效。
罗勇[10]（2019）在《肿瘤靶向性新型溶瘤单纯疱疹病毒的理性设计及其抗肿瘤作用机制研究》文中研究说明近年来,随着全球老龄化趋势加剧、人口的剧增、社会生活环境的改变等因素使得全球癌症的发病率和死亡率呈快速上升的趋势,全球癌症负担进一步加重。据2018年全球癌症流行病学统计数据显示,2018年全球癌症新发病例高达1810万,死亡病例高达960万。因此,对癌症的早诊、早治和综合干预已成为现阶段全球在癌症防控领域的重要任务。传统的癌症治疗手段,如化疗和放疗等存在副作用大、无法有效控制晚期恶性肿瘤的进展和不能有效改善难治性和广泛转移性癌症患者的生存期和生活质量等问题,因而无法从根本上控制癌症进展。肿瘤分子靶向治疗在肺癌、白血病和黑色素瘤等适应症的部分患者上取得了较大的成功,但分子靶向治疗药物仅对特定基因突变的肿瘤发挥作用而使得获益人群受限,且易产生耐药等问题,导致长期治疗效果不理想,同时由于副作用较大而限制了其临床应用。以 PD-1/PD-L1（Programmed Death 1/Programmed Death-Ligand 1）抑制剂疗法为代表的癌症免疫疗法因其具有良好的安全性和显着的肿瘤治疗效果,已成为当前肿瘤治疗领域最有希望攻克癌症的治疗方式。与传统的癌症治疗手段相比,癌症免疫疗法最突出的优势是疗效较持久,但其疗效受肿瘤微环境中PD-L1表达水平、肿瘤突变负荷、免疫细胞浸润水平、微卫星不稳定性的高低等多重因素影响,导致其对所有肿瘤的客观应答率仅为20%-30%,仍有大部分的肿瘤患者无法从免疫治疗中获益。因此,仍亟需开发新型高效的治疗手段使更多的肿瘤患者能获益。溶瘤病毒疗法是一种利用具有天然溶瘤活性的或经基因工程修饰的病毒选择性地在肿瘤细胞中高效复制并快速裂解肿瘤细胞,且释放的肿瘤相关抗原和损伤相关分子模式等“原位肿瘤疫苗”可有效的启动并活化抗肿瘤疫应答的新型肿瘤免疫治疗的方法。溶瘤病毒疗法相较于其他的肿瘤治疗方法,具有肿瘤选择性复制与杀伤、安全高效、广谱抗肿瘤活性和免疫调节等突出优势,现已成为极具前景的一类肿瘤免疫疗法。临床前基础研究和临床研究结果均表明通过溶瘤病毒局部注射可增加肿瘤组织中免疫细胞的浸润,将“冷”肿瘤转变为“热肿瘤”,协同增加PD-1/PD-L1抑制剂的抗肿瘤疗效。基于溶瘤病毒ImLygic TM的良好抗肿瘤特性,2015年美国FDA首次批准溶瘤病毒药物ImLygicTM（T-VEC）用于局部治疗首次手术切除后复发的恶性黑色素瘤。2018年《新英格兰医学》杂志发表了美国杜克大学开发的脊髓灰质炎溶瘤病毒PVSRIPO在复发性胶质瘤适应症上的I期临床试验结果显示,PVSRIPO治疗晚期胶质母细胞瘤患者的3年存活率为标准治疗的5倍（21%vs.4%）。围绕溶瘤病毒的药物开发和多药联合治疗是目前肿瘤免疫疗法领域内十分具有前景的研究方向之一。本研究是在野生型人I型单纯疱疹病毒（Herpes Simplex Virus type I,HSV-1）KOS株的基础上通过分子遗传学改造而获得的具有肿瘤靶向性的溶瘤病毒OVH,并系统性的完成溶瘤病毒OVH的实验室安全性和药效学研究,并对其治疗机制进行了初步探索。本研究的第一部分旨在理性设计和重组筛选肿瘤靶向性新型溶瘤病毒OVH,并在多种细胞模型上评估OVH的肿瘤选择性和在多种小鼠模型上分别评估OVH的神经毒性和急性毒性。利用同源重组技术在KOS毒株基础上删除病毒主要神经毒力基因γ34.5（编码ICP34.5蛋白）和主要参与激活病毒β和γ基因表达,平衡病毒的潜伏性感染和裂解性感染及诱导病毒免疫逃逸的基因RL2（编码ICP0蛋白）,同时用hTERT启动子调控编码病毒立即早期蛋白ICP27的UL54基因表达,通过差异筛选最终获得具有极低的神经毒性和良好的肿瘤选择性的重组病毒OVH。体内外安全性评价结果均表明OVH相较于野生型病毒KOS、ICP0缺陷病毒dICP0、ICP0和ICP34.5双缺陷病毒OVN具有较好的肿瘤细胞选择性复制与杀伤的特性、显着降低的神经毒性和急性毒性。以上结果提示OVH具有进一步开发为溶瘤病毒药物的潜力,为探索应用低毒高效的溶瘤病毒治疗肿瘤奠定了基础。本研究的第二部分主要为溶瘤病毒OVH体内和体外溶瘤活性评估及机制研究,旨在明确溶瘤病毒OVH的体外溶瘤活性及探明其作用机制。本研究首先在53株人源肿瘤细胞上评估了 OVH的杀伤效果,其中40株肿瘤细胞对OVH超级敏感（将感染复数MOI（MultiplicityofInfection）=1时,OVH对肿瘤细胞的杀伤率超过50%定义为超级敏感型细胞,Hyper-sensitive（HS））,8株细胞株为敏感性细胞株(将感染复数MOI=1时,OVH对肿瘤细胞的杀伤率超过20%但小于50%,定义为敏感型细胞,Sensitive（S）,5株肿瘤细胞株为抵制型细胞株（将感染复数MOI=1时,OVH对肿瘤细胞的杀伤率小于20%,定义为抵制型细胞,Refractory（R））。此外,我们从临床手术切除的肿瘤标本中分离培养获得原代肝癌细胞、原代胶质瘤细胞和原代卵巢癌细胞。三株原代肿瘤细胞均为对OVH超级敏感型细胞。以上体外肿瘤细胞杀伤实验结果表明,OVH具有广谱的体外抗肿瘤活性。我们研究发现OVH感染肿瘤细胞后会诱导细胞凋亡并引起免疫原性细胞死亡（ATP和HMGB1胞外释放增加、钙网蛋白膜转位等）,提示OVH通过裂解肿瘤细胞可能会产生“原位肿瘤疫苗”,从而诱导系统性的抗肿瘤免疫应答。体内药效学结果显示,OVH瘤内注射治疗能显着抑制免疫缺陷鼠上7种人源肿瘤细胞移植瘤的生长和免疫健全小鼠上3种鼠源肿瘤细胞移植瘤的生长。在免疫系统健全的小鼠皮下移植瘤治疗模型中,OVH单侧治疗可以显着抑制甚至大部分的清除治疗侧和远端侧的肿瘤。以上体内药效学研究结果表明,溶瘤病毒OVH具有显着的体内溶瘤活性,且瘤内注射OVH能诱导全身性的抗肿瘤免疫反应抑制治疗侧和远端侧肿瘤的生长。我们进一步的研究发现,经OVH治愈的荷瘤小鼠未出现肿瘤复发,并可以有效防止相同肿瘤细胞的二次攻击。蛋白免疫印迹分析显示经OVH治愈的荷瘤小鼠的多抗血清与相同肿瘤细胞来源的细胞裂解液之间存在特异性反应,将这部分血清回输到接种了相同肿瘤细胞的荷瘤鼠上发现多抗血清具有良好的抑瘤效果,而特异性去除多抗的血清则没有治疗效果。上述结果显示,经过OVH治愈的小鼠体内产生了肿瘤特异性抗体。通过对治疗侧和远端侧肿瘤组织中的免疫细胞亚群分析发现,OVH的治疗可显着增加治疗侧和远端侧肿瘤组织中免疫细胞的浸润,包括上调和活化肿瘤组织中的CD8+T细胞,下调调节性T细胞的浸润水平等。体内抗体急性阻断免疫细胞的实验结果显示,OVH治疗的疗效主要依赖于CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫,B细胞、NK细胞和巨噬细胞等其他免疫细胞发挥了一定的抗肿瘤作用。联合PD-1抗体能进一步的提高溶瘤病毒OVH的抗肿瘤疗效,且该联合治疗的疗效也是主要依赖于CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫。综上所述,本研究设计的溶瘤病毒OVH为γ34.5和RL2双基因缺失,同时用hTERT启动子调控编码病毒立即早期蛋白ICP27的UL54基因表达,具有良好的肿瘤选择性和安全性的溶瘤病毒。OVH体外对肿瘤细胞具有广谱的溶瘤活性,在多种小鼠肿瘤模型中均可显着抑制甚至清除小鼠治疗侧和远端侧皮下肿瘤。瘤内注射溶瘤病毒OVH治疗可重编程肿瘤免疫微环境,激活机体的抗肿瘤体液免疫应答和细胞免疫应答,宿主抗肿瘤免疫应答与溶瘤病毒介导的直接抗肿瘤作用相互协同,最终达到溶瘤治疗和免疫治疗叠加的双重抗肿瘤效果。更重要的是,我们发现联合PD-1抗体治疗能进一步的提高溶瘤病毒OVH的抗肿瘤效果。本研究开发的肿瘤靶向性新型溶瘤病毒OVH具有安全性、高效、广谱的抗肿瘤活性,为开发可用于恶性肿瘤治疗的溶瘤病毒创新药物奠定了基础。
二、GM-CSF基因修饰的肿瘤细胞疫苗对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、GM-CSF基因修饰的肿瘤细胞疫苗对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用（论文提纲范文）
（1）IL-33修饰的黑色素瘤干细胞疫苗抗肿瘤及免疫机制研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 黑色素瘤 |
| 1.1.1 流行病学 |
| 1.1.2 治疗现状 |
| 1.1.3 免疫治疗 |
| 1.2 肿瘤干细胞 |
| 1.2.1 肿瘤干细胞一般特征 |
| 1.2.2 黑色素瘤中的肿瘤干细胞研究 |
| 1.2.3 肿瘤干细胞——肿瘤免疫治疗的新靶点 |
| 1.2.4 肿瘤干细胞疫苗——靶向肿瘤干细胞免疫治疗 |
| 1.2.5 靶向肿瘤干细胞多种免疫治疗潜在机制 |
| 1.2.6 肿瘤干细胞疫苗潜在的抗肿瘤免疫机制 |
| 1.2.6.1 树突状细胞的作用 |
| 1.2.6.2 抗肿瘤特异性T细胞的作用 |
| 1.3 IL-33 |
| 1.3.1 IL-33 的免疫调节作用 |
| 1.3.2 IL-33 在肿瘤免疫中的作用 |
| 1.3.2.1 IL-33 对DCs的作用 |
| 1.3.2.2 IL-33 对CD8~+T细胞的作用 |
| 1.3.2.3 IL-33 在肿瘤疫苗中的潜在作用 |
| 1.3.3 IL-33 在黑色素瘤中的研究 |
| 第2章 研究方案 |
| 2.1 黑色素瘤干细胞疫苗的制备 |
| 2.2 黑色素瘤干细胞疫苗诱导抗肿瘤效果评价 |
| 2.3 黑色素瘤干细胞疫苗诱导抗肿瘤免疫机制的研究 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要试剂的配制 |
| 3.1.3 主要实验仪器 |
| 3.1.4 实验动物 |
| 3.1.5 实验相关细胞株 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞复苏、培养及冻存 |
| 3.2.2 利用免疫磁珠技术分选细胞 |
| 3.2.3 测定细胞克隆形成能力 |
| 3.2.4 总RNA的提取与逆转录 |
| 3.2.5 实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-q PCR)检测细胞的干性 |
| 3.2.6 流式细胞术测定细胞表面MHC I的表达 |
| 3.2.7 IL-33 过表达基因腺病毒感染B16F10-CD44~+CD133~+ |
| 3.2.8 肿瘤细胞灭活及细胞灭活后鉴定 |
| 3.2.9 酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbentassay,ELISA)测定IL-33 的表达 |
| 3.2.10 建立预防性动物模型 |
| 3.2.11 肿瘤病理组织学检测 |
| 3.2.12 DCs的诱导及鉴定 |
| 3.2.13 检测疫苗促DCs成熟能力 |
| 3.2.14 小鼠脾脏淋巴细胞的分离及脾脏中CD8~+T细胞比例及活性测定 |
| 3.2.15 小鼠脾脏淋巴细胞CFSE染色 |
| 3.2.16 检测疫苗对DCs激活CD8~+T细胞能力的影响 |
| 3.2.17 测定疫苗对CD8~+T细胞免疫检查点及CD8~+记忆性T细胞的影响 |
| 3.2.18 检测疫苗对CD8~+T细胞抗肿瘤效应分子的影响 |
| 3.2.19 测定小鼠脾淋巴细胞的杀伤能力 |
| 3.2.20 测定黑色素瘤组织细胞中CD44,CD133的表达 |
| 3.2.21 检测小鼠血清细胞因子水平 |
| 3.2.22 统计学分析 |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 黑色素瘤干细胞疫苗的制备 |
| 4.1.1 B16F10-CD44~+CD133~+黑色素瘤干细胞的鉴定 |
| 4.1.2 IL-33 过表达基因腺病毒感染B16F10-CD44~+CD133~+细胞 |
| 4.1.3 黑色素瘤干细胞的灭活 |
| 4.1.4 B16F10-IL-33 CD44~+CD133~+细胞灭活后鉴定及抗肿瘤疫苗制备 |
| 4.2 黑色素瘤干细胞疫苗诱导抗肿瘤效果评价 |
| 4.2.1 疫苗对荷瘤小鼠肿瘤大小的影响 |
| 4.2.2 疫苗对小鼠肺转移的影响 |
| 4.2.3 荷瘤小鼠肿瘤组织病理学及免疫组织化学分析 |
| 4.2.4 小鼠生存期分析 |
| 4.3 黑色素瘤干细胞疫苗诱导抗肿瘤免疫机制的研究 |
| 4.3.1 疫苗促进小鼠骨髓来源的DCs成熟 |
| 4.3.2 疫苗增强DCs刺激CD8~+T细胞增殖的能力 |
| 4.3.3 疫苗增强DCs启动CD8~+T细胞的能力 |
| 4.3.4 疫苗对小鼠脾脏中CD8~+T细胞比例及活性的影响 |
| 4.3.5 疫苗降低CD8~+T细胞免疫检查点的表达 |
| 4.3.6 疫苗诱导脾脏CD8~+中心记忆性T细胞的形成 |
| 4.3.7 疫苗增加脾脏CD8~+T细胞抗肿瘤效应分子的表达 |
| 4.3.8 疫苗增强小鼠脾淋巴细胞的杀伤能力 |
| 4.3.9 疫苗降低荷瘤小鼠肿瘤组织细胞CD44和CD133的表达 |
| 4.3.10 疫苗对荷瘤小鼠肿瘤组织细胞MHC I表达的影响 |
| 4.3.11 疫苗促进小鼠血清抗肿瘤细胞因子的分泌 |
| 4.3.12 疫苗增加小鼠肿瘤组织CD8~+T细胞的浸润 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）诱导型表达GSDMD-NT引起细胞焦亡的肿瘤细胞疫苗新策略（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1. 肿瘤发生发展的多样性及其免疫逃逸机制 |
| 2. 肿瘤免疫治疗具有极好的临床应用前景 |
| 3. 疫原性细胞死亡的抗肿瘤作用机制及研究进展 |
| 4. 细胞焦亡 |
| 4.1 细胞焦亡的发生发展 |
| 4.2 细胞焦亡的发生机制及其与肿瘤的密切关系 |
| 4.3 细胞焦亡在抗肿瘤免疫治疗中的研究 |
| 5. 本研究思路,目的及意义 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 质粒、菌株、细胞株 |
| 1.2 动物 |
| 2. 实验试剂及仪器设备 |
| 2.1 试剂盒 |
| 2.2 酶、抗体 |
| 2.3 引物及序列合成 |
| 2.4 相关试剂及耗材 |
| 2.5 主要仪器及设备 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1 重组质粒plvx-Teton-GSDMD-NT/eGFP-puro的构建 |
| 3.2 细胞培养 |
| 3.3 plvx-Teton-GSDMD-NT/eGFP-puro重组质粒瞬转表达鉴定 |
| 3.4 纯化收集慢病毒 |
| 3.5 诱导型稳定表达GSDMD-NT的TC-1/CT26/4T1细胞系的筛选鉴定 |
| 3.6 诱导型稳定表达GSDMD-NT的TC-1/CT26/4T1肿瘤细胞的增殖情况 |
| 3.7 诱导型稳定表达GSDMD-NT的TC-1/CT26/4T1肿瘤细胞焦亡形态观察 |
| 3.8 免疫荧光检测TC-1肿瘤细胞焦亡时GSDMD-NT的表达与定位 |
| 3.9 诱导型稳定表达GSDMD-NT的TC-1/CT26/4T1肿瘤细胞焦亡流式检测 |
| 3.10 诱导型稳定表达GSDMD-NT的TC-1/CT26/4T1肿瘤细胞焦亡免疫原性介质表达与释放的检测 |
| 3.11 建立小鼠皮下移植瘤模型 |
| 3.12 建立小鼠脂肪垫原位乳腺癌肿瘤模型 |
| 3.13 获取骨髓来源的树突状细胞 |
| 3.14 新型焦亡肿瘤细胞疫苗对BMDC的趋化作用 |
| 3.15 新型焦亡肿瘤细胞疫苗促进BMDC的成熟 |
| 3.16 小鼠体内诱导已成瘤的TC-1-GSDMD-NT肿瘤细胞焦亡 |
| 3.17 新型焦亡肿瘤细胞疫苗对小鼠宫颈癌移植瘤的预防效果 |
| 3.18 瘤内注射新型焦亡肿瘤细胞疫苗对宫颈癌移植瘤的生长影响 |
| 3.19 小鼠体内诱导已成瘤的CT26及4T1肿瘤细胞焦亡 |
| 3.20 体外分离小鼠脾脏淋巴细胞 |
| 3.21 体外分离小鼠肿瘤淋巴细胞 |
| 3.22 流式细胞术检测CTL细胞水平 |
| 3.23 流式细胞检测MDSC水平 |
| 4. 流式抗体剂量表 |
| 5. Real time qPCR引物序列表 |
| 结果 |
| 1. 诱导型稳定表达GSDMD-NT/eGFP肿瘤细胞系的筛选与鉴定 |
| 1.1 plvx-Teton-GSDMD-NT/eGFP-puro重组质粒的构建与鉴定 |
| 1.2 plvx-Teton-GSDMD-NT/eGFP-puro重组质粒瞬时表达的功能鉴定 |
| 1.3 筛选鉴定GSDMD-NT/eGFP诱导型稳定表达的肿瘤细胞系 |
| 2. 诱导型稳定表达GSDMD-NT/eGFP肿瘤细胞系的生物学特性 |
| 2.1 生长特性 |
| 2.2 诱导GSDMD-NT稳定表达导致肿瘤细胞焦亡 |
| 2.3 诱导肿瘤细胞焦亡LDH的释放 |
| 3. 诱导型稳定表达GSDMD-NT肿瘤细胞系的免疫学特性 |
| 3.1 免疫原性物质HMGB1、LC3bⅠ/Ⅱ的释放与表达 |
| 3.2 免疫原性物质ATP的释放 |
| 3.3 免疫原性物质Hsp70/90,PD-L1,CXCL9,H-2K~b的表达 |
| 3.4 炎性细胞因子IL-1β、IL-18、IL-6、IL-33的释放 |
| 4. 焦亡的肿瘤细胞促进BMDCs的迁移成熟 |
| 4.1 焦亡的肿瘤细胞上清促进BMDCs的迁移 |
| 4.2 焦亡的肿瘤细胞上清促进BMDCs的成熟 |
| 4.3 焦亡的肿瘤细胞促进BMDCs的成熟 |
| 5. 新型焦亡肿瘤细胞疫苗具有良好的抗肿瘤潜力并具有免疫保护效果 |
| 5.1 小鼠体内诱导已成瘤的TC-1-GSDMD-NT肿瘤细胞焦亡 |
| 5.2 小鼠体内诱导未成瘤的TC-1-GSDMD-NT肿瘤细胞焦亡 |
| 6. 新型焦亡肿瘤细胞疫苗激发强效的抗肿瘤免疫应答效应 |
| 6.1 瘤内注射新型焦亡肿瘤细胞疫苗显着抑制已建立的TC-1肿瘤生长 |
| 6.2 瘤内注射新型焦亡肿瘤细胞疫苗激发强效的抗肿瘤免疫应答效应 |
| 7. 新型焦亡肿瘤细胞疫苗抗肿瘤的普适性研究 |
| 7.1 新型焦亡肿瘤细胞疫苗抑制CT26移植瘤及4T1原位肿瘤的生长 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 免疫原性死亡在肿瘤治疗中的作用与应用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（3）黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备 |
| 材料和方法 |
| 1.标本来源 |
| 2.材料及试剂 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1. MUC1在人乳腺癌组织中表达情况 |
| 2.MUC1在乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞中的表达 |
| 3.过表达MUC1慢病毒质粒的构建结果 |
| 4.分离培养DC的形态学特征及表型分子表达 |
| 5.转染效率测定 |
| 6.MUC1-DC中MUC1 mRNA和蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MUC1-DC免疫功能的体外研究 |
| 材料和方法 |
| 1.试剂与仪器 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.MCU1-DC诱导CTL条件的优化 |
| 2.MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-ɑ的含量 |
| 3.MUC1-DC对CTL杀伤活性的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用 |
| 材料和方法 |
| 1.动物来源 |
| 2.试剂与仪器 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.慢病毒转染条件优化 |
| 2.光学分子成像活体检测MUC1-DC对裸鼠乳腺癌移植瘤的抑制作用 |
| 3. MUC1-DC对裸鼠移植瘤体积和重量的影响 |
| 4.MUC1-DC对裸鼠移植瘤Caspase3表达的影响 |
| 5.TUNEL法检测裸鼠移植瘤中的细胞凋亡率 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 基因修饰的树突状细胞在抗肿瘤免疫中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 博士在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（4）转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用（论文提纲范文）
| 提要 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 文章缩略词表 |
| 引言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 TGF-β的概述 |
| 1.1.1 TGF-β的来源 |
| 1.1.2 TGF-β的表达 |
| 1.1.3 TGF-β的结构 |
| 1.1.4 TGF-β的信号通路 |
| 1.2 TGF-β的生物学活性 |
| 1.2.1 TGF-β对胚胎发育的调节 |
| 1.2.2 TGF-β对免疫应答的负向调节 |
| 1.2.3 TGF-β2对肿瘤的生长,侵袭及迁移的促进作用 |
| 1.2.4 TGF-β对组织损伤修复、创面愈合、瘢痕增生的促进作用及炎症反应的抑制作用 |
| 1.2.5 TGF-β2对纤维化的调节作用 |
| 1.2.6 TGF-β对肿瘤的抑制作用 |
| 1.3 靶向TGF-β2的药物 |
| 1.3.1 TGF-β2的反义寡核苷酸 |
| 1.3.2 TGF-β2的micro RNA |
| 1.3.3 TGF-β2的sh RNA |
| 1.3.4 TGF-β2的抗体 |
| 1.3.5 TGF-β2的反义基因修饰的同种异体肿瘤疫苗 |
| 1.3.6 TGF-β2的反义基因修饰的同种异体肿瘤疫苗 |
| 1.3.7 TGF-β2的抑制剂 |
| 1.4 疫苗佐剂的概述及其研究进展 |
| 1.4.1 增强第一信号的佐剂 |
| 1.4.2 增强第二信号的佐剂 |
| 1.4.3 增强第三信号的佐剂 |
| 1.4.4 抑制T细胞抑制信号的佐剂 |
| 1.4.5 改善肿瘤免疫抑制微环境的佐剂 |
| 1.4.6 病毒载体佐剂 |
| 1.4.7 其他佐剂 |
| 1.4.8 多佐剂肿瘤疫苗 |
| 1.4.9 佐剂的接种途径 |
| 1.4.10 佐剂发挥作用的机制 |
| 1.5 RNA靶向性寡核苷酸的研究进展 |
| 1.5.1 反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide) |
| 1.5.2 siRNA |
| 1.5.3 micro RNA |
| 1.5.4 反义寡核苷酸的化学修饰方法 |
| 第2章 材料方法 |
| 2.1 ODN及引物 |
| 2.2 实验试剂,仪器与耗材 |
| 2.3 细胞与细胞系 |
| 2.4 实验动物 |
| 2.5 IAV的扩增 |
| 2.6 IAV TCID50 的测定 |
| 2.7 IAV血凝效价的测定 |
| 2.8 聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 2.9 小鼠PBMC、脾脏及淋巴结单细胞悬液的制备 |
| 2.10 TIO对 TGF-β2 m RNA表达的抑制实验 |
| 2.11 流式细胞术(Flow cytometry) |
| 2.12 蛋白免疫印迹实验(Western Blotting analysis) |
| 2.13 免疫荧光技术 |
| 2.14 TIO在小鼠器官和组织中的分布检测 |
| 2.15 小鼠的免疫 |
| 2.15.1 疫苗的制备 |
| 2.15.2 小鼠的免疫和血清的收集 |
| 2.16 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.17 流感病毒攻毒实验 |
| 2.18 小鼠肺组织的病理学观察 |
| 2.19 脑胶质瘤细胞裂解物(TCL)的制备 |
| 2.20 GL261脑胶质瘤原位模型的建立 |
| 2.21 脑胶质瘤预防模型的建立 |
| 2.22 脑胶质瘤治疗模型的建立 |
| 2.23 肿瘤周围浸润的炎性细胞的检测 |
| 2.24 肿瘤组织病理分析 |
| 2.25 胃癌背部移植瘤模型的建立 |
| 2.26 统计学分析 |
| 第3章 研究结果 |
| 3.1 靶向TGF-β2的反义寡核苷酸的设计与筛选 |
| 3.2 TIOs对 RAW264.7 细胞,U-937 细胞及CAL-1 细胞表达TGF-β2的影响 |
| 3.2.1 TIOs对 IL-4 诱导的RAW264.7 细胞TGF-β2 m RNA表达的影响 |
| 3.2.2 TIOs对 IL-4诱导的RAW264.7细胞Arg1及TNF-αmRNA表达的影响 |
| 3.2.3 TIOs对 LPS诱导的RAW264.7 细胞TGF-β2 mRNA表达的影响 |
| 3.2.4 TIOs对 LPS诱导的U-937 细胞表达TGF-β2 mRNA的影响 |
| 3.2.5 TIOs对甲型流感病毒(IAV)诱导的CAL-1 细胞TGF-β2mRNA表达的影响 |
| 3.2.6 TIOs对 IL-4/LPS诱导的RAW264.7/U-937细胞表达TGF-β2蛋白的影响 |
| 3.3 TIO3在细胞和组织中的分布 |
| 3.4 TIOs的微生物疫苗佐剂效应 |
| 3.4.1 TIOs对微生物疫苗诱导的抗体产生水平的影响 |
| 3.4.2 TIO3对流感病毒疫苗诱导的抗流感病毒效率的增强作用 |
| 3.4.3 TIO1和TIO3 的微生物疫苗佐剂效应的可能机制 |
| 3.4.4 TIOs的微生物疫苗佐剂的安全性评价 |
| 3.5 TIO的胶质瘤疫苗的佐剂作用 |
| 3.5.1 TIOs为佐剂的胶质瘤细胞裂解物疫苗对原位接种脑胶质瘤预防模型小鼠的影响 |
| 3.5.2 TIOs为佐剂的胶质瘤疫苗对原位接种胶质瘤治疗模型小鼠生存期的影响 |
| 3.6 单独应用TIO3的抗胶质瘤及抗胃癌作用 |
| 3.6.1 单独应用TIO3对脑胶质瘤原位移植瘤模型小鼠生存期的影响 |
| 3.6.2 单独应用TIO3对胃癌背部移植瘤模型小鼠体重、肿瘤大小及生存期的影响 |
| 3.6.3 单独应用TIO3对胃癌细胞腹腔种植模型小鼠生存期的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 TIOs的微生物疫苗佐剂效应 |
| 4.1.1 TIO3对CD4~+T细胞表面s TGF-β2 表达的抑制作用 |
| 4.1.2 TIO3 对 CD19~+ B 细胞表面 sTGF-β2 表达的抑制作用 |
| 4.1.3 TIO3的药效动力学分析 |
| 4.1.4 TIO1,TIO2及TIO3 的不同功效的机理分析 |
| 4.1.5 TIO3用于微生物疫苗佐剂的副作用分析 |
| 4.1.6 TIO3用于微生物疫苗佐剂的可行性分析 |
| 4.2 TIO3的胶质瘤疫苗佐剂效应 |
| 4.2.1 TIO3 对胶质瘤细胞MHC I分子表达的上调作用 |
| 4.2.2 TIO3的胶质瘤疫苗佐剂效应的机理分析 |
| 4.3 单独应用TIO3的抗胶质瘤和抗胃癌作用 |
| 4.4 总结和展望 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 附录1 |
| 附录2 The College of Basic Medical Sciences of Jilin University Ethics Committee Approval Form |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）半细菌化类鼻疽杆菌载体制备LL/2肺癌疫苗及其抗肿瘤效应研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 一、实验材料、试剂及仪器 |
| 1.1 实验对象动物 |
| 1.2 实验材料、试剂 |
| 1.3 主要实验耗材仪器设备 |
| 1.4 CpG序列 |
| 1.5 试剂溶液配置 |
| 二、实验方法 |
| 2.1 LL/2 肿瘤裂解物制备 |
| 2.2 半细菌疫苗骨架制备 |
| 2.3 LL/2 肿瘤裂解物半细菌疫苗(SB-LC)制备 |
| 2.4 LL/2 肿瘤裂解物半细菌疫苗(SB-LC)体外对DC成熟、活化影响 |
| 2.5 ELISA法 |
| 2.6 流式细胞术 |
| 2.7 免疫接种实验分组 |
| 2.8 荷瘤小鼠模型建立 |
| 2.9 肿瘤疫苗治疗性实验组研究 |
| 2.10 肿瘤疫苗预防性实验组研究 |
| 2.11 细胞毒实验CTL诱导杀伤反应 |
| 2.12 Western Blot检测 |
| 2.13 酶联免疫斑点实验ELISPOT |
| 2.14 LL/2 动物模型肿瘤浸润淋巴细胞表型分析 |
| 2.15 统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 1.半细菌骨架及LL/2 肿瘤裂解物半细菌疫苗制备/表征 |
| 2.SB-LC疫苗处理诱导BMDC成熟及活化 |
| 3.SB-LC疫苗在治疗性实验组中对小鼠LL/2 肿瘤生长影响 |
| 4.SB-LC疫苗在预防组模型中对小鼠LL/2 肿瘤生长影响 |
| 5.SB-LC疫苗在LL/2 模型中诱导肿瘤细胞特异的CTL细胞毒反应 |
| 6.SB-LC疫苗对体液免疫反应影响 |
| 7.SB-LC疫苗处理组荷瘤小鼠免疫抑制微环境的改变 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肿瘤免疫治疗策略方法研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 附录 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（6）人参皂甙Rg3增强致敏DC诱导CTL影响小鼠肾癌细胞RAG的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩写一览表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 人参皂甙Rg3对树突状细胞的影响 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 试剂与配制 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 Rg3对DC的刺激作用 |
| 2.2.3.1 DC 的培养 |
| 2.2.3.2 DC的形态学观察 |
| 2.2.3.3 FCM检测DC表面分子的表达 |
| 2.2.4 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Rg3对DC形态学变化的影响 |
| 2.3.2 FCM检测Rg3 能够促进DC成熟 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 Rg3-DC对小鼠肾癌细胞RAG的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞来源 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 RAG抗原致敏的Rg3-DC疫苗制备 |
| 3.2.3 CTL细胞对体外培养RAG细胞的抑制作用 |
| 3.2.4 统计学分析 |
| 3.2.8 技术路线图 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 抗原致敏的Rg3-DC对 CTL细胞有增殖作用 |
| 3.3.2 抗原致敏的Rg3-DC能使CTL细胞免疫功能增强 |
| 3.3.3 CTL对体外培养的RAG细胞有杀伤作用 |
| 3.3.4 CTL对 RAG细胞的转移、侵袭有抑制作用 |
| 3.3.5 CTL可调控RAG细胞中相关凋亡蛋白Bax、Bcl-2 的表达 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（7）柯萨奇病毒溶瘤作用和抗原检测试剂研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 |
| 1.前言 |
| 1.1 溶瘤病毒研究概况 |
| 1.2 主要机制和类型 |
| 1.3 机遇和挑战 |
| 1.4 肠道病毒溶瘤作用概况 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 溶瘤柯萨奇病毒在细胞水平的筛选和验证 |
| 3.1.1 溶瘤柯萨奇病毒在细胞水平的筛选 |
| 3.1.2 细胞水平溶瘤作用的进一步证实 |
| 3.1.3 CAR及 DAF的表达情况 |
| 3.2 柯萨奇病毒B组5型对肺癌荷瘤小鼠的治疗效果评价 |
| 3.2.1 动物模型的建立 |
| 3.2.2 肿瘤早期的溶瘤治疗 |
| 3.2.3 肿瘤早期和肿瘤中晚期不同针次的溶瘤治疗 |
| 3.2.4 远端靶向治疗效果评价 |
| 3.2.5 联合GM-CSF的疗效评价 |
| 3.2.6 组织病理学结果 |
| 3.3 柯萨奇病毒B组5型溶瘤机制的相关研究 |
| 3.3.1 凋亡通路 |
| 3.3.2 信号通路抑制剂的筛选 |
| 3.3.3 PKB通路 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 |
| 1.前言 |
| 1.1 柯萨奇病毒A组16型的病原学和流行病学 |
| 1.2 柯萨奇病毒A组16型疫苗研究进展 |
| 1.3 柯萨奇病毒A组16型抗原定量检测方法的研究进展及重要意义 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 方法的建立 |
| 3.1.1 单克隆抗体筛选和评价 |
| 3.1.2 多克隆抗体的评价 |
| 3.1.3 反应条件的优化 |
| 3.2 方法的验证 |
| 3.2.1 特异性 |
| 3.2.2 线性范围 |
| 3.2.3 准确度 |
| 3.2.4 精密度 |
| 3.2.5 耐用性 |
| 3.3 适用性研究 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 综述 |
| 肠道病毒溶瘤作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 柯萨奇病毒A组16型疫苗及抗原定量检测方法研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历及发表文章目录 |
| 致谢 |
| 附件 |
（8）溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒对小鼠结肠癌模型免疫状态及肿瘤微环境影响的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 1. 实验所用细胞系 |
| 2. 实验动物及饲养条件 |
| 3. 实验所用病毒株 |
| 4. 实验所用药物 |
| 5. 实验所用主要试剂 |
| 6. 实验用试剂和溶液配制 |
| 7. 主要耗材和仪器设备 |
| 二、实验方法 |
| 1. 细胞培养相关实验 |
| 2. CCK-8细胞增殖检测实验 |
| 3. 动物模型的建立和治疗流程 |
| 4. 检测oHSV2治疗引起的特异性杀伤作用(CFSE-PI法检测细胞毒) |
| 5. 对小鼠脾脏淋巴细胞表型进行流式检测分析 |
| 6. 病理组织学切片的制备 |
| 7. 肿瘤组织RNA的提取与完整性鉴定 |
| 8. 转录组测序(RNA-Seq) |
| 9. 生物信息学分析 |
| 10. 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1. 溶瘤病毒oHSV2和化疗药物顺铂(DDP)均能有效降低CT26细胞的活力 |
| 2. 溶瘤病毒oHSV2对单侧荷瘤模型治疗效果的初步评价 |
| 3. 溶瘤病毒oHSV2治疗引起系统性的长期的抗肿瘤特异性免疫应答 |
| 4. 适应性免疫（特异性免疫）在溶瘤病毒OHSV2发挥作用的过程中起到重要作用 |
| 5. 溶瘤病毒oHSV2的应用可以增强小鼠脾脏的正向免疫 |
| 6. 溶瘤病毒oHSV2的应用可以有效改善肿瘤微环境的免疫状态 |
| 7. 溶瘤病毒oHSV2治疗可以引起肿瘤微环境中免疫相关基因的差异性表达 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 博士学位期间发表论文 |
| 文献综述 溶瘤病毒抗肿瘤免疫机制及其对肿瘤微环境的影响 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）环境响应型自组装纳米药物及抗原-无机杂化微颗粒疫苗用于肿瘤免疫治疗的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 肿瘤免疫疗法 |
| 1.1 肿瘤疫苗 |
| 1.1.1 细胞性疫苗 |
| 1.1.2 多肽疫苗 |
| 1.1.3 核酸疫苗 |
| 1.2 免疫检查点阻断 |
| 1.2.1 CTLA-4免疫检查点 |
| 1.2.2 PD-1/PD-L1免疫检查点 |
| 1.2.3 其他免疫检查点 |
| 1.3 过继性免疫细胞治疗 |
| 1.4 细胞因子疗法 |
| 1.5 小分子药物 |
| 1.6 免疫联合治疗 |
| 2 环境响应型纳米递药系统在肿瘤免疫治疗中的应用 |
| 2.1 纳米药物递送及其优势 |
| 2.2 环境响应型纳米递送系统 |
| 2.2.1 酸环境响应型 |
| 2.2.2 酶环境响应型 |
| 2.2.3 氧化还原环境响应型 |
| 2.2.4 多重响应型 |
| 3 课题提出 |
| 参考文献 |
| 第二章 pH响应型抗原-无机杂化微颗粒疫苗构建及抗肿瘤免疫效果评价 |
| 1 前言 |
| 2 实验仪器与材料 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验动物 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 OVA-Cu-HVs的制备和表征 |
| 3.2 OVA-Cu-HVs的pH响应性 |
| 3.3 OVA-Cu-HVs的细胞内摄取和分布 |
| 3.4 OVA-Cu-HVs促进BMDCs活化 |
| 3.5 BMDCs中活性氧的含量测定 |
| 3.6 室温下OVA-Cu-HVs的稳定性考察 |
| 3.7 OVA-Cu-HVs体内DCs促成熟作用研究 |
| 3.8 OVA-Cu-HVs的体内抗肿瘤效果 |
| 4 数据分析 |
| 5 实验结果与讨论 |
| 5.1 OVA-Cu-HVs的制备和表征 |
| 5.2 OVA-Cu-HVs的DC摄取和细胞内分布 |
| 5.3 OVA-Cu-HVs体外DCs促成熟作用 |
| 5.4 OVA-Cu-HVs的室温稳定性评价 |
| 5.5 OVA-Cu-HVs体内DCs促成熟作用 |
| 5.6 OVA-Cu-HVs体内抗肿瘤治疗效果 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 MMP响应型纳米药物介导的化疗联合免疫检查点阻断抗肿瘤治疗的研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验仪器与材料 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 纳米药物的制备与表征 |
| 3.2 体外细胞摄取、细胞毒性以及诱导免疫原性细胞死亡研究 |
| 3.3 纳米药物在B16-F10多细胞球体的体外渗透研究 |
| 3.4 肿瘤内蓄积、渗透以及药代动力学研究 |
| 3.5 PEG/~DPPA-MMP-DOX NPs的体内抗肿瘤效应和免疫记忆效应 |
| 4 统计分析 |
| 5 实验结果与讨论 |
| 5.1 纳米药物的制备与表征 |
| 5.2 细胞摄取,细胞毒性以及体外诱导的免疫原性细胞死亡 |
| 5.3 纳米药物在B16-F10多细胞球体中的渗透 |
| 5.4 纳米药物在体内肿瘤组织的蓄积、渗透及药代动力学研究 |
| 5.5 PEG/~DPPA-MMP-DOX NPs的体内抗肿瘤效应和免疫记忆效应 |
| 6 结沦 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文章发表情况 |
| 致谢 |
（10）肿瘤靶向性新型溶瘤单纯疱疹病毒的理性设计及其抗肿瘤作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 全球癌症流行病学概况 |
| 1.2 全球癌症经济负担概况 |
| 1.3 全球癌症危险因素 |
| 1.4 癌症的传统治疗方法 |
| 1.5 癌症的靶向疗法 |
| 1.6 癌症免疫疗法概述及研究进展 |
| 1.6.1 靶向CTLA-4信号通路的癌症免疫疗法研究进展 |
| 1.6.2 靶向PD-1/PD-L1信号通路的癌症免疫疗法研究进展 |
| 1.6.3 溶瘤病毒免疫疗法概述 |
| 1.7 本研究的目的、意义及研究思路 |
| 1.7.1 研究目的和意义 |
| 1.7.2 本研究的思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第一节 材料 |
| 1.1 本研究中使用的主要仪器和设备 |
| 1.2 本研究中所用的主要耗材 |
| 1.3 本研究中所用的细胞株 |
| 1.4 本研究中所用的实验动物 |
| 1.5 本研究中所用病毒株 |
| 1.6 分子克隆相关试剂 |
| 1.7 细胞培养相关试剂 |
| 1.8 病毒实验相关试剂 |
| 1.9 免疫学相关抗体及试剂 |
| 1.10 临床标本 |
| 1.11 研究所需试剂配制 |
| 第二节 研究方法 |
| 2.1 分子克隆实验方法 |
| 2.2 哺乳动物细胞培养方法 |
| 2.3 细胞冻存 |
| 2.4 血球计数板细胞计数 |
| 2.5 全自动细胞计数仪细胞计数 |
| 2.6 哺乳动物细胞转染 |
| 2.7 病毒体外培养和扩增 |
| 2.8 病毒滴定测定 |
| 2.9 溶瘤病毒体外细胞杀伤活性评估实验 |
| 2.10 溶瘤病毒体外复制效率实验 |
| 2.11 更昔洛韦对HSV-1病毒体外复制抑制性实验 |
| 2.12 病毒关键蛋白的鉴定实验 |
| 2.13 溶瘤病毒体外诱导免疫原性细胞死亡的实验方法 |
| 2.14 溶瘤病毒体内安全性评价实验方法 |
| 2.15 小鼠肿瘤模型上评估溶瘤病毒疗效和机制研究实验方法 |
| 2.16 溶瘤病毒OVH联合PD-1抗体治疗肿瘤的疗效评估 |
| 2.17 数据处理及统计学分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分: 具有肿瘤选择性复制与杀伤的溶瘤病毒OVH的构建、性质鉴定和安全性评估 |
| 第一节 溶瘤病毒OVH的构建和性质鉴定 |
| 1.1 溶瘤病毒OVH的构建 |
| 1.2 四种病毒感染U-2OS细胞的病变特征 |
| 1.3 四种病毒在U-2OS细胞上形成的病毒空斑大小比较 |
| 1.4 四种病毒在U-2OS细胞上的增殖和关键病毒蛋白的检定 |
| 1.5 溶瘤病毒OVH的肿瘤选择性评估 |
| 第二节. 溶瘤病毒OVH的安全性评估 |
| 2.1 溶瘤病毒OVH维持对抗疱疹病毒药物的敏感性 |
| 2.2 溶瘤病毒OVH的神经毒性显着降低 |
| 2.3 溶瘤病毒OVH的急性毒性显着降低 |
| 第一部分 小结 |
| 第二部分: 溶瘤病毒OVH体内和体外溶瘤活性评估及机制研究 |
| 第一节 溶瘤病毒OVH的体外溶瘤活性评估和体外溶瘤机制研究 |
| 1.1 溶瘤病毒OVH具有广谱抗肿瘤作用 |
| 1.2 溶瘤病毒OVH在肿瘤细胞上的复制效率 |
| 1.3 从实体瘤来源的肿瘤标本中分离培养原代肿瘤细胞 |
| 1.4 从腹水瘤来源的肿瘤标本中分离培养原代肿瘤细胞 |
| 1.5 溶瘤病毒OVH对原代肿瘤细胞具有显着的杀伤效果 |
| 1.6 溶瘤病毒OVH感染肿瘤细胞后诱导免疫原性细胞死亡 |
| 第二节 溶瘤病毒OVH动物肿瘤模型上的疗效评估和机制研究 |
| 2.1 溶瘤病毒OVH显着抑制免疫缺陷鼠皮下肿瘤的生长 |
| 2.2 溶瘤病毒OVH显着抑制免疫鼠皮下自体瘤的生长 |
| 2.3 溶瘤病毒OVH的体内抗肿瘤作用机制研究 |
| 第二部分 小结 |
| 第四章 讨论 |
| 第一节 溶瘤病毒研究面临的挑战 |
| 1.1 平衡溶瘤病毒的有效性和安全性 |
| 1.2 溶瘤病毒递送障碍、扩散障碍和免疫应答障碍 |
| 第二节 溶瘤病毒疗法未来发展方向 |
| 2.1 优化溶瘤病毒载体和递送策略 |
| 2.2 溶瘤病毒联合免疫检验点抑制剂治疗肿瘤 |
| 2.3 溶瘤病毒联合CAR-T治疗肿瘤 |
| 2.4 溶瘤病毒联合化疗药物治疗肿瘤 |
| 2.5 溶瘤病毒联合小分子靶向药物治疗肿瘤 |
| 2.6 溶瘤病毒作为手术前的新辅助治疗联合手术治疗肿瘤 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果 |
| 致谢 |
四、GM-CSF基因修饰的肿瘤细胞疫苗对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用（论文参考文献）
- [1]IL-33修饰的黑色素瘤干细胞疫苗抗肿瘤及免疫机制研究[D]. 尹起亮. 吉林大学, 2021
- [2]诱导型表达GSDMD-NT引起细胞焦亡的肿瘤细胞疫苗新策略[D]. 何金蓉. 昆明医科大学, 2021(01)
- [3]黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究[D]. 尹良伟. 大连医科大学, 2021(01)
- [4]转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用[D]. 涂丽裙. 吉林大学, 2020(03)
- [5]半细菌化类鼻疽杆菌载体制备LL/2肺癌疫苗及其抗肿瘤效应研究[D]. 徐泽. 海南医学院, 2020(01)
- [6]人参皂甙Rg3增强致敏DC诱导CTL影响小鼠肾癌细胞RAG的实验研究[D]. 袁佳蕾. 南昌大学, 2020(08)
- [7]柯萨奇病毒溶瘤作用和抗原检测试剂研究[D]. 崔博沛. 中国食品药品检定研究院, 2020(02)
- [8]溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒对小鼠结肠癌模型免疫状态及肿瘤微环境影响的研究[D]. 胡箫. 北京协和医学院, 2020
- [9]环境响应型自组装纳米药物及抗原-无机杂化微颗粒疫苗用于肿瘤免疫治疗的研究[D]. 刘怡佳. 北京协和医学院, 2020(05)
- [10]肿瘤靶向性新型溶瘤单纯疱疹病毒的理性设计及其抗肿瘤作用机制研究[D]. 罗勇. 厦门大学, 2019